張惠潔，吳泉霞，趙勱，譚至柔，秦荔榮，黃雪

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

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糖尿病大鼠結(jié)腸動(dòng)力變化及其機(jī)制探討

張惠潔，吳泉霞，趙勱，譚至柔，秦荔榮，黃雪

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

摘要：目的觀察糖尿病(DM)大鼠結(jié)腸動(dòng)力的變化，并探討其機(jī)制。方法將34只SD大鼠隨機(jī)分為3組，觀察組和模型組制作DM模型，觀察組于造模6周后每天皮下注射甘精胰島素8 U/kg，對(duì)照組和模型組均注射等量生理鹽水。干預(yù)4周后處死各組大鼠，剖腹取出全部腸道測量腸道推進(jìn)率，免疫組化法檢測各組近端結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)、縫隙連接蛋白43(Cx43)，透射電鏡觀察近端結(jié)腸的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果觀察組腸道推進(jìn)率高于模型組，模型組低于對(duì)照組，P均<0.05。結(jié)腸組織ICC及Cx43表達(dá)均為對(duì)照組高于觀察組、觀察組高于模型組，P均<0.05。觀察組ICC數(shù)量、細(xì)胞間縫隙連接明顯多于模型組,但少于對(duì)照組。結(jié)論DM大鼠存在結(jié)腸動(dòng)力障礙，可能與結(jié)腸組織ICC數(shù)量減少、細(xì)胞間縫隙連接破壞及Cx43表達(dá)降低有關(guān)；甘精胰島素可抑制上述改變，改善結(jié)腸動(dòng)力。

關(guān)鍵詞：糖尿病；結(jié)腸動(dòng)力障礙；Cajal間質(zhì)細(xì)胞；縫隙連接蛋白43

胃腸動(dòng)力障礙是糖尿病(DM)常見的慢性并發(fā)癥[1]，其機(jī)制目前尚不完全清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)，DM胃腸動(dòng)力障礙與Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)的減少和細(xì)胞間通訊功能障礙有關(guān)。ICC 是胃腸道平滑肌細(xì)胞間的起搏細(xì)胞，可產(chǎn)生自發(fā)性慢波并介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)傳遞。ICC之間及ICC與平滑肌細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞由縫隙連接(GJ) 介導(dǎo)是細(xì)胞間信息通訊的主要通道?？p隙連接蛋白(Cx)是GJ 的基本構(gòu)成部分，Cx43是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的Cx。2014年3～8月，我們觀察了DM大鼠結(jié)腸動(dòng)力變化，并探討其作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1材料SPF級(jí)SD大鼠34只，體質(zhì)量160～180 g，雌雄各半，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號(hào)：scxk桂2009-0002)。c-Kit兔多克隆抗體(sc-168，武漢博士德公司)；兔多克隆Cx43抗體(武漢博士德公司)；SP試劑盒(SP-9000，北京中杉金橋生物公司)；DAB顯色試劑盒(ZLI-9031，北京中杉金橋生物公司)；鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)用0.1 mmol/L、pH 4.4檸檬酸緩沖液配制后備用；德國羅氏活力型血糖儀(配套試紙)；注射甘精胰島素(諾和諾德中國制藥有限公司)。

1.2動(dòng)物分組及處理取24只SD大鼠采用一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg制作DM模型，測得血糖≥16.7 mmol/L且能穩(wěn)定維持1 周以上者為造模成功。最終造模成功納入19只，將其分為觀察組10只和模型組9只，取10只正常SD大鼠為對(duì)照組。觀察組于造模6周后每天皮下注射甘精胰島素8 U/kg，模型組和對(duì)照組注射等量生理鹽水，持續(xù)4 周。

1.3腸道推進(jìn)率測定干預(yù)4周后禁食16 h，經(jīng)口灌入0.01%的美藍(lán)溶液2 mL，30 min后頸髓脫臼法處死大鼠；剖腹取出從幽門到直腸末端全部腸道，在無張力狀態(tài)下測量腸道全長及美藍(lán)溶液在腸道的推進(jìn)距離，計(jì)算腸道推進(jìn)率(腸道推進(jìn)率=美藍(lán)推進(jìn)距離/腸道全長×100%)。因大鼠結(jié)腸較短，因此本研究以全腸腸道推進(jìn)率代表結(jié)腸推進(jìn)率。

1.4 結(jié)腸組織ICC、 Cx43表達(dá)測定采用免疫組化法。剪取各組大鼠近端結(jié)腸(距盲腸2 cm)組織長約0.5 cm，常規(guī)固定、包埋、切片，脫蠟；抗原修復(fù)、過氧化氫滅活、血清封閉，分別滴加c-Kit一抗(1∶50稀釋)、Cx43一抗(1∶100稀釋)各50 μL，4 ℃過夜；先后滴加生物素標(biāo)記的二抗及辣根過氧化酶各50 μL，室溫孵育15 min；DAB顯色，復(fù)染，沖洗、封片，顯微鏡觀察。結(jié)腸組織ICC主要分布于黏膜下環(huán)行肌層表面、環(huán)行肌層與縱行肌層之間、環(huán)行肌層和縱行肌層內(nèi)，以環(huán)行肌層和肌間神經(jīng)叢區(qū)域最明顯；Cx43主要分布在環(huán)行肌與縱行肌之間和環(huán)行肌層外表面。以胞膜上或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色片狀或顆粒狀物為陽性反應(yīng)。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，計(jì)算各組累計(jì)光密度值(IOD)。

1.5結(jié)腸組織超微結(jié)構(gòu)觀察 取各組約1 cm近端結(jié)腸組織，戊二醛固定。經(jīng)前固定、后固定、塊染、脫水、浸漬后包埋成塊，光學(xué)顯微鏡下半薄切片;用亞甲藍(lán)染色定位，確定組織分層后，LKB-Ⅱ超薄切片機(jī)切片;保留環(huán)形肌、縱形肌及部分黏膜層，用日立H7650透射電子顯微鏡觀察ICC細(xì)胞數(shù)目及GJ情況。

2結(jié)果

2.1各組腸道推進(jìn)率比較觀察組、模型組、對(duì)照組腸道推進(jìn)率分別為64.68%±1.85%、54.51%±2.34%、71.15%±2.60%，觀察組腸道推進(jìn)率高于模型組、模型組低于對(duì)照組，P均<0.05。

2.2各組結(jié)腸組織ICC及 Cx43表達(dá)比較詳見表1。

表1　各組結(jié)腸組織ICC及 Cx43表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

2.3各組結(jié)腸組織超微結(jié)構(gòu)比較對(duì)照組ICC細(xì)胞形態(tài)數(shù)量較多，基膜完整，胞核大，呈圓形或卵圓形；細(xì)胞質(zhì)較少，胞質(zhì)和突起內(nèi)含有豐富的細(xì)胞器，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)目較少，高爾基體發(fā)育良好，線粒體豐富，緊密排列在胞質(zhì)里。細(xì)胞間存在大量緊密GJ。模型組ICC數(shù)量明顯減少，基膜溶解，部分基膜與細(xì)胞膜分離，形成空泡；胞質(zhì)廣泛溶解，胞質(zhì)內(nèi)空泡數(shù)目較多，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量明顯減少，線粒體腫脹、空泡樣變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分脫顆粒；細(xì)胞間的GJ明顯減少，尚存細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)不清，連接松散。觀察組ICC數(shù)目、GJ均多于模型組，但少于對(duì)照組。

3討論

DM發(fā)病率逐年升高，且呈年輕化趨勢[2]，胃腸動(dòng)力障礙是其常見慢性并發(fā)癥，而DM結(jié)腸動(dòng)力障礙又是常見表現(xiàn)之一。DM結(jié)腸動(dòng)力障礙臨床特征為腹脹和便秘，病理生理特點(diǎn)為結(jié)腸張力和收縮力降低，蠕動(dòng)減慢，排空延遲，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及口服降糖藥的效果。目前，其病理生理學(xué)基礎(chǔ)尚不完全清楚。

ICC是胃腸慢波的起搏細(xì)胞，具有產(chǎn)生慢波、傳導(dǎo)慢波電位、介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等功能，在維持正常胃腸動(dòng)力方面發(fā)揮著重要作用[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，多種胃腸動(dòng)力障礙性疾病如賁門失弛緩癥[4]、先天性巨結(jié)腸[5]、慢傳輸型便秘[6]等均存在ICC形態(tài)、分布及數(shù)量的異常，ICC數(shù)量減少可導(dǎo)致結(jié)腸起搏功能減弱，平滑肌產(chǎn)生異常的不規(guī)則慢波、收縮功能障礙、蠕動(dòng)減少或不能產(chǎn)生有效的推進(jìn)性收縮運(yùn)動(dòng)[7]。GJ又稱通訊連接，對(duì)細(xì)胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、增殖和分化等生理過程起重要調(diào)控作用[8]。Cx43是人類主要縫隙連接蛋白[9],其表達(dá)異常與多種疾病的發(fā)生有關(guān)[10，11]。研究發(fā)現(xiàn)，Cx43基因具有腫瘤抑制性，多種癌細(xì)胞中均存在Cx43的低表達(dá)[12]。Cx43與胃腸運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)，Cx43廣泛存在ICC之間、ICC與平滑肌細(xì)胞(SMC)之間及SMC與SMC之間，ICC、ICC與SMC可通過GJ形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能上的電偶聯(lián)體，產(chǎn)生興奮或抑制性反應(yīng)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，各組結(jié)腸組織ICC、 Cx43表達(dá)均為對(duì)照組高于觀察組，觀察組高于模型組。說明細(xì)胞間連接通訊破壞，引起胃腸神經(jīng)末梢-ICC-SMC之間的信息和物質(zhì)傳遞障礙，電傳導(dǎo)減弱；ICC作為結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的起搏細(xì)胞和介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)的功能顯著下降，進(jìn)一步導(dǎo)致腸道神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)SMC的調(diào)節(jié)減弱，從而引起結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能障礙。

研究發(fā)現(xiàn),DM胃腸動(dòng)力障礙時(shí)胰島素分泌減少[14]，可導(dǎo)致DM相關(guān)ICC缺失，胰島素可能通過促進(jìn)胃腸SMC生長、抑制其凋亡、誘導(dǎo)其表達(dá)干細(xì)胞因子，對(duì)ICC起保護(hù)作用[15，16]。其可能作用機(jī)制為胰島素通過PI3K/Akt和Ras/MAPK兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)[17～19]。但其具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Yarandi SS, Srinivasan S. Diabetic gastrointestinal motility disorders and the role of enteric nervous system:current status and future derections[J]. Neur Gas Motil, 2014,26(5):611-624.

[2] Forouhi NG, Wareham NJ. Epidemiology of diabetes[J]. Medicine, 2014,42(12):698-702.

[3] Al-shboul OA. The importance of interstitial cells of cajal in the gastrointestinal tr-act[J]. Saudi J Gasty, 2013,19(5):3-15.

[4] Muller M, Colcuc S, Drescher DG, et al. Murine genetic deficiency of neuronalnitric oxi-de synthase(nNOS(-/-)) and interstitial cells of Cajal (W/W(v)):Implications for achalasia[J]. J Gas Hepat, 2014,29(11):1800-1807.

[5] Gfroerer S, Rolle U. Interstitial cells of Cajal in the normal human gut and in Hirschsp-rung disease[J]. Ped Sur Interl, 2013,29(6):889-897.

[6] Kashyap P, Gomez PJ, Pozo MJ, et al. Immunoreactivity for ano1 detects depletion of kit-positive interstitial cells of Cajal in patients with slow transit constipation[J]. Neur Motil, 2011,23(8):760-765.

[7] 李澤培,邱野,彭燕.Cajal間質(zhì)細(xì)胞與胃腸動(dòng)力關(guān)系的研究進(jìn)展[J].胃腸病學(xué)與肝病學(xué)雜志,2014,9(23):983-986.

[8] Cone AC, Cavin G, Ambrosi C, et al. Protein kinase Cδ-mediated phosphorylation of Con-nexin43 gap junction channels causes movement within gap junctions followed by vesi-cle internalization and protein egradation[J]. J Biol Chem, 2014,289(13):8781-8798.

[9] Marquez-rosado L, Solan JL, Dunn CA, et al. Connexin43 phosphorylation in brain,cardiac, endothelial and epithelial tissues[J]. Biochim Biophys Acta, 2012,1818(8):1985-1992.

[10] 李爍,鐘國強(qiáng),何燕,等.右心房組織中M3受體及縫隙連接蛋白43與心房顫動(dòng)的相關(guān)性研究[J].山東醫(yī)藥,2014,54(14):18-21.

[11] Westphalen K, Gusarova GA, Islam MN, et al. Sessile alveolar macrophages modulate im-munity through connexin 43-based epithelial communication[J]. Nature, 2014,506(7489):503-506.

[12] Qiu X,Cheng JC, Zhao JF, et al. Transforming growth factor-β stimulates human ovarian cancer cell migration by up-regulating connexin43 expression via Smad2/3 signaling[J]. Cell Sign, 2015,27(7):1956-1962.

[13] 代從新,齊清會(huì).連接蛋白43與胃腸運(yùn)動(dòng)[J].國際消化病雜志,2009,29(5):334-336.

[14] Wang Y, Xu XY, Tang YR, et al. Effect of endogenous insulin-like growth factor and ste-m cell factor on diabetic colonic dysmotility[J].World J Gas,2013,19(21):3324-3331.

[15] Horvath VJ,Vittal H,Ordog T. Reduced insulin and IGF-I signaling,not hyperglmia,unde-rlies the diabetes-associated depletion of interstitial cells of Cajal in the murine sto-machl[J]. Diabetes, 2005,54(5):1528-1533.

[16] Horvath VJ, Vittal H, Lorincz A, et al. Reduced stem cell factor links smooth myopathy and loss of interstitial cells of cajal in murine diabetic gastroparesis[J]. Gastroenterology, 2006,130(5):759-770.

[17] 田姣,王寶西,江遜.胃腸道Cajal間質(zhì)細(xì)胞與干細(xì)胞因子/c-kit信號(hào)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].臨床兒科雜志,2013,31(4):385-388.

[18] 袁玉豐,余盈娟,林琳.胰島素樣生長因子-1對(duì)糖尿病大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞因子的影響[J].胃腸病學(xué),2011,16(5):261-266.

[19] Sun M, Wang F, Feng P. Insulin-like growth factor-1 inhibits colonic smooth muscle cell apoptosis in diabetic rats with colonic dysmotility[J]. Regul Pep, 2014,20(11):41-48.

收稿日期：(2015-09-01)

通信作者：譚至柔

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2010GXNSFA013143)。

中圖分類號(hào)：R574.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2015)46-0025-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.46.009