孫麗，宮成玉，楊鵬，陳燕平，楊丙田，劉建華

(1.山東省淄博市中醫(yī)醫(yī)院，山東 淄博 2553003；2.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000；3.濟南三峰生物工程有限責(zé)任公司，山東 濟南 250014；4.山東省分析測試中心，山東 濟南 250014)

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豆豉姜中生物堿的pH區(qū)帶逆流色譜分離研究

孫麗1，宮成玉2，楊鵬3，陳燕平2，楊丙田3，劉建華4*

(1.山東省淄博市中醫(yī)醫(yī)院，山東 淄博 2553003；2.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000；3.濟南三峰生物工程有限責(zé)任公司，山東 濟南 250014；4.山東省分析測試中心，山東 濟南 250014)

摘要：建立pH區(qū)帶逆流色譜分離制備豆豉姜中生物堿的方法。運用pH區(qū)帶逆流色譜對豆豉姜中的生物堿進(jìn)行分離，以氯仿-甲醇-水(4:3:2，V/V)作為溶劑系統(tǒng)，在上相溶液中加入70 mmol/L鹽酸作為固定相，在下相溶液中加入10 mmol/L三乙胺作為流動相，儀器轉(zhuǎn)速為800 r/min，流速為2 mL/min，檢測波長為254 nm，固定相保留率為65%。經(jīng)一次pH區(qū)帶逆流色譜分離，從1.5 g豆豉姜粗提物中得到波爾定 246 mg，六駁堿 524 mg和異波爾定 317 mg。經(jīng)HPLC分析，其純度分別為97.35%，95.48%，97.54%。研究結(jié)果表明，pH區(qū)帶逆流色譜能對豆豉姜中的主要活性成分(阿樸啡型生物堿)進(jìn)行有效的分離制備。

關(guān)鍵詞：pH區(qū)帶逆流色譜；豆豉姜；生物堿類化合物

豆豉姜為樟科木姜子屬植物山雞椒(Litseacubeba(Lour．) Pers.) 的根及根莖，該藥性溫、味辛苦，具有祛風(fēng)散寒和理氣止痛之功效，主要用于治療風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、感冒、心胃冷痛以及腹痛吐瀉等癥[1]。民間常用于治療胃及十二指腸潰瘍、中暑腹痛、勞倦乏力以及產(chǎn)后瘀血腹痛等各種臨床病癥。豆豉姜作為珍珠胃安丸、云香祛風(fēng)止痛酊和正骨水等成方制劑的組成藥物[2]，主要含有生物堿、木脂素和揮發(fā)油，其中阿樸啡型生物堿被認(rèn)為是代表性活性成分[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，豆豉姜在抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、平喘、抗過敏和殺蟲等方面都有較好的效果。Lin等[3]的研究表明豆豉姜粗提物對弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠具有良好的治療效果。然而，豆豉姜的主要藥效物質(zhì)仍不明確，且良好的傳統(tǒng)用藥效果和臨床應(yīng)用也亟需建立相應(yīng)的質(zhì)量評價方法。因此，對豆豉姜的化學(xué)成分進(jìn)行研究是十分必要的。

pH區(qū)帶逆流色譜是由高速逆流色譜發(fā)展而來的用于有機酸和生物堿制備級分離的色譜技術(shù)，分離原理是化合物的pKa值和極性的差異[4-5]。除了常規(guī)逆流色譜的優(yōu)點外，pH區(qū)帶逆流色譜具有進(jìn)樣量大，組分被高度聚集濃縮，特別是對于沒有紫外吸收的樣品也可以通過pH連續(xù)檢測器進(jìn)行檢測等優(yōu)點[6-7]。該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于可解離化合物的分離，包括生物堿、有機酸、合成染料[8-10]以及多肽衍生物[11]等。

本研究運用pH區(qū)帶逆流色譜對豆豉姜中的阿樸啡型生物堿進(jìn)行了制備級分離，得到3個高純度化學(xué)成分波爾定、六駁堿和異波爾定(結(jié)構(gòu)式見圖1)。

圖1　豆豉姜中生物堿類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1　Chemical structure of alkaloids from Litsea cubeba

1實驗與方法

1.1試劑、儀器和材料

高效液相色譜用甲醇為色譜純(山東禹王實業(yè)有限公司)，水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。pH區(qū)帶逆流色譜溶劑系統(tǒng)用氯仿、甲醇、鹽酸和三乙胺等均為分析純級(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，水為去離子水。

TBE-300B高速逆流色譜儀(上海同田生物技術(shù)有限公司)，該分離系統(tǒng)包括多層聚四氟乙烯螺旋管(直徑2.6 mm，分離體積300 mL)、TBP5002泵、8823B紫外檢測器(北京賓達(dá)英創(chuàng)科技有限司)和3057-11記錄儀(重慶川儀總廠有限公司)。Waters 600-996高效液相色譜系統(tǒng)(配有光電二極管陣列檢測器，美國沃特世公司)。

豆豉姜藥材購于福建藥材市場，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為樟科木姜子屬植物山雞椒的正品藥材。

1.2生物堿粗提物的制備

6.5 kg豆豉姜藥材，粉碎后用95%乙醇按體積比1：8混合，加熱回流提取3次，每次提取2 h。過濾并合并提取液，減壓回收乙醇得到總提取物。將總提取物用約1 000 mL 0.2%鹽酸水溶液復(fù)溶，分別用等體積的石油醚和氯仿萃取3次，除去脂溶性雜質(zhì)。再用氨水調(diào)節(jié)水層pH值至10，用等體積的氯仿萃取3次，合并氯仿層，減壓回收氯仿得生物堿粗提物約6.5 g，用于pH區(qū)帶逆流色譜分離，粗提物的HPLC分析結(jié)果如圖2a所示。

1.3pH區(qū)帶逆流色譜溶劑系統(tǒng)和樣品溶液的制備

pH區(qū)帶逆流色譜的溶劑系統(tǒng)為氯仿-甲醇-水(4:3:2,V/V)，總體積為2 L，按比例將各溶劑置于分液漏斗中震蕩后，充分靜置使其分層。使用時分取上下相，在上相溶液中加入70 mmol/L鹽酸作為固定相，在下相溶液中加入10 mmol/L 三乙胺作為流動相，超聲10 min，除去氣泡待用。

取1.5 g豆豉姜生物堿粗提物，加入上下相溶液各10 mL超聲溶解樣品，其中上相溶液加入了70 mmol/L 鹽酸，下相溶液未加入三乙胺，溶解后的溶液作為樣品溶液進(jìn)行pH區(qū)帶逆流色譜分離。

1.4分離、分析與鑒定

1.4.1pH區(qū)帶逆流色譜分離

上相 (固定相)溶液以15 mL/min的流速泵入高速逆流色譜儀，待出口有固定相流出(約50 mL)時，將上述樣品溶液從定量圈注入到高速逆流色譜儀中，然后啟動儀器，將轉(zhuǎn)速設(shè)定為800 r/min，待轉(zhuǎn)速達(dá)到并穩(wěn)定后，以2 mL/min的流速泵入下相 (流動相)溶液，同時開啟檢測器和記錄儀，檢測器的檢測波長設(shè)定為254 nm，手動收集餾分，平均每3 min的流出液收集到一個試管中，直到分離結(jié)束，用壓縮空氣吹出螺旋管中剩余的液體，并計算出固定相的保留率。

1.4.2HPLC分析與化合物結(jié)構(gòu)鑒定

豆豉姜生物堿粗提物以及經(jīng)pH區(qū)帶逆流色譜分離得到的組分均經(jīng)HPLC進(jìn)行分析。色譜柱型號為RIGOL-Compass C18(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；檢測波長設(shè)定為310 nm；流動相為甲醇(A)-0.2%氨水(B)梯度洗脫：0～20 min, 40%～70% (A); 20～21 min, 70%～100% (A); 21～30 min, 100% (A)；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。pH區(qū)帶逆流色譜所分得各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)由1H-NMR，13C-NMR和ESI-MS所提供的數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定。

2結(jié)果和討論

2.1HPLC條件優(yōu)化

本研究探討了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%氨水和乙腈-水(0.2%三乙胺)等作流動相時，豆豉姜生物堿粗提物中各成分的分離效果。經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用甲醇-0.2%氨水梯度洗脫：0～20 min, 40%～70% (A); 20～21 min, 70%～100% (A); 21～30 min, 100% (A)；流速設(shè)定為1.0 mL/min時，各成分能夠?qū)崿F(xiàn)基線分離，分析結(jié)果如圖2a所示。

圖2　豆豉姜粗提物和分離得到生物堿純組分的HPLC分析圖Fig.2　HPLC chromatograms of crude extract and separated alkaloids from Litsea cubeba

2.2pH區(qū)帶逆流色譜溶劑系統(tǒng)優(yōu)化

pH區(qū)帶逆流色譜溶劑系統(tǒng)的選擇不僅要求能夠提供合適的KD值，而且要求對樣品有較好的溶解性[5]。根據(jù)豆豉姜化學(xué)成分的理化性質(zhì)，本研究選擇氯仿-甲醇-水作為溶劑系統(tǒng)。我們考察了如下幾個溶劑系統(tǒng)：氯仿-甲醇-水(4:2:2,V/V)上相溶液加入10 mmol/L鹽酸，下相溶液加入10 mmol/L 三乙胺；氯仿-甲醇-水(4:3:2,V/V)上相溶液加入10 mmol/L 鹽酸，下相溶液加入10 mmol/L三乙胺；氯仿-甲醇-水(4:3:3,V/V)上相溶液加入10 mmol/L 鹽酸，下相溶液加入10 mmol/L三乙胺。經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)，溶劑系統(tǒng)氯仿-甲醇-水(4:3:2,V/V)上相溶液加入10 mmol/L 鹽酸，下相溶液加入10 mmol/L 三乙胺能夠提供較為合適的KD值。但在具體實驗過程中，該溶劑系統(tǒng)并沒有給出較好的分離效果，而是在較短的時間內(nèi)將所有成分洗脫出來，這說明各成分的保留值太小，沒有較好的分離度，所以要增大各成分的保留值。有文獻(xiàn)報道[12]，增加上相溶液中保留酸的濃度可以增大各成分的保留值，從而可以避免各成分在較短的時間內(nèi)被洗脫出來的現(xiàn)象。因此，我們將上相溶液中鹽酸的濃度增加到30 mmol/L，測試后發(fā)現(xiàn)分離效果有一定的改善，但仍然不理想。我們繼續(xù)增加保留酸的濃度，當(dāng)鹽酸濃度增加到70 mmol/L時，各成分實現(xiàn)了完全分離。從1.5 g豆豉姜粗提物中，經(jīng)一次pH區(qū)帶逆流色譜分離，得到波爾定 (I) 246 mg，六駁堿 (II) 524 mg和異波爾定 (III)317 mg，分離效果如圖3所示。

圖3　豆豉姜粗提物的pH區(qū)帶逆流色譜圖Fig.3　pH-zone-refining CCC chromatogram of crude extract 　from Litsea cubeba

2.3化合物的純度檢測

利用2.1中優(yōu)化好的液相色譜條件對分得的各組分(波爾定，六駁堿和異波爾定)進(jìn)行檢測，純度分別為97.35%, 95.48%和97.54%，分析結(jié)果如圖2b～d所示。

2.4化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物I (圖2a中的峰I): ESI-MS,m/z328 [M+H]+;1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δppm: 7.85 (1H, s, H-11), 6.76 (1H, s, H-8), 6.57 (1H, s, H-3), 3.74 (3H, s, 10-OCH3), 3.52 (3H, s, 1-OCH3), 3.22 (1H, m, He-7), 3.03 (1H, m, He-5), 3.02 (1H, m, He-4), 2.71 (1H, m, H-6a), 2.63 (1H, m, Ha-5), 2.61 (3H, s,N-CH3), 2.53 (2H, m, Ha-4,Ha-7);13C NMR (DMSO-d6,400 MHz) δ ppm:143.47 (C-1), 126.85 (C-1a), 126.85 (C-1b), 150.36 (C-2), 114.63 (C-3), 127.88 (C-3a), 27.17 (C-4), 52.12 (C-5), 62.04 (C-6a), 32.46 (C-7), 128.63 (C-7a), 115.83 (C-8), 146.55 (C-9), 146.79 (C-10), 112.47 (C-11), 122.94 (C-11a), 42.36 (N-CH3), 59.71 (1-OCH3), 56.13 (10-OCH3)。以上數(shù)值與文獻(xiàn)[13]報道的基本一致，化合物I被確定為波爾定。

化合物II (圖2a中的峰II): ESI-MS,m/z328 [M+H]+;1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ ppm: 7.88 (1H, s, H-11), 6.74 (1H, s, H-8), 6.74 (1H,s, H-3), 3.81 (3H, s, 10-OCH3), 3.77 (3H, s, 2-OCH3), 3.75 (1H, m, H-6a), 3.63 (3H, s, 1-OCH3), 3.27 (1H, d,J=4.0 Hz,He-5),2.91 (2H, m, Ha-5,He-4), 2.67(2H, m, Ha-4,He-7), 2.55 (1H, m, Ha-7);13C NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δppm:144.18 (C-1), 126.80 (C-1a), 126.46 (C-1b), 152.33 (C-2), 111.58 (C-3), 129.09 (C-3a), 28.25 (C-4), 42.14 (C-5), 53.30 (C-6a), 35.43 (C-7), 129.49 (C-7a), 115.55 (C-8), 146.54 (C-9), 146.64 (C-10), 112.85 (C-11), 122.93 (C-11a), 59.93 (1-OCH3), 56.17 (2-OCH3), 56.13 (10-OCH3)。以上數(shù)值與文獻(xiàn)[14]報道的基本一致，化合物II被確定為六駁堿。

化合物III(圖2a中的峰III) : ESI-MS,m/z328 [M+H]+;1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δppm:7.95 (1H, s, H-11), 6.72 (1H, s, H-8), 6.60 (1H, s, H-3), 3.75 (3H, s, 2-OCH3), 3.75 (3H, s, 10-OCH3), 2.94 (4H, m, He-7, He-4, He-5, H-6a), 2.57 (1H, m, Ha-4), 2.43 (3H, s,N-CH3), 2.32 (2H, m, Ha-5, Ha-7);13C NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δppm:141.42 (C-1), 120.43 (C-1a), 123.43 (C-1b), 147.25 (C-2), 109.85 (C-3), 126.74 (C-3a), 28.69 (C-4), 53.36 (C-5), 62.83 (C-6a), 33.94 (C-7), 129.49 (C-7a), 115.56 (C-8), 145.88 (C-9), 146.01 (C-10), 114.25 (C-11), 124.07 (C-11a), 43.85 (N-CH3), 56.38 (2-OCH3), 56.51 (10-OCH3)。以上數(shù)值與文獻(xiàn)[15]報道的基本一致，化合物III被確定為異波爾定。

3結(jié)語

本文報道了應(yīng)用pH區(qū)帶逆流色譜技術(shù)從豆豉姜中分離出阿樸啡型生物堿波爾定、六駁堿和異波爾定。此類化合物的極性較小，從而導(dǎo)致各成分的保留值較低，本研究通過增加固定相中保留酸的濃度的方法來增加各成分的保留值，從而實現(xiàn)了pH區(qū)帶逆流色譜對豆豉姜中主要化學(xué)成分的有效分離。本研究建立了一種豆豉姜化學(xué)成分快速、高效制備分離的方法，為建立豆豉姜的科學(xué)質(zhì)量評價方法和闡明藥效物質(zhì)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和科學(xué)的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]張水英, 郭強, 高小力，等.樟科藥用植物山雞椒的化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展 [J].中國中藥雜志, 2014, 39( 5): 769-776.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版一部[M].北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010.

[3]LIN B，ZHANG H，ZHAO X X, et al.Inhibitory effects of the root extract ofLitseacubeba(Lour.) Pers.on adjuvant arthritis in rats [J].J Ethnopharmacol, 2013, 147( 2): 327-334.

[4]ITO Y, MA Y.pH-zone-refining countercurrent chromatography [J].J Chromatogr A, 1996, 753(1):1-36.

[5]ITO Y.Golden rules and pitfalls in selecting optimum conditions for high-speed counter-current chromatography [J].J Chromatogr A, 2005, 1065( 2): 145-168.

[6]ITO Y.pH-zone-refining counter-current chromatography: Origin, mechanism, procedure and applications [J].J Chromatogr A, 2013, 1271(1): 71-85.

[7]PAN Y J, LU Y B.Recent progress in countercurrent chromatography [J].J Chromatogr Relat Technol, 2007, 30(5/6/7/8): 649-679.

[8]YU Q, TONG S Q, YAN J Z, et al.Preparative separation of quaternary ammonium alkaloids from Corydalis yanhusuo W.T.Wang by pH-zone-refining counter-current chromatography [J].J Sep Sci, 2011, 34(3): 278-285.

[9]WANG X, LIU J H, GENG Y L, et al.Preparative separation of alkaloids from Nelumbo nucifera Gaertn by pH-zone refining counter-current chromatography [J].J Sep Sci, 2010, 33(4/5): 539-544.

[10]WEISZ A, MAZZOLA E P, ITO Y.Preparative separation of 1, 3, 6-pyrenetrisulfonic acid trisodium salt from the color additive D&C Green No.8 (pyranine) by pH-zone-refining counter-current chromatography [J].J Chromatogr A, 2011, 1218(45): 8249-8254.

[11]MA Y, ITO Y.Peptide separation by pH-zone-refining countercurrent chromatography [J].J Chromatogr A, 1997, 771(1/2): 81-88.

[12]SUN C L, LI J, WANG X, et al.Preparative separation of quaternary ammonium alkaloids from Coptis chinensis Franch by pH-zone-refining counter-current chromatography [J].J Chromatogr A, 2014, 1370: 156-161.

[13]嚴(yán)小紅, 魏孝義, 謝海輝, 等.豺皮樟和圓葉豺皮樟中的阿樸啡生物堿成分 [J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報, 2000, 8(4): 324-328.

[14]曲郁虹, 姜明, 王玲燕, 等.華南木姜子的阿樸菲型生物堿成分 [J].中國中藥雜志, 2015, 40 (1): 94-97.

[15]張水英, 郭強, 曹愿, 等.豆豉姜的生物堿類成分研究[J].中國中藥雜志, 2014, 39 (20): 3964-3968.

【中藥與天然活性產(chǎn)物】

Separation and purification of alkaloids fromLitseacubeba(Lour．)Pers.

by pH-zone-refining counter-current chromatography

SUN Li1,GONG Cheng-yu2,YANG Peng3, CHEN Yan-ping2,YANG Bing-tian3,LIU Jian-hua4*

(1.Zibo Municipal Traditional Chinese Medicine Hospital, Zibo 255300, China;2.Yantai Entry-exit Inspection

and Quarantine Bureau, Yantai 264000, China;3.Sanfeng Biological Engineering Technology Co.Ltd.,

Jinan 250014, China;4.Shandong Analysis and Test Center, Jinan 250014，China)

Abstract∶We construct a method for separating and purifying alkaloids from Litsea cubeba(Lour．) Pers.by pH-zone-refining counter-current chromatography (CCC).Our experimental conditions are solvent of chloroform-methanol-water(4:3:2,V/V),upper stationary phase of 70 mmol/L HCl, lower mobile phase of 10 mmol/L TEA, revolution speed of 800 r/min, flow rate of 2 mL/min, detection wavelength of 254 nm, and stationary phase retention rate of 65%.We acquire 246 mg of boldine, 524 mg of laurotetanine and 317 mg of isoboldine from 1.5 g crude extract of Litsea cubeba(Lour．) Pers.through one time pH-zone-refining CCC.Their purities are 97.35%, 95.48% and 97.54% by HPLC analysis.Results show that pH-zone-refining CCC can effectively separate and prepare major active components of Litsea cubeba(Lour．) Pers.,aporphine alkaloids.

Key words∶pH-zone-refining counter-current chromatography; Litsea cubeba(Lour．) Pers.; alkaloids

中圖分類號：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-4026(2015)04-0041-05

通訊作者*，劉建華，男，研究方向為精密分析。Email: liujh@sdas.org

作者簡介：孫麗(1964-)，女，研究方向為藥事管理和中醫(yī)藥預(yù)防保健。

收稿日期：2015-07-01

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2015.04.008