孫琳 申阿東

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代謝組學在結核病診療和病原學研究中的應用

孫琳 申阿東

代謝組學作為對機體的動態(tài)代謝狀態(tài)進行定量測定的技術，可用于對代謝譜和代謝通路動態(tài)的分析、尋找疾病相關的生物標志物、測定機體內藥物引起的代謝改變、探尋疾病發(fā)病機制。近年來，代謝組學已開始被應用于結核病的診斷、治療、病原學、發(fā)病機制等方面的研究中。因此，作者對代謝組學在結核病診療和病原學研究領域的進展進行綜述，并初步探討其在臨床應用和研究中的重要意義。

代謝組學； 結核病； 診斷； 治療； 發(fā)病機制

結核病是由Mtb感染引起的傳染性疾病。Mtb作為一種細胞內寄生菌，可通過影響宿主細胞的代謝進而導致宿主的器官、組織及各系統(tǒng)出現代謝紊亂。作為一種慢性消耗性疾病，結核病患者往往表現為能量和代謝失衡，即分解代謝加強、能量消耗增高，如蛋白質分解代謝增強、胸腔積液、腹腔積液導致的蛋白質丟失等均會導致機體出現負氮平衡。代謝物作為生物體功能的中間產物和終末產物，可直接反映機體基因和蛋白質水平的變化，病理及外界刺激等因素導致的生理改變[1]。近年來，代謝組學逐漸被用于結核病的研究中。筆者對代謝組學在結核病的診斷、治療、病原學、發(fā)病機制方面的研究進行綜述，初步探討其在結核病研究中的重要意義。

代謝組學在結核病診斷和治療中的應用

一、結核病新型診斷標記物的篩選研究

結核病的有效控制有賴于疾病的早期發(fā)現和診斷。而目前結核病的診斷面臨著一系列的困難，包括Mtb的培養(yǎng)周期長、抗酸染色的敏感度低等問題。為了彌補上述方法的不足，已有研究者采用代謝組學技術，通過篩選出的特異性代謝產物建立結核病診斷的新方法。國內外多個研究團隊分別采用磁共振成像(MRI)技術、氣相色譜-飛行時間質譜聯用技術(GC-TOF MS)、超高效液相色譜-質譜儀聯用技術(UPLC-MS)等對活動性結核病患者血清、血漿等體液標本的代謝譜進行分析[2-6]。其研究策略除了選取有統(tǒng)計學差異的代謝物建立診斷模型，并評價其診斷準確性[計算診斷指標的敏感度和特異度、受試者工作特征曲線(ROC曲線)下面積等]外，還包括通過旁路分析和富集分析獲得結核病患者出現紊亂的代謝通路。例如，有學者研究發(fā)現，結核病患者在氨基酸、脂質分解代謝和糖酵解途徑出現不同程度的紊亂[2-3]；將代謝物濃度與疾病亞型進行分析，發(fā)現了可能與結核病患者肺組織的病理損傷相關的血清代謝物等[4]。由此可見，代謝組學在結核病診斷中具有很好的潛在價值。上述研究對于深入理解疾病的發(fā)病機制及建立新的結核病診斷方法均具有很好的臨床意義。

代謝組學可以對組織和循環(huán)系統(tǒng)中不同生理和病理狀態(tài)下相對分子質量小于1000的內源性小分子代謝物的變化進行檢測。這些代謝物在血液、尿液等體液標本及組織中化學性質較穩(wěn)定，可被多種方法檢測到。通過代謝組學技術平臺獲得結核病患者的代謝譜，不僅有助于篩選潛在的診斷標記物，而且對于明確疾病的進程、病情的發(fā)展變化可能均有一定的指示作用。

二、抗結核藥物治療的評價研究

早期治療并合理用藥是治療結核病的關鍵。代謝組學可通過檢測藥物所引起的內源性代謝物的變化，以及通過藥代動力學研究，直觀地反映生物體在藥物治療過程中所出現的生理生化等變化，從而評價藥物的臨床治療效果和安全性。代謝組學還可用于檢測特定藥物的代謝產物在患者體內的水平變化，并在臨床癥狀和體征出現前及早監(jiān)測藥物毒性反應等，從而及時調整用藥方案，有助于減少藥物不良反應。代謝組學已開始應用于腫瘤的治療和中藥的治療效果評價中[7-11]，在結核病中的研究仍然較少。Mahapatra等[12]通過分析不同治療階段患者體內的代謝譜變化，來監(jiān)測隨治療時間而出現濃度改變的代謝物，明確結核病患者對抗結核藥物的反應，以及監(jiān)測抗結核治療的臨床效果。在新藥研發(fā)研究中，Shimokawa 等[13]將碳核素標記的藥物與血漿共培養(yǎng)，通過代謝組學檢測藥物的代謝和降解產物，從而有助于明確溫度、pH值等因素對藥物代謝的影響，以及確定藥物在血漿中的半衰期、中間和終末代謝產物及其分子結構。另一項研究對藥物敏感的結核病患者治療前后的血漿代謝譜和外周血RNA表達情況進行分析，初步了解了機體內與結核病易感或抗結核藥物治療相關的固有免疫因素[14]。

代謝組學在Mtb細菌學研究中的應用

一、Mtb的病原學研究

代謝組學已被用于Mtb的鑒定、生長、增殖、免疫逃逸等方面的研究中。例如，在病原學診斷方面，采用代謝組學技術獲得不同病原菌的代謝譜，并通過代謝譜的差異建立診斷模型，將Mtb同其他菌株區(qū)分開來，從而達到菌種鑒定的目的[15-16]。在Mtb免疫逃逸研究方面，Chuang 等[17]發(fā)現與Mtb在宿主體內潛伏相關的關鍵酶外切聚磷酸酶可導致Mtb生長受限和代謝水平降低，其功能缺陷可改變Mtb細胞膜的通透性、增加其對抗生素的耐受性，從而抵抗抗生素的殺滅作用。在Mtb生長增殖研究方面，Loots du[18]發(fā)現，由于rpoB基因突變導致了Mtb的mRNA不穩(wěn)定性，進而使其能量產生和代謝障礙，最終影響細菌的生長。

二、Mtb與宿主相互作用機制研究

疾病的發(fā)生發(fā)展是感染的病原菌與宿主相互作用的結果。Mtb作為細胞內寄生菌，通過宿主-病原體相互作用導致宿主的能量和蛋白質代謝等的變化[19-20]，從而導致疾病或者炎癥的發(fā)生。代謝組學逐漸被應用于研究Mtb和宿主免疫系統(tǒng)的相互適應性改變[21]和Mtb誘導的宿主免疫細胞應答等[22]。Singh等[22]對Mtb特異性抗原早期分泌靶蛋白6 (ESAT-6)影響宿主巨噬細胞表型分化進行了研究。該研究將細胞穩(wěn)定狀態(tài)的代謝物濃度與數學模型相結合，對糖酵解途徑的反應速率進行預測和評估，有助于深入了解Mtb誘導巨噬細胞表型分化的機制。

三、Mtb藥物作用機制研究

明確抗結核藥物的作用靶點或代謝通路有助于研究抗結核藥物的治療機制和為Mtb的耐藥機制提供新證據。體外實驗研究常選用碳核素示蹤法，將標記的體內小分子與Mtb共培養(yǎng)，通過監(jiān)測碳核素在代謝通路中的“流動”而追尋抗結核藥物可能的藥物作用靶點[23]。另外，代謝組學技術在Mtb耐藥的影響因素分析等方面也具有一定的應用價值，將利福平耐藥、rpoB基因突變、Mtb的RNA聚合酶β亞基與脂肪酸代謝改變聯系起來，將藥理研究與代謝組學進行結合，從而有助于進一步了解Mtb的耐藥機制[24]。在耐藥機制方面的研究較多，Loots du[25]從代謝的視角揭示了katG基因的突變在Mtb耐藥中的作用；Berney等[26]首次發(fā)現了Mtb無法清除宿主體內蛋氨酸和S-腺苷甲硫氨酸的中間代謝產物，從而導致細胞死亡的機制，為尋找快速殺滅Mtb的藥物靶點提供了思路。

代謝組學研究的常用分析平臺及發(fā)展的新策略

一、高通量代謝物檢測平臺

代謝組學的研究需要高通量代謝物檢測技術和生物信息學技術的有機結合。目前常用的高通量代謝物檢測平臺主要有液相與質譜聯用技術(LC-MS)、氣相與質譜聯用技術(GC-MS)、MR分子成像。LC-MS和GC-MS方法為集色譜高分離能力與質譜高敏感度和高選擇性于一體的分離分析方法，具有敏感度高、樣本選擇范圍廣、可對樣本進行定性和定量分析等優(yōu)點，但缺點在于樣本需要前處理和離子化、可供確定化合物結構的數據庫有限、具有基質效應等。MR分子成像特點在于檢測速度快、對樣本無破壞性、樣本處理簡單、進樣量少、重復性好、成本低等特點，但缺點在于敏感度低、樣本選擇范圍小于LC-MS和GC-MS方法、檢測動態(tài)范圍有限、無法進行定量分析等。目前，上述3種檢測平臺各有優(yōu)缺點，將上述方法有機結合、優(yōu)勢互補可有助于更全面的分析樣品的代謝物組成變化，也是當前研究的一個發(fā)展趨勢。

二、生物信息學數據分析平臺

通過檢測平臺獲取的復雜數據需借助后續(xù)的生物信息學平臺進行分析和解讀，從而進一步揭示海量信息中蘊含的生物學意義。常用的分析方法包括主成分分析(PCA)法、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交信號校正技術偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)等。代謝組學檢測到的是海量的多維數據，通過生物信息學分析，不僅可以有效簡化數據結構、對未知代謝物進行鑒定、尋找用于疾病診斷的生物標記，而且可通過對代謝物的相關代謝通路進行篩查，進一步深入探討差異代謝產物在機體代謝中的潛在作用。

三、代謝組學與其他技術平臺整合的系統(tǒng)生物學研究模式

在后基因組時代，隨著實驗技術和計算機技術的整合和發(fā)展，讓我們對疾病的認識有了一個根本的轉變和提升，同時也促進了對疾病代謝網絡的研究。系統(tǒng)生物學方法的核心是將各種組學數據整合并建立數學模型、實驗驗證、模型的優(yōu)化等。結核病系統(tǒng)生物學研究的最終目的在于系統(tǒng)地分析宿主和病原體在感染過程中的相互作用，從整體和系統(tǒng)的角度全面分析疾病的發(fā)生發(fā)展機制。代謝組學作為繼基因組學、蛋白質組學、轉錄組學之后新興的系統(tǒng)生物學技術，將代謝組學與其他組學方法有機結合，建立系統(tǒng)的、綜合水平的分析模型，有助于綜合分析各種組分的交互作用，進一步加深我們對疾病的認識。

通量平衡分析(flux balance analysis,FBA)和代謝通量分析(metabolic flux analysis，MFA)作為結核病系統(tǒng)分析的模型之一，已被成功用于研究原核細胞在不同環(huán)境中的代謝狀態(tài)。MFA為用計量矩陣模型模擬穩(wěn)態(tài)下細胞內代謝反應的一種定量分析方法，可以對代謝特性進行精確的定量，從而有助于明確遺傳和環(huán)境因素對生物的影響，以及對代謝的特定通路進行準確的分析。目前，MFA被用于分枝桿菌菌酸的代謝研究和尋找潛在的藥物靶標[27]，以及將蛋白質組學與MFA進行整合研究細胞的代謝網絡等[28]，以及采用改進的通量分析方法E-Flux-MFC研究環(huán)境和遺傳因素通過基因表達進而對機體代謝的影響[29]。

Vashisht 等[30]在Mtb代謝組學和基因組學的基礎上，建立了新型的代謝系統(tǒng)生物學圖譜(systems biology spindle map of metabolism，SBSM)，并將其應用于尋找和預測藥物靶標。研究者通過Mtb代謝系統(tǒng)生物學圖譜的結果和代謝動力學建立模型，明確與Mtb生長和生存相關的關鍵基因，并對其藥物作用的可能靶點進行預測。該研究將為新藥的研發(fā)提供新的思路。Ma等[31]通過建立全基因水平的代謝調節(jié)代謝模型(probabilistic regulation of metabolism，PROM)，將Mtb參與基因調節(jié)的轉錄因子與代謝通路進行整合，用于模擬和預測轉錄因子敲除或過表達所引起的細胞代謝及生長狀態(tài)的改變，從而有助于發(fā)現新的藥物靶點，提高抗結核藥物治療效果。

展 望

代謝組學作為一種新型系統(tǒng)生物學研究方法，優(yōu)勢在于：(1)生物體基因和蛋白質層面的變化可通過下游的諸多代謝產物得以放大，從而使得這些變化更容易被檢測到[32]； (2)可最直觀地反映特定時間點上生物體內細胞的代謝狀態(tài)[33-34]；(3)代謝物的種類遠小于基因和蛋白質的種類[35]；(4)疾病的發(fā)生是機體蛋白質網絡、基因調節(jié)網絡和內環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡所致，小分子的產生和代謝是這一系列變化的最終結果，可以最直接地反映機體的病理生理狀態(tài)；(5)可對代謝產物進行準確的特征描述和精確定量[36]；(6)所需樣本量少，且樣本的預處理步驟簡單、易操作[37]。

代謝組學采用高通量、高精確度的分析技術，對代謝產物進行精確的定量定性分析，從中篩選出具有統(tǒng)計學意義的潛在生物標記物，并將這些代謝信息與機體的生化反應、調控因素等信息進行有機結合，從而有助于研究者更好地了解環(huán)境和遺傳因素對生物系統(tǒng)的影響。目前，代謝組學在結核病領域的研究工作仍然存在一定的困難和挑戰(zhàn)。例如，如何對代謝產物進行全面分析，并從所檢測到的眾多候選代謝物中篩選出具有診斷價值的生物標記物仍是當前代謝組學的難題；如何與現有的診斷方法進行結合，有效地彌補現有診斷方法的不足；如何將不同的分析技術和信息生物學技術有機結合，優(yōu)勢互補，從而更好地詮釋代謝物所傳達的各種生物信息等。隨著今后檢測和分析手段的日益完善，代謝組學將極大地推動結核病的診斷、治療及病理機制等的研究。

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(本文編輯：王然 李敬文)

Application of metabonomic technology in tuberculosis

SUNLin,SHENA-dong.

KeyLaboratoryofMajorDiseasesinChildrenandNationalKeyDisciplineofPediatrics(CapitalMedicalUniversity),MinistryofEducation,BeijingKeyLaboratoryofPediatricRespiratoryInfectionDiseases,BeijingPediatricResearchInstitute,BeijingChildren’sHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100045,China

SHENA-dong,Email：shenad16@hotmail.com

Metabolomics, which is defined as the new quantitative measurement of the dynamic metabolic changes, has been used to analyze the metabolic profiling or network, detect the latent disease-associated biomarkers, characterize the metabolic response to a drug, or uncover the pathogenesis of different diseases. Recently, metabolomics techniques have been applied on several fields, including diagnosis, treatment, etiology and pathogenesis. This paper summarizes the research trends in diagnosis, treatment and etiology of tuberculosis and analyzed the significance of the metabolomics techniques in the process of its clinical application and research work.

Metabolomics; Tuberculosis; Diagnosis; Treatment; Pathogenesis

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.03.004

國家科技重大專項(2013ZX10003003-004)；國家自然科學基金(81200064)；北京市重點實驗室開放課題(2014NYJH02)

100045 首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院呼吸感染疾病研究室 北京市兒科研究所兒科學國家重點學科 教育部兒科重大疾病研究重點實驗室 兒童呼吸系統(tǒng)感染性疾病研究北京市重點實驗室

申阿東, Email：shenad16@hotmail.com

2015-10-16)