張從艷，鄭志遠(yuǎn) ，修明文 ，劉維

(1中國(guó)石油中心醫(yī)院，河北廊坊065000；2廊坊市人民醫(yī)院；3天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院)

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青壯年期2型糖尿病腎病大鼠骨形態(tài)變化及機(jī)制探討

張從艷1，鄭志遠(yuǎn)2，修明文2，劉維3

(1中國(guó)石油中心醫(yī)院，河北廊坊065000；2廊坊市人民醫(yī)院；3天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院)

摘要：目的觀察青壯年期2型糖尿病腎病大鼠骨形態(tài)變化，并探討其發(fā)生機(jī)制。方法將52只2月齡SD雄性大鼠隨機(jī)分為觀察組33只和對(duì)照組19只。觀察組制備2型糖尿病腎病模型，造模成功后分別于5、6月齡時(shí)處死大鼠。分離各組左側(cè)脛骨近端1/3行骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析，測(cè)量各組左側(cè)股骨骨密度，留取血尿標(biāo)本檢測(cè)血鈣、磷、堿性磷酸酶和24 h尿鈣、磷。結(jié)果 鏡下可見(jiàn)對(duì)照組骨小梁排列密集，厚度較寬，間距小。 觀察組5月齡骨小梁排列稀疏，骨小梁厚度變窄，間距加寬；6月齡骨小梁排列更稀疏，厚度更窄，間距更寬。觀察組骨小梁面積百分?jǐn)?shù)(Tb.Ar)、骨小梁寬度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)均低于對(duì)照組，骨小梁數(shù)(Tb.N)多于對(duì)照組，P均<0.05；觀察組5月齡Tb.Ar、Tb.Th、Tb.Sp均高于6月齡，Tb.N少于6月齡，P均<0.05。觀察組5月齡、6月齡及對(duì)照組的骨密度分別為172.50±4.96、172.74±4.63、187.79±3.90，P均<0.05。觀察組血堿性磷酸酶、尿鈣水平均高于對(duì)照組，P<0.05。結(jié)論青壯年期2型糖尿病腎病大鼠骨小梁減少、骨密度下降，可能與血液中堿性磷酸酶、尿鈣升高有關(guān)。

關(guān)鍵詞：2型糖尿??；糖尿病腎??；骨小梁；骨密度；骨形態(tài)計(jì)量學(xué)

骨質(zhì)疏松是以骨量減少及骨微結(jié)構(gòu)退行性變?yōu)樘卣鞯囊环N全身性骨骼疾病，是一種代謝性骨病，老年人群發(fā)病率較高，女性發(fā)病率高于男性。近年研究發(fā)現(xiàn)，老年糖尿病腎病患者骨質(zhì)疏松發(fā)生率明顯高于健康人群。但是，關(guān)于青壯年糖尿病患者骨質(zhì)疏松發(fā)生情況的報(bào)道少見(jiàn)。2014年3～11月，我們觀察了青壯年期糖尿病腎病大鼠的骨形態(tài)變化，并探討其發(fā)生機(jī)制，旨在為骨質(zhì)疏松的預(yù)防提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料2月齡清潔級(jí)雄性SD大鼠52只，體質(zhì)量200～250 g,由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。VITALAB-micro半自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)，Prodigy型DEXA骨密度儀(美國(guó)Lunar公司)，0.5%Villaneuva骨染色劑(美國(guó)BD公司)，POLYCUT硬質(zhì)骨切片機(jī)(德國(guó))。

1.2動(dòng)物分組及模型建立將52只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組19只和觀察組33只，觀察組采用單側(cè)腎切除術(shù)+高糖高脂飲食飼養(yǎng)4周+一次性腹腔注射鏈脲佐菌素30 mg/kg方法制作2型糖尿病腎病模型，注射后1周測(cè)得尾尖隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L及24 h尿白蛋白顯著升高則判為造模成功。對(duì)照組采用假手術(shù)+基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)4周+0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液3 mL腹腔注射。觀察組造模成功后繼續(xù)采用高糖高脂飲食飼養(yǎng)，分別于大鼠5、6月齡時(shí)處死17、16只；對(duì)照組大鼠于飼養(yǎng)至5月齡時(shí)處死大鼠。處死各組大鼠前，留取24 h尿；均采用股動(dòng)脈放血處死，留取血液標(biāo)本，分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?；分離左側(cè)脛骨近端1/3置于70%乙醇中固定；分離左側(cè)股骨，用生理鹽水浸透紗布包裹，-80 ℃保存。

1.3骨形態(tài)觀察取左側(cè)脛骨近端1/3標(biāo)本，去除軟組織，暴露骨髓腔；骨染色劑染色4 d，脫水脫脂,包埋標(biāo)本;干燥1周后切成20 μm切片，光學(xué)樹(shù)脂封膠片。將骨切片置于Olympus光學(xué)顯微鏡下，觀察骨小梁排列情況。用Kontroniba2.0全自動(dòng)圖像處理系統(tǒng)測(cè)量干骺端骨松質(zhì)的4個(gè)靜態(tài)指標(biāo)：骨小梁面積百分?jǐn)?shù)(Tb.Ar)、骨小梁寬度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)(Tb.N)及骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.4骨密度測(cè)定采用骨密度儀聯(lián)合小動(dòng)物測(cè)量軟件測(cè)定各組股骨骨密度。

1.5血清鈣、磷、堿性磷酸酶及尿鈣、尿磷水平測(cè)定取24 h尿及血清，應(yīng)用VITALAB-micro半自動(dòng)生化分析儀，采用鄰甲酚酞絡(luò)合銅比色法檢測(cè)血鈣及尿鈣水平，紫外終點(diǎn)法檢測(cè)血磷及尿磷水平，連續(xù)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)血堿性磷酸酶。

2結(jié)果

2.1各組骨組織形態(tài)學(xué)比較鏡下可見(jiàn)對(duì)照組骨小梁排列密集，厚度較寬，間距小。 觀察組5月齡骨小梁排列稀疏，骨小梁厚度變窄，間距加寬;6月齡骨小梁排列更稀疏，厚度更窄，間距更寬。兩組Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp比較見(jiàn)表1。

表1　兩組Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp比較±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與觀察組5月齡比較，#P<0.05。

2.2各組骨密度比較觀察組5月齡、6月齡及對(duì)照組的骨密度分別為172.50±4.96、172.74±4.63、187.79±3.90， 5月齡、6月齡骨密度均高于對(duì)照組，P均<0.05。

2.3各組血清鈣、磷、堿性磷酸酶及尿鈣、尿磷水平比較見(jiàn)表2。

表2　各組血尿鈣、磷及血清堿性磷酸酶水平比較±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。 3討論

骨密度是骨代謝關(guān)鍵指標(biāo)之一，尤其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，骨密度快速準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)骨代謝的判斷有重要意義，可準(zhǔn)確反映骨代謝情況[1,2]。大鼠的骨重建周期為30～40 d，本實(shí)驗(yàn)選擇5月齡和6月齡分別處死大鼠，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。本研究中，模型組5月齡處死者骨量明顯低于對(duì)照組，骨顯微結(jié)構(gòu)有較大改變，小梁骨所占比例下降，排列稀疏不規(guī)整，厚度變窄，間隙增大。而正常大鼠一般10個(gè)月才能達(dá)到峰值骨量，糖尿病腎病大鼠骨代謝受損嚴(yán)重[3,4]。6月齡組較5月齡組，骨密度有所下降但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但骨顯微結(jié)構(gòu)有進(jìn)一步變化，骨小梁比例下降，厚度變窄，間隙變寬。表明隨糖尿病腎病病程進(jìn)展，骨質(zhì)惡化明顯。

糖尿病腎病時(shí)機(jī)體常因高血糖、高血脂、低胰島素血癥、促炎因子釋放、高滲性尿鈣流失等因素引起骨代謝改變、骨密度降低、骨量丟失[5～8]。腎小管病變可導(dǎo)致1-α羥化酶功能受損[1,2]，1-25(OH)2D3嚴(yán)重缺乏，影響腸道鈣磷吸收和腎小管對(duì)鈣的重吸收，導(dǎo)致機(jī)體負(fù)鈣平衡，為維持正常血鈣濃度，骨吸收加速動(dòng)員骨庫(kù)鈣儲(chǔ)備，使骨量降低。本研究中各組間血鈣磷水平比較無(wú)明顯差異，觀察組血堿性磷酸酶明顯高于對(duì)照組，尿鈣水平高于對(duì)照組。有研究發(fā)現(xiàn)腎臟病變時(shí)近曲腎小管大面積空泡變性、糖原累積，可導(dǎo)致1-25(OH)2D3嚴(yán)重缺乏[9,10]，出現(xiàn)高滲性利尿，鈣鹽大量丟失，腎小管重吸收鈣功能受損，機(jī)體呈負(fù)鈣平衡，為維持正常血鈣，骨形成大幅增加，破骨活躍，導(dǎo)致堿性磷酸酶水平升高。

綜上所述，青壯年期2型糖尿病腎病大鼠骨密度降低，骨量丟失明顯，可能與尿鈣及血清堿性磷酸酶水平升高有關(guān)。

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收稿日期：(2015-08-11)

中圖分類(lèi)號(hào)：R587.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2015)46-0028-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.46.010