齊君，夏雪奎，賈愛榮，劉新，張綿松，劉昌衡

(1.山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心，山東省應(yīng)用微生物重點實驗室，山東 濟南 250014；2. 山東省科學(xué)院生物研究所，山東 濟南 250014)

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二維高通量色譜分離制備海參來源真菌Epicoccumsp.的化學(xué)成分

齊君1，夏雪奎1，賈愛榮2，劉新2，張綿松1，劉昌衡2

(1.山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心，山東省應(yīng)用微生物重點實驗室，山東 濟南 250014；2. 山東省科學(xué)院生物研究所，山東 濟南 250014)

摘要：建立了二維高通量色譜分離、純化海參來源真菌Epicoccum sp.中的海松烷二萜化合物的新方法。以甲醇-水為溶劑體系梯度洗脫，在流速為40 mL/min、主分離檢測波長為254 nm，二級分離檢測波長為220 nm的條件下進行分離，從1.5 g海參來源真菌Epicoccum sp.乙酸乙酯提取物中分離制備得到海松烷二萜化合物，通過核磁共振氫譜和質(zhì)譜鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。該方法簡便、快捷且減少樣品的不可逆吸附，為海松烷二萜化合物的制備型分離提供了新手段。

關(guān)鍵詞：二維高通量分離制備色譜；海參來源真菌；海松烷二萜化合物

Separation and preparation of chemical components from sea

海參屬于海洋低等無脊椎動物中的棘皮動物，含有海參黏多糖、海參皂苷和多肽等活性成分，具有提高機體免疫力、抗衰老以及抗腫瘤等多種生理功能[1-3]。海參具有豐富的共附生微生物，其共附生真菌可以代謝結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣的次級代謝產(chǎn)物，近年來成為海洋活性天然產(chǎn)物研究的熱點之一[4-8]。最近，從海參真菌中已分離到了二萜、大環(huán)內(nèi)酯和環(huán)己醇類似物等類型的化合物[9-11]，這些結(jié)構(gòu)新穎的化合物多具有抗菌和細(xì)胞毒活性。其中海松烷二萜具有明顯的細(xì)胞毒活性[9]，是具有重要生物活性和藥用前景的海洋天然產(chǎn)物。

目前海洋微生物次級代謝產(chǎn)物的分離、純化方法主要是柱色譜法，如硅膠柱色譜、凝膠柱色譜和高效液相色譜等方法[12-13]，但這些方法存在耗時長、溶劑消耗大、容易造成樣品的不可逆吸附及樣品回收率低等缺點。對于活性次級代謝產(chǎn)物的制備，利用傳統(tǒng)分離方法，不能對其進行快速有效的分離。

二維高通量分離制備色譜技術(shù)是一種由高效液相色譜(HPLC)和固相萃取(SPE)精密串接的高通量分離制備色譜技術(shù)，適合復(fù)雜化合物的制備分離和純化。該技術(shù)經(jīng)優(yōu)化后，通過 HPLC / SPE / HPLC 全自動串接，可以將一個復(fù)雜樣品在 24 h內(nèi)得到完全分離，耗時短，減少了溶劑消耗以及固定相對樣品的不可逆吸附。本研究采用二維高通量分離制備色譜技術(shù)從海參來源真菌Epicoccumsp.中分離獲得2個海松烷二萜化合物(結(jié)構(gòu)式見圖1)，建立了一種快捷、簡單的海松烷二萜化合物制備方法，為海洋微生物次級代謝產(chǎn)物的分離和純化提供參考。

圖1　海松烷二萜化合物1和2的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1　Chemical structures of pimaranediterpenes1 and 2

1材料與實驗方法

1.1儀器與試劑

二維高通量分離制備色譜系統(tǒng)Sepbox 2D-2000，包括2個制備HPLC泵、1根進樣柱、1根主分離柱、3根二次分離柱、15根捕獲柱、1個紫外檢測器(力揚企業(yè)有限公司)；Waters 高效液相色譜系統(tǒng)(美國沃特世公司)；賽多利斯電子天平Balance BSA124S-CW(德國賽多利斯集團)。

菌株Epicoccumsp. 分離自煙臺芝罘島海域仿刺參，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。所得序列在 Genebank 中用 Blast 進行相似性分析，用Clustal 進行排列比較，確定該菌株為Epicoccumsp.。

用于制備海參來源真菌Epicoccumsp. 提取物的試劑為分析純乙酸乙酯；二維高通量分離制備色譜和高效液相色譜系統(tǒng)所用甲醇為色譜純(賽默飛世爾科技有限公司)，水為娃哈哈純凈水。

1.2海參來源真菌Epicoccumsp. 提取物的制備

1.2.1菌株的分離、發(fā)酵

將海參利用無菌水清洗 3 次，切成小塊(1 cm×0.5 cm)，-20 ℃速凍，打漿，在 PDA 培養(yǎng)基(80 mg/L，硫酸鏈霉素)涂布，28 ℃培養(yǎng) 20 d。該菌株保存于山東省科學(xué)院生物研究所食品生物技術(shù)研究室。利用液體培養(yǎng)基(土豆/海水0.2 g/mL，葡萄糖/海水0.02 g/mL)，室溫下?lián)u床培養(yǎng)5 d，轉(zhuǎn)速170 r/min，制備種子培養(yǎng)基。利用大米固體培養(yǎng)基(大米/海水0.6 g/mL，121 ℃，20 min 高溫滅菌)培養(yǎng)15瓶，在室溫下靜置培養(yǎng) 28 d。

1.2.2乙酸乙酯提取物的制備

發(fā)酵28 d后，利用 3 倍體積的乙酸乙酯浸泡提取大米培養(yǎng)基發(fā)酵物，室溫下連續(xù)萃取 3 次，合并萃取液后減壓濃縮得到乙酸乙酯相浸膏 (1.5 g)。

1.3二維高通量色譜分離制備的過程

1.3.1樣品的分析

將真菌提取物用色譜甲醇溶解，0.45 μL微孔濾膜過濾，待用。應(yīng)用Waters 高效液相色譜系統(tǒng)進行分析，色譜柱：YMC(250 × 10 mm)。流動相：A為水，B為甲醇。流速：0.8 mL/min。檢測波長：190～400 nm。柱溫：25 ℃。進樣量20 μL。按照以下梯度洗脫程序進行分析，洗脫程序：0～5 min，5%B；5～45 min，5%B～100%B；45～55 min，100%B；55～60 min，100%B～5%B。

1.3.2樣品的制備

打開二維高通量分離制備色譜系統(tǒng)Sepbox 2D-2000，用100%色譜甲醇以40 mL/min的流速沖洗整個系統(tǒng)，然后用100% 水以28～40 mL/min的梯度流速平衡系統(tǒng)，待平衡完畢打開紫外檢測器。

稱取1.5 g真菌提取物用有機溶劑溶解，然后與4.5 g C4反相硅膠混合拌樣，干燥后，裝入進樣柱，準(zhǔn)備進樣。經(jīng)分析后，應(yīng)用儀器的原默認(rèn)方法(表1)即可對樣品進行分離純化。主分離檢測波長為254 nm，二級分離檢測波長為220 nm。

2結(jié)果與討論

2.1樣品的分析

考察了真菌Epicoccumsp.乙酸乙酯提取物在不同波長(190～400 nm)下的色譜圖，在254 nm時，其HPLC色譜圖色譜峰較多、強度較高且分離度好，因此本研究選擇254 nm用于HPLC分析的檢測波長，見圖2。

圖2　樣品在檢測波長254 nm下的HPLC色譜圖Fig.2　HPLC chromatogram of crude extract of Epicoccum sp.in 254 nmdetection wavelength

2.2樣品的制備

根據(jù)樣品的分析結(jié)果，應(yīng)用儀器的原默認(rèn)方法即可對樣品進行分離純化。主分離檢測波長為254 nm。主分離洗脫條件如表1。樣品通過主分離，分別被15根捕獲柱捕獲，待二次分離。主分離結(jié)果見圖3。

表1　二維高通量分離制備色譜系統(tǒng)Sepbox 2D-2000的主分離洗脫條件

圖3　二維高通量分離制備色譜系統(tǒng)對樣品的主分離結(jié)果Fig.3　Main separation results of samples with two-dimensional high-throughput chromatography

接下來二維高通量分離制備色譜系統(tǒng)分別對15根捕獲柱中的樣品進行二級分離。二級分離檢測波長為220 nm。經(jīng)過24 h的完全分離，結(jié)果得到化合物1和化合物2。兩個化合物的二級分離結(jié)果如圖4。

圖4　二維高通量分離制備色譜系統(tǒng)對樣品的二級分離結(jié)果Fig.4　Second-stage separation results of samples with two-dimensional high-throughput chromatography

2.3化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色晶體，熔點：195～200 ℃，IR (KBr) νmax3 395,2 926,1 701,1 628 cm-1; 1H (CDCl3, 600 MHz)δ: 6.98 (1H, s, H-14), 5.84 (1H, dd,J=17.4, 9.0 Hz, H-15), 5.05 (1H, d,J=10.2 Hz, H-16a), 5.10 (1H, d,J=10.2 Hz, H-16b), 4.18 (1H, dd,J= 9.6, 1.8 Hz, H-20a), 3.91 (1H, d,J= 9.6 Hz,H-20b),3.75 (1H, s, H-9), 2.50 (1H, dd,J=15.0, 1.8 Hz, H-1a), 2.28 (1H, d,J= 13.2 Hz, H-12a ), 2.25 (1H, d,J= 13.2 Hz, H-12b ), 1.56 (1H, m, H-3b), 1.51 (2H, m, H-2), 1.40 (3H, s, H-19), 1.32 (1H, ddd,J=13.8, 4.8, 4.8 Hz, H-1b), 1.24 (1H, m, H-3a), 1.24 (3H, s, H-18), 1.19 (3H, s, H-17)。HRTOFMS:m/z347.185 3 [M + H]+。以上數(shù)據(jù)和文獻報導(dǎo)的基本一致[9]，確定化合物1為Aspergilone A。

化合物2：無色晶體，熔點：197～218 ℃，IR (KBr) νmax3 418,2 927,1 703,1 624,1 392 cm-1; 1H (DMSO-d6, 600 MHz)δ: 6.81 (1H, s, H-14), 5.86 (1H, dd,J= 18.0, 10.2 Hz, H-15), 5.04 (2H, m, H-16), 4.05 (1H, m, H-11), 3.98 (1H, d,J=10.2 Hz, H-20b), 3.62 (1H,d,J=10.2 Hz, H-20a), 1.96 (1H, m, H-12b), 1.93 (1H, m, H-1b), 1.82 (1H, m, H-1a), 1.61 (1H, m, H-12a), 1.49 (1H, m, H-2b), 1.47 (1H, m, H-2a), 1.42 (1H, m, H-3b), 1.32 (3H, s, H-19), 1.17 (3H, s, H-17), 1.06 (3H, s, H-18), 1.00 (1H, m, H-3a)。HRESIMS:m/z387.178 9[M + H]+。以上數(shù)據(jù)和文獻報導(dǎo)的基本一致[14]，確定化合物2為Diaporthein B。

3結(jié)論

本研究運用二維高通量分離制備色譜技術(shù)從海參來源真菌Epicoccumsp. 的乙酸乙酯提取物中成功分離獲得2個海松烷二萜化合物。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)分離技術(shù)相比，二維高通量分離制備色譜技術(shù)通過高效液相色譜和固相萃取有效結(jié)合，顯著提高了天然產(chǎn)物純化過程的速度，是分析、分離復(fù)雜組分物質(zhì)的有效方法，能快速、高效地將微生物發(fā)酵液中的成分分離成純化合物。本研究不僅為海松烷二萜化合物的分離制備提供了一種新型、實用的方法，而且為海洋微生物次級代謝產(chǎn)物的分離純化提供了新的方法和思路。

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【中藥與天然活性產(chǎn)物】

cucumber-derived fungusEpicoccumsp.by two-dimensional

high-throughput chromatography

QI Jun1,XIA Xue-kui1,JIA Ai-rong2,LIU Xin2,ZHANG Mian-song1,LIU Chang-heng2*

(1.Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Biotechnology Center, Shandong Academy

of Sciences, Jinan 250014, China；2.Biology Institute, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

Abstract∶We established a new method for separation and preparation of pimarane diterpenes from sea cucumber-derived fungus Epicoccum sp.by two-dimensional high-throughput chromatography.It was performed with MeOH-H2O as solvent, flow rate of 40 mL/min, main separation detection wavelength of 254 nm and second separation detection wavelength of 220 nm.Pimarane diterpenes were isolated from 1.5 g ethyl acetate extract fromsea cucumber-derived fungus Epicoccum sp.Their structureswere identified by spectroscopic data (1H NMR and MS).The method is simple and rapid, reduces irreversible sample adsorption,and provides a new approach for separation and preparation of pimarane diterpenes.

Key words∶two-dimensional high-throughput chromatography; sea cucumber-derived fungus; pimarane diterpenes

中圖分類號：R284.2

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-4026(2015)04-0014-05

作者簡介：齊君(1985-)，女，博士，助理研究員，研究方向為海洋天然產(chǎn)物。Email: qljbgreat@163.com

基金項目：山東省科學(xué)院科學(xué)技術(shù)發(fā)展計劃 (2014QN018)；國家自然科學(xué)基金 (81202452)；中韓國際合作交流項目 (81411140251)

收稿日期：2015-03-25

DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2015.04.003 10.3976/j.issn.1002-4026.2015.04.005