黃迪希 譚守勇 劉志輝

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蛋白質(zhì)組學在結核性胸腔積液診斷中的現(xiàn)狀及進展

黃迪希 譚守勇 劉志輝

蛋白質(zhì)組學的快速發(fā)展，為研究更快速、準確、簡單的診斷結核性胸腔積液(tuberculous pleural effusion,TPE)的方法提供了技術及理論基礎。作者回顧了當前主流的蛋白質(zhì)組學相關技術及近年來結核病及結核性胸腔積液相關蛋白質(zhì)組學的研究。指出，目前僅在結核性胸腔積液中表達的特異性蛋白尚未確定，但從結核病患者血清、胸腔積液等體液中能分析出較非結核性疾病患者體液的差異性蛋白，有望通過蛋白質(zhì)譜的比較分析，尋找到結核性相關特異性蛋白，進而發(fā)現(xiàn)新型結核性胸膜炎診斷標志物。

蛋白質(zhì)組學； 胸腔積液； 結核/診斷

蛋白質(zhì)作為生命活動的重要物質(zhì)基礎，多年來一直是生命科學的研究熱點。1994年澳大利亞學者Wilkins 和Williams提出了蛋白質(zhì)組的概念，即“一個基因組或一個細胞、組織在特定時間及空間上表達的全部蛋白質(zhì)”[1]。蛋白質(zhì)組學則以基因組轉(zhuǎn)錄而成的所有蛋白質(zhì)為研究對象，動態(tài)分析蛋白質(zhì)在時間和空間上的變化，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系。蛋白質(zhì)的表達具有時間和空間的特異性，蛋白質(zhì)數(shù)量可能是其基因數(shù)量的數(shù)十倍甚至百倍以上[2]，因此對蛋白質(zhì)數(shù)量及種類的分析將是蛋白質(zhì)功能研究的巨大挑戰(zhàn)[3]。

結核分枝桿菌每年使全球數(shù)以百萬計的人口罹患結核病,而結核病在全球?qū)е滤劳龅母腥拘约膊≈信琶诙?僅次于人類獲得性免疫缺陷綜合征[4]。結核性胸膜炎是僅次于淋巴結結核的最常見的肺外結核病，常伴有胸腔積液的產(chǎn)生，但因產(chǎn)生胸腔積液的原因復雜，如惡性腫瘤、肺炎、結核病、免疫系統(tǒng)疾病、肺栓塞、心衰、肝腎疾病等[5-6]，使胸腔積液的歸因診斷艱難。目前,結核性胸膜炎的確診依賴于胸腔積液、胸膜組織涂片或培養(yǎng)以發(fā)現(xiàn)結核分枝桿菌，或者胸膜活檢病理發(fā)現(xiàn)典型的結核肉芽腫，但陽性檢出率均較低；通過單純的胸腔積液分析,只有約1/3 的結核性胸腔積液(tuberculous pleural effusion,TPE)可以確診[7]。因此，需要探尋新的實驗診斷方法以提高臨床診斷水平。眾所周知,TPE中有著很高的蛋白質(zhì)濃度，有學者認為可能是結核分枝桿菌的感染引起機體發(fā)生遲發(fā)型超敏反應，刺激機體產(chǎn)生的特異性免疫蛋白。盡管國內(nèi)外已經(jīng)有很多關于胸腔積液蛋白質(zhì)組學的研究報道,但是TPE與非結核性胸腔積液中蛋白質(zhì)種類及含量的差異以及它們在胸腔積液鑒別診斷中的作用仍不是很清楚。筆者對目前常用的蛋白質(zhì)組學相關技術及近年來關于結核病及TPE蛋白質(zhì)組學的研究綜述如下。

一、蛋白質(zhì)組學研究技術進展

目前，蛋白質(zhì)組學研究的三大基本支撐技術為:雙向電泳技術(two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)、計算機圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術以及表面增強激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜(surface-enhanced laseresorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)。通過2-DE將蛋白質(zhì)進行分離純化，再通過質(zhì)譜鑒定電泳圖譜得到參數(shù)，便可找到與參數(shù)對應的蛋白質(zhì)。1975年O’Farrell[8]建立的雙向凝膠電泳技術是最經(jīng)典的蛋白質(zhì)組學技術，雙向熒光差異凝膠電泳是改良的凝膠電泳技術，該技術克服了雙向凝膠電泳技術無法消除不同圖譜間差異的局限性，增強了結果的可重復性和可靠性[9]。但是該技術具有操作復雜和敏感度不高的缺點，且對分子量過小、極酸性和極堿性蛋白的分離較為困難，是其技術瓶頸。20世紀80年代末 Fenn等[10]和Tanaka等[11]發(fā)明的質(zhì)譜分析方法大大推動了蛋白質(zhì)組學的發(fā)展，近年來發(fā)展的SELDI-TOF-MS是新興的蛋白質(zhì)組學研究技術，它可直接檢測原始樣品，具有高通量、高敏感度和高特異度的特點[12-13]，但不能對檢測出的蛋白質(zhì)進行直接鑒定，所以還有待進一步發(fā)展。此外，鳥槍法蛋白質(zhì)組學技術的發(fā)展，彌補了傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學技術的缺陷，并逐漸成為蛋白質(zhì)組學主流技術[14-15]，該方法不需要雙向凝膠分離過程，其顯著優(yōu)點是可以利用液相色譜將混合物各組分濃縮至很小體積，直接進入質(zhì)譜檢測，提高了檢測的敏感度和動力學范圍，其原理簡單、操作方便和重復性好，可用于各種蛋白質(zhì)混合物的蛋白質(zhì)組學分析，如細胞、組織和各種體液等，因此，該方法一經(jīng)出現(xiàn)便蓬勃發(fā)展起來。

二、結核性與相關鑒別疾病的胸腔積液蛋白質(zhì)組學的研究進展

目前，主要是基于凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)組學技術篩選出差異性表達蛋白，這些蛋白質(zhì)為篩選結核病特異性標志物及深入研究其發(fā)病機制提供了重要信息。

(一)TPE與其他疾病所致胸腔積液的蛋白質(zhì)組學研究

國內(nèi)外關于TPE與其他疾病所致胸腔積液的蛋白質(zhì)組學研究不少。林全等[16]應用2-DE、SELDI-TOF-MS技術分析肺癌(20例)、結核性胸膜炎(10例)患者的胸腔積液，結果顯示，肺癌性胸腔積液中表達增高2倍的差異蛋白質(zhì)點52個，降低50%的蛋白質(zhì)點60個。有9個點僅在TPE中表達，11個點僅在肺癌性胸腔積液中表達，并通過肽指紋圖譜分析成功鑒定了6個蛋白質(zhì)。肺癌性胸腔積液組與TPE組的雙向電泳結果顯示蛋白表達圖譜有明顯差異，這些差異蛋白可能是肺癌相關蛋白或肺癌特異性蛋白標志物。Wang 等[17]應用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)技術分析肺癌(10例)、結核性胸膜炎(6例)和肺炎(4例)患者的胸腔積液和血清，發(fā)現(xiàn)20種差異表達蛋白，并鑒定出16種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)與鐵代謝、炎癥免疫反應及凝血機制等相關，其中血紅素結合蛋白、纖維蛋白原-γ和甲狀腺素運載蛋白在TPE及血清中呈低表達，血清淀粉樣P成分在TPE中呈高表達，但在血清樣本中未見差別，JMJD5蛋白在惡性胸腔積液、肺癌組織及癌細胞中呈低表達，上述蛋白質(zhì)有望成為鑒別結核性與癌性胸腔積液的候選標志物。該研究結果還提示，胸腔積液聯(lián)合血清檢測有可能成為一種有價值的研究工具，但需要大樣本臨床試驗加以驗證。Zhang 等[18]在2015年通過對20例TPE、17例惡性胸腔積液、13例漏出液進行2-DE、MALDI-TOF-MS和指紋圖譜分析，隨后通過美國國立生物技術信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫分析差異蛋白，結果發(fā)現(xiàn)5個特征性蛋白：補體C1抑制物(C1-INH)、甲狀腺素運載蛋白(TTR)、補體C3b、銅藍蛋白(CP)、Z34c蛋白碎片F(xiàn)c(Z34c-Fc)。其中C1-INH在TPE中呈高表達，在惡性胸腔積液中低表達，TTR、C3b則相反。綜合上述的各種研究，其方法均使用經(jīng)典的蛋白質(zhì)組學實驗方法并輔以先進的鑒定技術，但各項研究所鑒別出來的“特異蛋白”的數(shù)量和種類不盡相同。使許多有意義的蛋白未予發(fā)現(xiàn)。歸納重復性欠佳的原因，可能有以下原因：(1)樣本量少；(2)樣品處理方法不盡相同；(3)軟件分析存在一定的主觀性。但這些前期資料的積累，為日后此方面蛋白質(zhì)組學的研究提供了重要基礎。如何解決重復性低的問題，是今后研究TPE特異蛋白的重要攻克目標。

(二)良性與惡性胸腔積液的蛋白質(zhì)組學研究

雖然很多良性與惡性胸腔積液同為滲出液，但治療方法及預后相差甚遠，惡性胸腔積液常常成為TPE鑒別時首先想到的疾病。肺癌作為一種較為常見但預后欠佳的呼吸系統(tǒng)惡性疾病，其引起的惡性胸腔積液與其他疾病引起的良性胸腔積液的早期鑒別顯得尤為重要。直接對肺癌患者和良性疾病患者的胸腔積液進行蛋白質(zhì)表達差異分析，是通過非損傷途徑識別腫瘤標志物的更佳途徑，其敏感度及特異度明顯優(yōu)于血漿和血清途徑檢測[19]。Li等[20]運用納米液相色譜分析，通過對非小細胞肺癌和TPE的對比研究，發(fā)現(xiàn)了白介素-1α在非小細胞肺癌組高度表達，并通過酶聯(lián)免疫吸附細胞法鑒定證實，對非小細胞肺癌所致胸腔積液的蛋白質(zhì)組診斷有著重大價值。除此之外，對惡性胸腔積液整體的蛋白質(zhì)組研究也有不少。侯偉健等[21]進行了肺癌與良性胸腔積液蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜差異分析，結果顯示兩種胸腔積液電泳圖譜平均匹配點數(shù)為(286±14)和(298±21)，匹配率87.7%和86.9%，差異蛋白質(zhì)點82個，其中37個在肺癌胸腔積液中高表達，24個在肺癌胸腔積液中低表達；有17個點僅在良性胸腔積液中表達，4個點僅在肺癌胸腔積液中表達，表明二者存在一些表達差異蛋白質(zhì)，其中有的為潛在的惡性胸腔積液特異蛋白，但未能鑒別為何種蛋白。岳倩宇等[22]在2014年同樣對結核性、惡性和漏出性胸腔積液的相關蛋白質(zhì)進行二維凝膠電泳圖譜識別、鑒定，發(fā)現(xiàn)甲狀腺素三級結構A鏈和補體C3b在惡性胸腔積液中高表達，在漏出液中低表達。以上研究均表示在惡性胸腔積液與良性胸腔積液(包括各種原因引起的的滲出液、漏出液)中，可通過蛋白質(zhì)組學技術分析出差異蛋白。但筆者認為，良性胸腔積液的定義范圍較廣，通過蛋白組學鑒別難以獲得技術支持，故此實驗并不能作為最重要的鑒別診斷項被采納。但上述實驗依舊能為結核性與惡性胸腔積液的蛋白質(zhì)組學研究提供線索。滲出性胸腔積液與漏出性胸腔積液生成的機制不同，內(nèi)含蛋白的數(shù)量和種類也不相同，鑒別相對容易，而各種滲出性胸腔積液間的鑒別診斷就比較艱難，因此TPE在蛋白質(zhì)組學分析上應側重于與其他疾病導致的滲出液作對比。

(三)結核性胸腔積液與血清相關蛋白質(zhì)組學研究進展

有文獻[23]報導，采用弱陽離子交換蛋白質(zhì)芯片(WCX2)處理分析樣本、應用SELDI-TOF-MS技術，以蛋白質(zhì)/多肽質(zhì)荷比(m/z)區(qū)分不同的蛋白質(zhì)/多肽，對5例結核性胸膜炎患者血清與胸腔積液蛋白質(zhì)組進行描述性分析，結果顯示：(1)在5例患者血清中檢測到134種血清蛋白質(zhì)/多肽，其中76種在胸腔積液中未出現(xiàn)：在5例患者胸腔積液中檢測到269種蛋白質(zhì)/多肽，其中211種在血清中未出現(xiàn)。(2)在5例患者血清中均檢測到m/z分別為2660、3191、4208、5903、7764、9287等6種蛋白質(zhì)/多肽；在5例患者胸腔積液中均檢測到m/z分別為2416、2660、2900、2940等4種蛋白質(zhì)/多肽；在5例患者血清和胸腔積液中均檢測到m/z為2660的蛋白質(zhì)/多肽。該研究結果還顯示：TPE蛋白質(zhì)/多肽種類約為血清蛋白質(zhì)/多肽的2倍，這就充分證明TPE并非簡單的胸膜毛細血管滲透液的積聚，由結核分枝桿菌侵襲胸膜所致的病理性蛋白質(zhì)/多肽在TPE的蛋白成份中占有較大的比例，從理論上推測，我們可以從中找到診斷結核性胸膜炎的特異性標志物。有研究表明[24-25]結核病患者有其特定的血清蛋白/多肽指紋譜型。因此，結核性胸膜炎患者的血清蛋白質(zhì)組亦值得深入研究，對其進行深入研究有助于明晰結核性胸膜炎的發(fā)生機制和檢測到診斷標志物。但該研究也提示結核性胸膜炎患者胸腔積液蛋白質(zhì)組遠比其血清蛋白質(zhì)組復雜，又因樣本量小，不能進一步深入研究以探索結核性胸膜炎患者胸腔積液與血清蛋白質(zhì)組學差異問題。 2014年劉志輝等[26]應用SELDI-TOF-MS技術檢測5例結核性胸膜炎患者結核分枝桿菌分離株Middlebrook7H9液體培養(yǎng)早中期(7 d與14 d)培養(yǎng)濾液及患者血清、胸腔積液蛋白質(zhì)組，并進行描述性比較分析，結果顯示，4例患者胸腔積液蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)種類和數(shù)量均多于血清蛋白質(zhì)組，所有患者培養(yǎng)濾液、胸腔積液、血清中均存在相對分子質(zhì)量為2660的蛋白質(zhì)，這初步表明相對分子質(zhì)量為2660的蛋白質(zhì)具備結核性胸膜炎特異性體液蛋白質(zhì)標志物的表征，但尚需大樣本量進一步予以研究證實。2006年Agranoff等[24]首次應用SELDI-TOF-MS技術分析了179份活動性結核病患者和170份非結核病對照組(包括易與結核病混淆的疾病149例及健康對照21例)的血清蛋白指紋圖譜，通過支持向量機獲得最佳分類模型以區(qū)別結核病與非結核病，其敏感度為93.5%，特異度為94.9%，準確度為94.2%。通過支持向量機還獲得由20個具有鑒別意義質(zhì)譜峰構成的分類模型， 其診斷準確度達到90%，應用MALDI-TOF-MS技術鑒定其中2個具有意義的標志物，其中血清淀粉樣物質(zhì)A蛋白是在結核病中呈高表達的陽性蛋白標志物，且是急性期蛋白質(zhì)，是許多炎癥反應性疾病(包括結核病)處于活動期的標志物；甲狀腺素運載蛋白是在結核病中呈低表達的陰性蛋白標志物，目前已被研究者證明存在于結核病患者的血清、胸腔積液和腦脊液中，其潛在價值及與結核病的相關性值得深入研究。

三、胸腔積液蛋白質(zhì)組學研究的展望

胸腔積液蛋白質(zhì)組學研究為結核性胸膜炎的診斷帶來了新的思路和廣闊的應用前景，但目前該方向研究還具有一定的局限性，一方面，研究對象中對照組病例(包括易與結核病混淆的疾病及健康對照)需要慎重選擇，臨床上常選擇與結核性胸膜炎相似的疾病進行鑒別，因此在尋找胸腔積液蛋白標志物時，需謹慎地進行實驗對象設計，將所有可能混淆的疾病都列入比較， 是疾病標志物研究成功的關鍵；另一方面，雖然國內(nèi)外此方面研究不少，但受限于諸多因素，實驗方案設計不盡完善，如僅使用一種pH范圍IPG膠條和一種蛋白質(zhì)捕獲芯片進行體液蛋白質(zhì)組研究而未能研究其蛋白質(zhì)“全譜”；再有樣品中往往90%的蛋白質(zhì)是高豐度蛋白，如白蛋白、免疫球蛋白等，這些高豐度蛋白影響到分子量相似的低豐度蛋白的檢測[27]，許多低豐度蛋白含量極微，為pg級，而正是一些種類繁多、性質(zhì)各異的低豐度蛋白和相對分子質(zhì)量較小的蛋白，能帶給我們十分重要的信息，而應用雙向電泳研究血清蛋白質(zhì)組可能未考慮高豐度蛋白的去除對低豐度蛋白檢出的嚴重影響，因此蛋白質(zhì)樣品制備是蛋白質(zhì)組研究的第一步，無論后續(xù)采用怎樣的分離或鑒定手段，樣品制備都是關鍵步驟[28-30]，隨著蛋白質(zhì)組學樣品處理技術的突破性發(fā)展，將會推動雙向凝膠電泳分離技術和質(zhì)譜鑒定技術在蛋白質(zhì)組學研究中發(fā)揮更顯著的作用[31]。當前對結核病血清、胸腔積液、腦脊液、結核分枝桿菌分泌蛋白等蛋白質(zhì)組學的研究僅停留在整體性描述階段，對初現(xiàn)曙光的目標蛋白質(zhì)尚缺乏深入研究(如蛋白質(zhì)來源、蛋白質(zhì)鑒定、生物學特性研究等)；而且許多研究所取得的成果往往缺乏大規(guī)模的臨床應用來驗證，小規(guī)模蛋白質(zhì)組學實驗獲得的候選標志物，必須經(jīng)過更大的樣本驗證，才能確定哪些變化是TPE所特有。

綜上所述，目前所采用的蛋白質(zhì)組研究技術主要集中在SELDI-TOF-MS和基于凝膠電泳的傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學技術，這些技術都存在自身的局限性，相對具有技術優(yōu)勢的鳥槍法蛋白質(zhì)組學研究還比較少。但是，隨著蛋白質(zhì)組學的不斷發(fā)展，這些前期的不斷嘗試與探索，逐漸會彌補自身所存在的不足，不斷發(fā)展為高分辨率、高敏感性和高通量的蛋白質(zhì)組學技術，將會有越來越多的胸腔積液蛋白質(zhì)標志物被發(fā)現(xiàn)，胸腔積液蛋白質(zhì)組學的研究必將會為結核性胸膜炎診治方面發(fā)揮重要作用。

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(本文編輯：孟莉 范永德)

The present situation and progress of proteomics in the diagnosis of tuberculouspleural effusion

HUANGDi-xi,TANShou-yong.

Divisionoftuberculousis，GuangzhouChestHospital,StateKeyLaboratoryofRespiratoryDiseases,Guangzhou510095,China

TANShou-yong,Email:tanshouyong@163.com

The rapid development of proteomics has provided technical and theoretical basis to study more rapid, accurate and simple method of tuberculous pleural effusion.This article reviewed the current mainstream of techniques for the proteomics and the proteomic research of the tuberculosis and tuberculous pleural effusion in recent years.The analysis indicates that the special protein only expressed in tuberculous pleural effusion have not been found so far.However,the difference protein can be analyzed from TB patients serum and pleural effusion to the control group.From these difference proteins, the tuberculous pleurisy related specific proteins will be found by the protein mass spectrometry analysis.Furtherly we hope to seek found e new tuberculous pleurisy diagnostic markers.

Proteomics； Pleural effusion； Tuberculousis/Diagnosis

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.03.005

廣州市科技計劃項目(2014Y2-00117)

510095廣州市胸科醫(yī)院肺結核科 呼吸疾病國家重點實驗室[黃迪希(廣州醫(yī)科大學在讀研究生)、譚守勇、劉志輝]

譚守勇，Email：tanshouyong@163.com

2015-12-23)