丁曼 盧祖能

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Creutzfeldt-Jakob病非侵入性診斷方法研究新進(jìn)展

丁曼 盧祖能

朊病毒是一種非常規(guī)意義上的傳染性病原體，常導(dǎo)致致命性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其中以Creutzfeldt-Jakob病(CJD)最為常見。CJD屬于一種罕見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床進(jìn)展迅速，致死性達(dá)100%。此疾病有多種類型，其中以散發(fā)型最為常見。目前此病的最大挑戰(zhàn)即臨床診斷。到目前為止臨床確診的金標(biāo)準(zhǔn)仍為腦組織活檢，但將其作為診斷金標(biāo)準(zhǔn)仍存在一定局限性。隨著研究的逐步進(jìn)展，亟需探討新的非侵入性的檢測(手段)，以利于疾病診斷。本文就有關(guān)CJD生物標(biāo)記物檢測、基因篩查、影像學(xué)檢查及電生理檢查等非侵入性手段的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在協(xié)助CJD的診斷，為CJD的確診提供新的思路。

朊病毒?。豢?雅綜合征；PrPSc；PRNP

朊蛋白病(prion diseases)又稱傳染性海綿狀腦病(transmissible spongiform encephalopathy)，是一類由朊蛋白(prion protein，PrP)感染引起的進(jìn)行性致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。人類朊蛋白病主要包括克-雅病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)、庫魯病(Kuru disease)、格斯特曼綜合征(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome)及家族性致死性失眠(fatal familial insomnia，F(xiàn)FI)等，以CJD最為常見。CJD屬于一種進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性變疾病，潛伏期從數(shù)個(gè)月至數(shù)年不等，疾病進(jìn)展迅速。大多數(shù)CJD患者在出現(xiàn)臨床癥狀后才被確診，一般于診斷后1年內(nèi)死亡。根據(jù)起病方式不同，CJD主要分為4種類型：散發(fā)性CJD(sporadic CJD，sCJD)、家族性遺傳型CJD(familiar CJD，fCJD)、醫(yī)源性CJD(itrogenic CJD，iCJD)和變異型CJD(variant CJD，vCJD)[1]。其中sCJD最多見，占CJD總發(fā)病人數(shù)的85%～90%，每年大約(1～1.5)/百萬人感染；fCJD占CJD的5%～15%，由Pmp基因突變引起；iCJD占CJD的1%左右，由醫(yī)療行為引起的感染；vCJD則由人食入牛海綿狀腦病(bovine spongiform encephalopathy，BSE)牛制品引起。CJD代表性癥狀包括進(jìn)行性癡呆、肌陣攣以及共濟(jì)失調(diào)等。根據(jù)WHO[2]1998年提出的CJD診斷標(biāo)準(zhǔn)以及美國疾病控制和預(yù)防中心(Center for Disease Control and Prevention in the US)及歐洲疾病控制預(yù)防中心(the European Centre for Disease Prevention and Control，ECDC)2009年修訂的標(biāo)準(zhǔn)[3]，依體格檢查、臨床檢測結(jié)果等將疾病分為明確診斷、很可能診斷及可能診斷。腦組織活檢仍為診斷CJD的金標(biāo)準(zhǔn)。手術(shù)取材的靶區(qū)域也常常為影像學(xué)改變最為明顯的區(qū)域，而這些區(qū)域往往為皮層下較深部位；且手術(shù)取材后行病理檢查時(shí)并非所有腦區(qū)均會出現(xiàn)典型的CJD病理改變。因此腦組織活檢也存在一定的局限性。目前尚缺乏可確診CJD的非侵入性檢查手段和更敏感的檢測新方法用于協(xié)助臨床診斷CJD，因此隨著研究的逐步進(jìn)展，臨床亟需新的非侵入性診斷方法進(jìn)行早期疾病診斷。

1 CJD實(shí)驗(yàn)室診斷

PrPSc聚集在腦中形成PrP沉積物，引起典型的病理改變，如神經(jīng)元丟失、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生及空泡形成，導(dǎo)致海綿狀組織沉積甚至死亡[4]。采取侵入性方式取腦組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測以明確其神經(jīng)病理學(xué)改變依然是目前的一種必不可少的確診方法。然而患者及家屬對此種侵入式的方法接受程度較低，導(dǎo)致低活檢率或尸檢率，這是CJD確診率低的原因之一。對一些有效的生物標(biāo)記物如14-3-3蛋白進(jìn)行檢測的方法已經(jīng)發(fā)展成熟，并在一定程度上降低了漏診率。聯(lián)合檢測多種已知的生物標(biāo)記物彌補(bǔ)了檢測單一生物標(biāo)記物的低敏感性和/或低特異性的缺點(diǎn)。

1.1 朊病毒的檢測方法 朊病毒感染后，在宿主細(xì)胞內(nèi)尤其是神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)的PrPc轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSc。PrPc具有調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)節(jié)鈣銅的平衡、保持生物周期穩(wěn)定的功能，同時(shí)能夠幫助宿主維持空間學(xué)習(xí)能力及記憶力，在信息傳遞及突觸形成等方面也起一定作用。PrPSc聚集在腦中形成PrP沉積物，引起朊蛋白病特征性病理改變。且因朊蛋白病能夠傳染，其病理改變的特點(diǎn)不同于其他的淀粉樣變性病。由于“種屬屏障”的存在，可傳染性疾病通常在不同物種中很難傳播，而BSE能傳染給人類致vCJD，因此對BSE進(jìn)行研究至關(guān)重要。

侵入性腦組織活檢為目前唯一一種能夠確診的方法，但在操作過程中可能損傷正常腦組織，為降低侵入性，也有學(xué)者采用嗅黏膜及骨骼肌等組織進(jìn)行其診斷意義的研究，但均未經(jīng)過驗(yàn)證或推廣。也有學(xué)者通過檢測vCJD患者扁桃體中的PrPSc進(jìn)行診斷的相關(guān)報(bào)道[5]。扁桃體活檢對診斷vCJD有一定意義，但并不能用于診斷sCJD[5]。2005年Castilla等[6]采用蛋白錯(cuò)誤折疊循環(huán)擴(kuò)增(PMCA)的方法進(jìn)行CJD的診斷研究，該研究通過檢測體外擴(kuò)增少量的PrPSc以反映朊病毒感染的滴度。此方法也能檢測血液及尿液中的朊病毒。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在癥狀出現(xiàn)前PMCA法可檢測到朊病毒感染[7]，而且對vCJD的診斷[8]和sCJD的診斷[9]都具有很高的敏感性。

1.2 生物標(biāo)記物檢測 腦脊液檢測被廣泛用于診斷神經(jīng)系統(tǒng)疾病，14-3-3蛋白是目前診斷CJD廣泛采用的生物標(biāo)記物。WHO 1998年的診斷標(biāo)準(zhǔn)將腦脊液14-3-3蛋白作為診斷CJD的標(biāo)準(zhǔn)之一[2]，基于臨床特征、DWI結(jié)果以及腦脊液中的替代標(biāo)記物如14-3-3蛋白及總tau蛋白(total tau，t-tau)等作出CJD的診斷。14-3-3蛋白為一組具有調(diào)節(jié)功能的胞質(zhì)多肽，它在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面都具有非常重要的作用。在神經(jīng)受損時(shí)，14-3-3蛋白釋放入腦脊液。有研究對420例CJD患者進(jìn)行活組織檢查14-3-3蛋白，證實(shí)其敏感性及特異性分別為95%和28%[10]。Gmitterová等[11]采用一種改良的ELISA技術(shù)檢測sCJD腦脊液中的14-3-3蛋白，發(fā)現(xiàn)對MM1、VV1、VV2 3種亞型檢測的敏感性均達(dá)100%，對MM2、MV1、MV2 3種亞型檢測的敏感性分別為75%、89%、89%，而采用免疫印跡法檢測時(shí)僅MM2亞型獲得陽性結(jié)果。Satoh等[12]采用半定量Western blot技術(shù)，使用各種抗體特異地檢測14-3-3蛋白的不同亞型，發(fā)現(xiàn)γ-亞型能增加檢測的特異性，如果病例同時(shí)有陽性MRI結(jié)果和/或腦脊液排除炎性改變能夠明顯提高診斷的特異性。

除14-3-3蛋白外，tau蛋白包括t-tau及磷酸化tau蛋白(phosphorylated tau，p-tau)同樣是診斷CJD的重要的生物標(biāo)記物，甚至較14-3-3蛋白具有更高的敏感性及特異性。P-tau/t-tau為診斷sCJD最為準(zhǔn)確的單一標(biāo)記物，其敏感性及特異性分別為86%和90%[13]。結(jié)合檢測一種以上腦脊液內(nèi)蛋白標(biāo)記物能夠提高sCJD與其他神經(jīng)精神狀況(如癡呆等)鑒別的準(zhǔn)確性[13]。14-3-3蛋白及t-tau蛋白能明顯提高sCJD MM1/MV1的診斷率，其診斷敏感性約91%～100%[11，14-15]。

近幾年，學(xué)者們對其他的一些神經(jīng)損傷標(biāo)記物包括神經(jīng)元特異性烯醇化酶、S-100B、乳酸脫氫酶等也進(jìn)行研究，但在14-3-3蛋白及tau蛋白檢測的基礎(chǔ)上，并未提高診斷的敏感性。為與其他神經(jīng)變性疾病性癡呆相鑒別，特別是最容易導(dǎo)致14-3-3蛋白及tau蛋白假陽性的非朊蛋白神經(jīng)變性疾病性癡呆(如阿爾茨海默病)，檢測p-tau/t-tau及β淀粉樣蛋白(Aβ)具有重要意義[16]。Aβ與朊蛋白相同，以不同大小(從低聚物到纖絲樣淀粉蛋白聚集物)沉積于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變。因此找到更好的腦脊液標(biāo)記物進(jìn)行聯(lián)合診斷可提高其診斷的敏感性及特異性。

實(shí)時(shí)振動誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化(real-time quaking-induced conversion，RT-QUIC)技術(shù)通過在體外擴(kuò)增腦脊液樣本中的PrPSc，診斷sCJD的敏感性及特異性分別達(dá)到84%及100%[17]。也有研究將RT-QUIC應(yīng)用于鼻部嗅上皮組織刷取標(biāo)本[18]，將少量錯(cuò)誤折疊蛋白“種子”通過外來能量擴(kuò)增成較大的淀粉樣蛋白或蛋白酶抗性蛋白聚合物，特異性達(dá)100%，敏感性也達(dá)97%。這種方法的優(yōu)缺點(diǎn)還需要進(jìn)一步證實(shí)，但根據(jù)以上數(shù)據(jù)，結(jié)果令人鼓舞，尤其是上述方法可檢測出低至40～100個(gè)/mL的錯(cuò)誤折疊蛋白聚合物[19]。

1.3 PrP 基因篩查 傳染性海綿狀腦病的致病機(jī)制為非正常的錯(cuò)誤折疊蛋白(PrPSc)聚集影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。人類的致病病原體由位于染色體20p13的朊蛋白基因(PRNP)編碼。朊蛋白病是由于PRNP基因的突變或多態(tài)性致其在人體及動物體內(nèi)潛伏。朊蛋白的病原體基因突變導(dǎo)致遺傳性朊蛋白病，如fCJD，占發(fā)病原因的10%～15%[19]。PRNP基因的突變在散發(fā)及遺傳型CJD中更容易發(fā)生。密碼子129位為蛋氨酸及纈氨酸的遺傳密碼子，是CJD分子診斷的作用靶點(diǎn)[20]。這一密碼子頻繁的出現(xiàn)在所有類型的CJD中，編碼多態(tài)性蛋氨酸純合子最普遍。PRNP突變導(dǎo)致CJD不同表型變化，密碼子129的多態(tài)性對突變體及野生等位基因進(jìn)行更進(jìn)一步的調(diào)控。遺傳型CJD最為常見的形式為E200K(賴氨酸[K]替代谷氨酸[E])突變[21]。其次為V210I(異亮氨酸[I]替代纈氨酸[V])突變，但這種突變并沒有一個(gè)明確的模式[21]。在臨床實(shí)踐中，需要詳細(xì)詢問患者及家屬情況，并能提供是否需要進(jìn)行PRNP基因檢測的信息。對于任何有人傳染性海綿狀腦病家族史的患者均推薦進(jìn)行基因檢測及分析[12]。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了40多種PRNP基因突變與遺傳性人朊蛋白病相關(guān)。隨著對疾病認(rèn)識的提高以及更多分子工具的完善，越來越多的突變也將被發(fā)現(xiàn)并用于臨床篩查。

2 電生理診斷

最早使用腦電圖(EEG)診斷CJD是從1954年開始，并在1979年正式公布EEG為CJD的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。在14-3-3蛋白檢測前，周期性腦波記錄被認(rèn)為是sCJD非侵入性方法中最為可靠的一種診斷依據(jù)[22]。周期性尖-慢復(fù)合波(periodic sharp and slow wave complexes)是sCJD的典型EEG改變。一般在sCJD早期表現(xiàn)為雙側(cè)α波活躍，伴有不規(guī)則的θ波及δ波，間歇性出現(xiàn)有節(jié)律的δ波，這些變化多數(shù)為彌漫異常，無特異性。隨病情進(jìn)展，慢波逐漸增多，可出現(xiàn)特征性的周期性同步放電(periodic synchronous discharge)，表現(xiàn)為廣泛性、左右同步或不同步的爆發(fā)性異常波。但這種改變也可出現(xiàn)在其他疾病中，如中毒代謝性障礙、Hashimoto腦病(HE)，阿爾茨海默病及路易體癡呆等，因此嚴(yán)密、反復(fù)多次監(jiān)測EEG對鑒別診斷CJD的各亞型非常重要。

3 影像學(xué)診斷

很多CJD患者的MRI影像中可出現(xiàn)CJD的特征性改變，MRI能夠很好地區(qū)分CJD亞型。CJD特異的神經(jīng)病理改變，包括空泡形成、朊蛋白沉積以及星形膠質(zhì)細(xì)胞增生等與DWI檢查的灰質(zhì)改變相關(guān)[23]。DWI和FLAIR診斷CJD的敏感性和特異性分別為91%～92.3%和93.8%～95%[24-25]。二者不僅可檢測到皮層下灰質(zhì)(尾狀核及丘腦)改變，還可檢測到皮層改變(稱之為“花邊征”)，疾病初期異常高信號可能為單側(cè)性，隨疾病進(jìn)展可發(fā)展至雙側(cè)，而疾病終末期異常信號可能減少甚至消失。此外MRI可幫助鑒別vCJD及sCJD，通常sCJD的改變發(fā)生在尾狀核，而大多數(shù)vCJD的異常出現(xiàn)在后丘腦部位[26]。sCJD的DWI高信號改變更明顯、更典型，比FLAIR影像中的改變出現(xiàn)的更早[27]。Caverzasi等[28]使用DTI來度量sCJD，指出量化方法能夠更加精確地識別腦組織受損模式，系統(tǒng)追蹤MRI影像改變有助于更深刻地認(rèn)識人類朊蛋白病潛在的組織病理學(xué)改變機(jī)制，并指導(dǎo)臨床實(shí)踐；平均彌散系數(shù)(mean diffusivity)表現(xiàn)為最初有降低趨勢，隨后逐漸趨近正常，且平均彌散系數(shù)增加程度與患者的臨床功能惡化密切相關(guān)。雖然WHO的sCJD診斷標(biāo)準(zhǔn)并沒有將MRI結(jié)果列入其中，但是美國疾病控制和預(yù)防中心及ECDC基于最近修訂的標(biāo)準(zhǔn)將MRI列入sCJD的診斷標(biāo)準(zhǔn)中[3]。

MRI診斷CJD的一個(gè)缺點(diǎn)在于其結(jié)果與臨床醫(yī)生的能力有關(guān)，特別是在疾病早期階段臨床醫(yī)生或放射科醫(yī)生識別CJD的MRI改變較難，易導(dǎo)致漏診、誤診。因此建議即使處于疾病早期MRI顯示“正常”，亦需再次仔細(xì)回顧觀察。

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(本文編輯：時(shí)秋寬)

10.3969/j.issn.1006-2963.2016.04.013

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1006-2963(2016)04-0283-04

2015-11-16)