徐碧林,俞秀華，申甜, 喻明，汪紅平,朱近悅

(上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院,上海200062)

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白藜蘆醇對胰島β細胞凋亡的影響及機制探討

徐碧林,俞秀華，申甜, 喻明，汪紅平,朱近悅

(上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院,上海200062)

摘要：目的觀察白藜蘆醇對H2O2誘導的小鼠胰島素瘤β-TC-6細胞株(以下簡稱胰島β細胞)凋亡的影響，并探討其機制。方法將胰島β細胞隨機分為觀察組、對照組、空白組，分別置于含白藜蘆醇10 μmol/L+H2O2200 μmol/L、含H2O2200 μmol/L、不含H2O2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。采用流式細胞術檢測三組細胞凋亡率及活性氧簇(ROS)， RT-PCR法檢測細胞超氧化物歧化酶1(SOD1) mRNA，Western blot法檢測細胞沉默信息調節(jié)因子2相關酶類1(SIRT1)、過氧化物酶增殖物活化受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)蛋白。結果細胞凋亡率對照組>觀察組>空白組，P均<0.05；細胞SOD1 mRNA的相對表達量空白組>觀察組>對照組，P均<0.05；ROS水平對照組>觀察組>空白組，P均<0.05；SIRT1蛋白表達量空白組>觀察組>對照組，P均<0.01；觀察組、空白組PGC-1α蛋白表達量均高于對照組，P均<0.01。結論白藜蘆醇可降低H2O2誘導的胰島β細胞凋亡,其機制可能與其活化SIRT1/PGC-1α通路導致SOD1表達升高、ROS表達降低有關。

關鍵詞：糖尿病；白藜蘆醇；活性氧簇；超氧化物歧化酶；沉默信息調節(jié)因子2相關酶類1；過氧化物酶增殖物活化受體γ輔激活因子1α

氧化應激是指活性氧在體內蓄積過多而引起的細胞毒性過程，在2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[1]。超氧化物歧化酶1(SOD1)和活性氧簇(ROS)是常用的氧化應激指標。沉默信息調節(jié)因子2相關酶類1(SIRT1)/過氧化物酶增殖物活化受體γ輔激活因子1α(PGC-1α)通路是一條有效調節(jié)氧化應激反應的路徑。白藜蘆醇是一種酚類植物抗毒素，具有較好的降血糖作用，但其降血糖的具體機制尚不明確。2015年1～6月，我們采用H2O2處理胰島素瘤β-TC-6細胞株(以下簡稱胰島β細胞)構建氧化應激模型，觀察白藜蘆醇對小鼠胰島β細胞凋亡的影響，并探討其可能機制。

1材料與方法

1.1材料胰島β細胞由中國科學院上海細胞生物學研究所提供,白藜蘆醇、H2O2(上海安譜生物科技有限公司),二氯熒光素二乙酸酯 (DCFH-DA，美國Sigma), Annexin V-PE/ 7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物),逆轉錄酶Super ScriptⅢ (Invitrogen)；熒光染料SYBR Green Ⅰ(Invitrogen),5%CO2細胞培養(yǎng)箱(Shell-Lab)，流式細胞儀(BD FACSCALIBUR),熒光定量PCR儀(CFX96TMR-T Systerm, Bio Rad),BCA試劑盒(江蘇碧云天)，小鼠抗人SIRT1抗體、兔抗人PGC-1α抗體(美國CST),預染蛋白Marker (Ferment)。

1.2胰島β細胞分組及處理取對數(shù)生長期的胰島β細胞接種于96孔板,3×104/孔。將細胞分為觀察組、對照組、空白組，分別置于含白藜蘆醇10 μmol/L+H2O2200 μmol/L、含H2O2200 μmol/L、不含H2O2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每組6個復孔，均置于5%CO2、37 ℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h。

1.3胰島β細胞凋亡率測算取各組細胞，培養(yǎng)48 h后加入適量胰酶細胞消化液消化，PBS洗滌2次；1 000 r/min離心5 min，離心2次后棄上清，加入200 μL BindingBuffer重懸細胞；加入10 μL AnnexinV-FITC,輕輕混勻后置室溫下避光孵育15 min；加入5 μL碘化丙啶后孵育5 min,1 h后上流式細胞儀檢測凋亡細胞，計算細胞凋亡率。

1.4胰島β細胞SOD1 mRNA檢測采用RT-PCR法。TRIzol法抽提總RNA，反轉錄合成cDNA，采用sybr染色法相對定量目標基因SOD1的表達變化。SOD1引物應用primer premier 5軟件設計，由上海諾百生物科技有限公司合成。以β-actin為內參，上游引物：5′- AGGGAAATCGTGCGTGAC-3′,下游引物：5′- CGCTCATTGCCGATAGTG-3′；SOD1上游引物:5′- CCTTGCTTTTTGCTCTCCCAG-3′ ，下游引物5′- ACACCACAACTGGTTCACCG- 3′；擴增條件:95 ℃預變性2 min,95 ℃、10 s,60 ℃、30 s,70 ℃、45 s, 40個循環(huán)，95 ℃、10 s，每秒降0.5 ℃，65 ℃ 、0.05 s。以目的條帶與內參條帶吸光度比值作為SDD1 mRNA的相對表達量。

1.5胰島β細胞ROS檢測取各組細胞，用胰酶消化后置入試管中，洗滌后每管放入500 μL的無血清培養(yǎng)基重懸；加入5 μL DCFH-DA，避光放置30 min，待反應完全后通過流式細胞儀檢測ROS水平。以DCF的熒光水平代表細胞內的ROS。

1.6胰島β細胞SIRT1、PGC-1α蛋白檢測采用Western blot法。取各組細胞，用胰酶消化完全后、裂解、離心、提取核蛋白，電泳、分離，用半干法轉膜60 min，將蛋白轉印到PVDF膜。將PVDF膜用封閉液在室溫條件下封閉60 min。按分子量不同剪下各目的條帶，分別加入小鼠抗人SIRT1抗體(1∶500)、兔抗人PGC-1α抗體(1∶500)，內參GAPDH/Actin的稀釋終濃度為1∶200,在4 ℃條件下孵育過夜。取出條帶，洗滌后放入稀釋后的二抗管中室溫孵育60 min。取出條帶，洗膜后ECL顯色；生物電泳圖像分析系統(tǒng)進行分析，以目的蛋白與內參灰度比值來表示目的蛋白的相對表達量。

2結果

觀察組、對照組、空白組的細胞凋亡率分別為11.50%±0.74%、28.77%±1.33%、7.39%±0.95%，P均<0.05；細胞SOD1 mRNA的相對表達量分別為0.074 8±0.000 1、0.070 8±0.000 1、0.102 0±0.000 1，P均<0.05；ROS水平分別為184.00±2.65、204.67±3.21、12.97±1.45，P均<0.05。各組SIRT1、PGC-1α蛋白表達量比較見表1。

表1　各組SIRT1、PGC-1α蛋白表達量比較

注: 與空白組比較,*P<0.01；與對照組比較,#P<0.01。

3討論

2型糖尿病主要表現(xiàn)為胰島素抵抗和胰島β細胞功能受損，其中胰島β細胞功能受損在其發(fā)生、發(fā)展中起決定作用。胰島β細胞凋亡率過高是胰島β細胞功能受損的主要原因[2]。多種因素可誘導胰島β細胞凋亡，近年來氧化應激機制日益受到重視。內源性抗氧化防御系統(tǒng)包括存在于細胞內的SOD、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等，可阻止新自由基的生成，清除已生成但尚未發(fā)生反應的自由基。研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境、游離脂肪酸、細胞因子等均可引起胰島β細胞發(fā)生氧化應激反應，導致胰島β細胞損傷[3～5]。線粒體是自由基產生和作用的靶點，線粒體內的氧化應激毒性是β細胞凋亡的直接原因[6]。因此，尋找一條有效調節(jié)氧化應激機制的路徑并進行干預，對于減少胰島β細胞凋亡，延緩糖尿病的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。

SIRT1是沉默信息調節(jié)因子2的同源蛋白，其與細胞增殖、分化、衰老、凋亡和代謝密切相關，在氧化應激中起重要作用。Chen等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在氧化應激過程中，SIRT1可通過導致內皮祖細胞的自噬來抑制細胞凋亡。Lee等[8]研究表明，SIRT1可通過抑制NF-κB信號通路以保護胰島β細胞免受氧化應激的損傷。在氧化應激中，SIRT1還可通過阻止凋亡通路的感應以及去乙?；疐OXO3a而促進細胞存活[9，10]。PGC-1α是一種多功能的轉錄調節(jié)因子，是SIRT1的作用底物之一，在氧化應激中也起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，PGC-1α被SIRT1去乙?；螅耸箍寡趸窶n-SOD過表達外，還可調節(jié)線粒體的生物合成，從而減少由于線粒體損傷而導致的氧化應激[11，12]。與野生型小鼠相比，PGC-1α基因敲除小鼠的過氧化氫酶、SOD1、SOD2表達水平均降低。另外，PGC-1α能誘導抗氧化酶表達，清除活性氧，提高組織抗氧化能力[13]。因此，SIRT1/PGC-1α通路是調節(jié)氧化應激的重要路徑。

白藜蘆醇是一種天然的多酚類化合物，是SIRT1的天然激動劑，可通過活化SIRT1而增加線粒體生物合成和功能[14]。以往研究認為，其主要存在于各種紅葡萄果實中；但近期研究發(fā)現(xiàn)，其在中藥虎杖中的含量遠高于葡萄等其他植物[15]。白藜蘆醇可降低血糖，其作用機制可能包括：增加葡萄糖轉運子4的表達,從而增加葡萄糖的攝??；增加脂聯(lián)素的水平改善胰島素抵抗[16]；抑制IKK-NF-κB通路，降低炎癥因子如TNF-α、IL-6、IL-17等的產生，抑制炎性反應從而緩解胰島素抵抗等。本研究結果顯示，觀察組SOD1 mRNA的相對表達量高于對照組、ROS水平低于對照組,表明白藜蘆醇具有良好的清除細胞內氧化毒性物質的能力。觀察組SIRT1、PGC-1α蛋白的表達量均高于對照組，說明白藜蘆醇可促進胰島β細胞中SIRT1、PGC-1α蛋白的表達，而PGC-1α蛋白的活化有可能是SOD產生增加的原因，提示SIRT1/PGC-1α蛋白的活化可能在白藜蘆醇的抗氧化應激功能中發(fā)揮作用。

綜上所述，白藜蘆醇可以通過促進SOD1生成、降低ROS的產生而拮抗氧化應激對胰島β細胞的損傷，可能與其活化SIRT1/PGC-1α通路有關。

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·論著·

Effect of resveratrol on apoptosis of pancreatic β cells and the mechanism

XUBi-lin,YUXiu-hua,SHENTian,YUMing,WANGHong-ping,ZHUJin-yue

(ShanghaiPutuoDistrictCentralHospital,Shanghai200062,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of resveratrol on the apoptosis of mice insulinoma cell line β-TC-6 (hereinafter referred to as β cells) induced by hydrogen peroxide (H2O2), and to explore its possible mechanism.MethodsThe pancreatic β cells were randomly divided into the observation group, control group and blank group, which were respectively cultured in medium with 10 μmol/L resveratrol+200 μmol/L H2O2, 200 μmol/L H2O2and non-H2O2for 48 hours. The apoptosis rate of β cells and reactive oxygen species ( ROS ) were calculated by flow cytometry, superoxide dismutase (SOD1 ) mRNA was measured by RT-PCR, and the expression of silent information regulator factor 2-related enzyme 1 (SIRT1) and peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α (PGC-1α) protein was determined by Western blotting. ResultsComparison of the apoptosis rate: control group>observation group>blank group (all P<0.05), comparison of SOD1 mRNA expression: blank group>observation group>control group (all P<0.05), comparison of ROS levels, control group>observation group>blank group (all P<0.05), and the comparison of SIRT1 protein: blank group>observation group>control group (all P<0.01), the expression of PGC-1α protein in the observation group and blank group was higher than that of the control group (all P<0.01).ConclusionsResveratrol significantly reduces the apoptosis of β cells induced by H2O2. The mechanism may be related to the activation of SIRT1/PGC-1α pathways which leads to the increased SOD1 expression and decreased ROS expression.

Key words:diabetes mellitus; resveratrol; reactive oxygen species; superoxide dismutase; silent information regulator factor 2-related enzyme 1; peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α

收稿日期：(2015-08-30)

作者簡介：第一徐碧林(1973-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要研究方向為胰島β細胞功能早期保護。E-mail: xubilin007@126.com

基金項目：上海市衛(wèi)生局科研課題計劃項目(20124265)。

中圖分類號：R587.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)46-0001-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.46.001