龔嵐　林通

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·青光眼專題·

角膜活體共聚焦顯微鏡在青光眼臨床研究中的應(yīng)用

龔嵐林通

角膜活體共聚焦顯微鏡作為一種非侵入性、高分辨率的眼表成像儀器，可以對角膜、結(jié)膜、瞼板腺等眼表組織進行細胞水平的微觀形態(tài)檢測。青光眼患者的眼表健康逐漸受到關(guān)注，越來越多的研究針對抗青光眼藥物和手術(shù)治療對患者眼表組織結(jié)構(gòu)的影響進行探究。近年來國內(nèi)外許多學(xué)者已將角膜活體共聚焦顯微鏡從眼表疾病的應(yīng)用引入青光眼臨床問題的探究中。因此，本文就角膜活體共聚焦顯微鏡在青光眼臨床研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀進行闡述，為今后研究開拓新思路。(中國眼耳鼻喉科雜志，2016，16：166-169)

青光眼；顯微鏡，共焦；眼表

角膜活體共聚焦顯微鏡(invivoconfocal micro-scopy，IVCM) 是一種具有高分辨率的新型非侵入性眼表成像儀器，利用其共焦切片功能，在活體下即可多層次地觀察眼表組織中的有形成分，并且還可以實時地拍攝細胞水平的組織形態(tài)與變化。正因其具有無創(chuàng)、微觀及活體下觀察組織結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢，自1990年首次報道了活體下IVCM拍攝的人類角膜分層圖像以來，其在眼表結(jié)構(gòu)觀察及臨床研究中的應(yīng)用得到不斷的拓展。目前， IVCM對角膜上皮、角膜基質(zhì)細胞、角膜神經(jīng)、角膜內(nèi)皮細胞、結(jié)膜上皮、杯狀細胞以及瞼板腺等眼表組織結(jié)構(gòu)均可以進行形態(tài)觀察。在近二十余年的應(yīng)用歷史中，IVCM在眼表研究及臨床應(yīng)用中均取得了較大的進展，包括感染性角膜病診斷的鑒別；角膜變性、營養(yǎng)不良、圓錐角膜等病理狀態(tài)下角膜組織的細胞形態(tài)學(xué)觀察；屈光手術(shù)及角膜移植術(shù)后角膜神經(jīng)及組織愈合情況的觀察；干眼癥和角、結(jié)膜燒傷的眼表狀態(tài)觀察；配戴角膜接觸鏡的眼表狀態(tài)觀察；眼表疾病中免疫呈遞細胞的動態(tài)觀察等。由此看來，角膜IVCM已成為眼表臨床工作及研究中的得力助手。近年來，隨著青光眼患者的眼表健康日益受到關(guān)注，國內(nèi)、外學(xué)者逐漸將IVCM應(yīng)用于青光眼的臨床研究中。本文就角膜IVCM在青光眼臨床研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀進行闡述，進而為青光眼患者眼表問題的探究開拓新的研究思路。

1　青光眼的結(jié)膜ICVM結(jié)構(gòu)及形態(tài)改變

1.1結(jié)膜濾過泡的觀察最早將IVCM應(yīng)用于青光眼的研究，主要是利用其觀察濾過性抗青光眼手術(shù)后結(jié)膜濾過泡的結(jié)構(gòu)和功能。2004年，Labbé等[1]首次報道了利用IVCM活體觀察抗青光眼術(shù)后有功能性和無功能性結(jié)膜濾過泡組織結(jié)構(gòu)的差異，發(fā)現(xiàn)有功能性的濾過泡中結(jié)膜微囊數(shù)量明顯多于無功能性的濾過泡，并且前者濾過泡上皮下結(jié)締組織較后者疏松，更利于房水的引流。此后也有學(xué)者[2]證實，IVCM檢測的結(jié)膜濾過泡相關(guān)參數(shù)包括結(jié)膜上皮微囊密度、微囊面積、微囊封閉情況均與濾過泡的功能間存在確切的相關(guān)性。由此看出，IVCM可用于區(qū)分有功能性和無功能性濾過泡，這對于臨床中客觀評價抗青光眼術(shù)后療效有重要的提示作用。相比于裂隙燈下觀察濾過泡形態(tài)，IVCM檢測可以了解到更為細微的變化和結(jié)構(gòu)特點。正因為如此，此后更多的研究采用IVCM檢測濾過泡的微觀結(jié)構(gòu)，作為一種客觀的形態(tài)學(xué)檢測方法用于評價抗青光眼術(shù)后的療效情況[3-4]。也有研究[5]利用其觀察濾過性抗青光眼手術(shù)采用不同制瓣方式時結(jié)膜濾過泡的結(jié)構(gòu)、形態(tài)和功能的差異，進而評價不同制瓣方式對濾過性抗青光眼手術(shù)的影響。但IVCM對抗青光眼手術(shù)后結(jié)膜濾過泡的功能性是否具有早期的預(yù)判作用，尚需要進一步的探究論證。

1.2結(jié)膜上皮微囊的改變結(jié)膜上皮微囊的改變早期在濾過性手術(shù)后結(jié)膜濾過泡中被IVCM檢測到的。它是一種類圓形或橢圓形的結(jié)膜上皮細胞外囊性結(jié)構(gòu)，在濾過泡內(nèi)的結(jié)膜上皮微囊一般直徑為10～200 μm。在未行濾過性手術(shù)的青光眼患者中也可以觀察到結(jié)膜上皮微囊的改變，但其尺寸要小于濾過性手術(shù)后的結(jié)膜上皮微囊，直徑通常為10～90 μm。有學(xué)者[6]觀察了未行過手術(shù)治療的正常眼壓性青光眼和原發(fā)性開角型青光眼患者結(jié)膜的IVCM形態(tài)，發(fā)現(xiàn)2種類型的青光眼患者結(jié)膜均存在明顯的上皮微囊改變，結(jié)膜上皮微囊密度相比于正常人群高出4～5倍。但這2種類型青光眼之間并沒有差異。青光眼患者在行小梁濾過手術(shù)之前就已經(jīng)存在上皮微囊改變這一結(jié)論在多項研究中都得到證實[7-8]。青光眼患者的這種結(jié)膜上皮微囊改變，目前認為主要是房角-小梁網(wǎng)-房水排出途徑由于各種原因受阻，進而經(jīng)葡萄膜-鞏膜房水排出途徑代償性增強引起。在濾過性抗青光眼手術(shù)之后，結(jié)膜的上皮微囊改變更加明顯，特別是在濾過泡區(qū)域內(nèi)，其結(jié)膜微囊密度和面積都有明顯增加[7]。通過IVCM檢測結(jié)膜微囊密度和面積，除了應(yīng)用于評價小梁切除術(shù)濾過泡的結(jié)構(gòu)和功能外，也有研究將其應(yīng)用于無濾過泡的(非濾過泡依賴的)濾過性手術(shù)后結(jié)膜形態(tài)的觀察。有學(xué)者[9]將IVCM應(yīng)用于前房-脈絡(luò)膜上腔分流裝置Gold Micro-Shunt植入術(shù)效果的觀察中，發(fā)現(xiàn)手術(shù)療效佳的患者其結(jié)膜微囊的密度和面積明顯大于手術(shù)療效差的患者。此外，還有學(xué)者[10]將其應(yīng)用于評價Schlemms管成形術(shù)后結(jié)膜的形態(tài)、結(jié)構(gòu)改變，發(fā)現(xiàn)成功的Schlemms管成形術(shù)后12周可見其球結(jié)膜的上皮微囊密度和面積較術(shù)前有明顯增大；而療效差的患者術(shù)后與術(shù)前相比沒有明顯的差異。由此看出各類青光眼手術(shù)后結(jié)膜上皮微囊的改變往往提示術(shù)后經(jīng)鞏膜、結(jié)膜引流途徑的增強。因此，通過IVCM評價結(jié)膜微囊密度和面積可以用于判別這類手術(shù)結(jié)構(gòu)層面上的成敗。

1.3長期使用抗青光眼藥物引起的結(jié)膜改變有大量的證據(jù)已經(jīng)證實，抗青光眼藥物中的防腐劑在患者的眼表損傷中起到重要作用，因此不含防腐劑的抗青光眼制劑應(yīng)運而生。有研究[11]將IVCM應(yīng)用于觀察青光眼藥物對患者結(jié)膜結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)長期使用含防腐劑的β-受體阻滯劑可造成結(jié)膜杯狀細胞密度和結(jié)膜上皮細胞的規(guī)則性明顯下降，而不含防腐劑的β-受體阻滯劑對結(jié)膜結(jié)構(gòu)的影響并不明顯。利用IVCM前瞻性的研究發(fā)現(xiàn)，對于從未用過藥的原發(fā)性開角型青光眼患者分為2組進行治療，一組給予含防腐劑的抗青光眼藥物，另一組給予不含防腐劑的抗青光眼藥物，用藥6個月后IVCM檢測發(fā)現(xiàn)的結(jié)膜杯狀細胞密度在含防腐劑組下降較不含防腐劑組明顯[12]。這幾項研究提示，對于需要長期使用抗青光眼藥物的患者，如果本身眼表比較脆弱的情況下，選擇不含防腐劑的抗青光眼藥物對于患者眼表健康的維持具有重要意義。此外，由本院青光眼專業(yè)組和眼表專業(yè)組聯(lián)合開展的研究[13]，采用IVCM觀察了目前臨床常用的幾類抗青光眼藥物長期使用對于結(jié)膜結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-受體阻滯劑、α-腎上腺素受體激動劑、前列腺素類抗青光眼藥物及這幾類藥物的聯(lián)合使用對結(jié)膜組織均有一定程度的影響，包括杯狀細胞密度的下降、樹突細胞的浸潤增加以及上皮下纖維化；并且通過比較發(fā)現(xiàn)，前列腺素類藥物對結(jié)膜組織的影響相對小于其他2種抗青光眼藥物。這對于臨床用藥的選擇也有一定的指導(dǎo)意義。

2　青光眼的角膜IVCM結(jié)構(gòu)及形態(tài)改變

青光眼患者由于長期用藥引起角膜病變這一問題日益受到關(guān)注。近年來隨著認識的不斷深入，青光眼醫(yī)師對于患者的治療不僅僅局限在控制眼壓，同時也注重患者的眼表健康。由于IVCM對角膜各層組織結(jié)構(gòu)均可以清晰成像，利用其可以觀察抗青光眼藥物對患者角膜上皮、基底膜下神經(jīng)、基質(zhì)層、角膜內(nèi)皮細胞及角膜緣組織的影響。通過IVCM檢測，有研究[14]發(fā)現(xiàn)，長期使用含防腐劑的抗青光眼藥物引起角膜上皮細胞密度降低；而不含防腐劑的抗青光眼藥物對于角膜上皮細胞密度影響不大。因此認為，青光眼患者角膜上皮細胞受損主要與防腐劑的毒性作用有關(guān)。此外，研究[14-15]還發(fā)現(xiàn)，長期使用抗青光眼藥物的患者基底膜上皮細胞相比于正常人群密度增加。分析認為是由于抗青光眼藥物對角膜上皮細胞的損傷刺激基底上皮細胞代償性增殖引起。角膜上皮基底膜下神經(jīng)也受到抗青光眼藥物的影響。多項研究[14，16-17]中IVCM檢測發(fā)現(xiàn)，長期使用抗青光眼藥物能夠引起角膜上皮基底膜下神經(jīng)纖維密度降低，特別是含有防腐劑的抗青光眼藥物對于角膜上皮基底膜下神經(jīng)的損傷更為明顯[14]。此外Bergonzi等[18]發(fā)現(xiàn)，長期使用前列腺素類抗青光眼藥物使得角膜基質(zhì)細胞密度增加，同時角膜基質(zhì)層細胞外基質(zhì)減少，分析認為與金屬蛋白酶激活有關(guān)。由此作者推測，長期使用前列腺素類抗青光眼藥物在一定程度上可能會影響角膜厚度，但尚需進一步研究論證。Ranno 等[19]通過IVCM檢測發(fā)現(xiàn)，用藥2年以上的青光眼患者角膜內(nèi)皮細胞密度明顯小于未使用過抗青光眼藥物的患者，但不同抗青光眼藥物(β-受體阻滯劑和前列腺素類藥物)之間并沒有明顯差異。

IVCM也可以用于角膜緣結(jié)構(gòu)的成像，有學(xué)者利用IVCM觀察抗青光眼藥物對角膜緣結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)長期使用青光眼藥物可以引起患者角膜緣移行細胞的不規(guī)則改變和樹突細胞浸潤增多。相比于不含防腐劑的藥物，這種改變在含防腐劑的青光眼藥物中更為明顯，并且隨著使用藥物種類的增多，其角膜緣的異常改變更明顯[20]。早在2001年已有學(xué)者[21]提出，由于長期使用抗青光眼藥物引起醫(yī)源性角膜緣干細胞缺乏?，F(xiàn)在利用IVCM觀察角膜緣的細微結(jié)構(gòu)，能夠提供確切的病理依據(jù)，進一步論證了這一事實。

3　青光眼的瞼板腺IVCM結(jié)構(gòu)及形態(tài)改變

抗青光眼藥物對于瞼板腺結(jié)構(gòu)和功能的影響近年來也受到關(guān)注。自2011年陸續(xù)有多位學(xué)者觀察了長期使用抗青光眼藥物后瞼板腺結(jié)構(gòu)和功能的改變[22-24]。其中一項研究通過患眼和健側(cè)眼的自身對照，發(fā)現(xiàn)患眼[使用前列腺素類藥物或β-受體阻滯劑，周期約(7.9±6.0)年]的瞼板腺缺失及瞼脂的性狀評分均明顯差于健側(cè)眼(未使用抗青光眼藥物)[24]。但是對于抗青光眼藥物引起瞼板腺結(jié)構(gòu)和功能改變機制的研究尚較為缺乏。2013年，Agnifili 等[25]通過IVCM對長期使用抗青光眼藥物患者的瞼板腺進行了觀察，發(fā)現(xiàn)這些患者的瞼板腺腺泡密度和腺泡單位面積減少，腺泡脂質(zhì)反射信號增強，導(dǎo)管開口擴張，腺泡壁及腺泡間隙反射信號增強(炎癥征象)。這些改變與阻塞型瞼板腺功能障礙患者的IVCM檢測各參數(shù)有部分相符合，但腺泡單位面積減少在阻塞型瞼板腺功能障礙患者中并沒有發(fā)現(xiàn)。該研究同時發(fā)現(xiàn)，使用含防腐劑的前列腺素類藥物患者，其瞼板腺腺泡壁及腺泡間隙炎癥反應(yīng)明顯強于不含防腐劑的前列腺素類藥物，但在使用含防腐劑或不含防腐劑的β-受體阻滯劑的患者之間并沒有發(fā)現(xiàn)差異性。因此認為，相比于β-受體阻滯劑，前列腺素類藥物更易引起瞼板腺腺泡炎癥反應(yīng)。從這項研究可以看出，利用IVCM能夠更為深入地揭示抗青光眼藥物引起瞼板腺結(jié)構(gòu)、功能改變的微觀機制。

4　IVCM應(yīng)用于青光眼臨床研究的局限性

目前IVCM只能對組織結(jié)構(gòu)中的有形成分及細胞進行形態(tài)學(xué)的觀察，無法明確相應(yīng)組織結(jié)構(gòu)及細胞的表型。組織中的細胞及相應(yīng)結(jié)構(gòu)尚需要經(jīng)驗較為豐富的檢測者進行區(qū)分。當然隨著應(yīng)用經(jīng)驗和大量研究證據(jù)的積累，對于大多數(shù)的眼表組織結(jié)構(gòu)及細胞都能明確其性狀。但對于某些細胞及組織的鑒別仍然存在不確定性，例如利用IVCM觀察到的杯狀細胞容易與炎癥引起的上皮細胞鱗狀化生混淆。目前尚無法明確結(jié)膜上皮微囊改變就是由于房水經(jīng)鞏膜途徑滲透至結(jié)膜引起的改變，也可能是由于結(jié)膜上皮細胞退行性病變引起。此外，IVCM檢測到的樹突細胞單純從形態(tài)上進行判別是否準確？這些問題仍需商榷。有些眼表結(jié)構(gòu)由于解剖因素尚無法被IVCM觀察到，例如淚腺、結(jié)膜深部的鞏膜結(jié)構(gòu)等。因此今后IVCM仍需要加強其穿透的深度及對組織結(jié)構(gòu)觀察的分辨率。

對于眼表組織的觀察和研究以往以組織病理、免疫組織化學(xué)、印跡細胞學(xué)等手段為主；IVCM的出現(xiàn)，部分替代了以往的病理檢查手段，這一無創(chuàng)、微觀及活體下觀察方法也給青光眼的臨床研究開辟了新的領(lǐng)域。IVCM有助于抗青光眼手術(shù)后濾過泡結(jié)構(gòu)和功能的判別，同時有助于客觀檢測抗青光眼藥物對眼表組織結(jié)構(gòu)的影響和損害，為青光眼的臨床藥物選擇提供參考依據(jù)。此外，術(shù)前通過IVCM檢測明確患者的結(jié)膜組織條件是否存在不利于濾過泡功能維持的因素，這為抗青光眼手術(shù)術(shù)式的選取提供了一定的參考價值。當然IVCM在青光眼臨床研究中是否還會有新的應(yīng)用，仍需要眼科研究者進一步的拓展和探索。

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(本文編輯諸靜英)

Application of in vivo laser scanning confocal microscopy in clinical research of glaucoma

GONG Lan, LIN Tong.

Department of Ophthalmology, Eye Ear Nose and Throat Hospital of Fudan University; Key Laboratory of Myopia, Ministry of Health, Shanghai 200031 China Corresponding author： GONG Lan, Email: 13501798683@139.com

Cornealinvivolaser scanning confocal microscopy (IVCM), as a noninvasive measurement, provides micro-structural information of the anterior segment tissues of the eye and allows high-resolution imaging of the cornea, conjunctiva and meibomian glands at the cellular level. Health of ocular surface in glaucoma patients has been gradually concerned. Previous studies have been conducted to investigate the influence of anti-glaucoma drugs and surgeries on the structure of ocular surface in glaucoma patients. In past years, the application of IVCM has progressively extended to clinical research for glaucoma patients. Thus this paper reviewed the studies of IVCM observation for glaucoma and provided a new research approach to interpret the mechanism of ocular surface alterations in glaucoma.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2016,16: 166-169)

Glaucoma; Microscopy，confocal; Ocular surface

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 衛(wèi)生部近視眼重點實驗室上海200031

龔嵐(Email:13501798683@139.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2016.03.005

2016-03-13)