王蕾 賀靜 朱寶生

(云南省第一人民醫(yī)院遺傳診斷中心、云南省出生缺陷與遺傳病重點實驗室，云南 昆明 650032)

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單基因遺傳病分子診斷的新策略和新方法

王蕾 賀靜 朱寶生*

(云南省第一人民醫(yī)院遺傳診斷中心、云南省出生缺陷與遺傳病重點實驗室，云南 昆明 650032)

單基因遺傳病具有復雜的表型異質(zhì)性及遺傳異質(zhì)性，基因突變可涉及點突變、片段缺失/重復、整個基因的缺失/重復、以及動態(tài)突變等眾多類別。分子診斷技術(shù)使得單基因遺傳病可在分子水平乃至單個堿基發(fā)生變異的情況下做出準確診斷，然而其可靠性問題成為備受矚目的技術(shù)難點。針對不同遺傳病使用不同的解決方案，是目前單基因遺傳病分子診斷的主流思想。基因診斷相關(guān)人員不僅要了解遺傳疾病致病基因及其突變特點，還要熟知各種檢測技術(shù)的特點，合理選擇。

單基因遺傳??；分子診斷；雜交；擴增；測序

單基因遺傳病(monogenic disorders)是由位于同源染色體上的一對等位基因之一或者二者發(fā)生突變，導致蛋白結(jié)構(gòu)信息錯誤或基因表達控制異常而出現(xiàn)的身體結(jié)構(gòu)發(fā)育異常和/或生理功能異常，該類疾病一般符合孟德爾遺傳方式，所以，又稱為孟德爾遺傳病(mendelian inherited diseases)[1]。大多數(shù)單基因遺傳病是罕見病，其中每一種在全球人口中的平均發(fā)生率在1/10 000～1/100 000[2]，多則在數(shù)千個新生兒中出現(xiàn)一例，少則數(shù)十萬新生兒中出現(xiàn)一例；但對局部地區(qū)或者來自某些地區(qū)的特定人群而言，某些單基因遺傳病的平均發(fā)生率可能高達1%～2%，如在東南亞和云南南部的某些少數(shù)民族中，地中海貧血和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的發(fā)生率就高達2%以上[3]。由于單基因遺傳病種類眾多，故即使每種疾病的患者不多，但總體受累人群卻不容小覷。據(jù)可靠估算，單基因遺傳病在全球人口中的發(fā)生率約為1%[4]，給千萬個家庭及患者帶來極大的精神負擔和經(jīng)濟負擔。

1976年，美籍華裔科學家簡悅威成功應用液相DNA分子雜交技術(shù)實現(xiàn)了鐮形細胞貧血癥的基因診斷[5]，是人類遺傳病診斷開始進入分子診斷時代的里程碑。繼形態(tài)學、生化學及免疫學診斷技術(shù)后，分子診斷飛速發(fā)展，該技術(shù)使得遺傳病可在分子水平乃至單個堿基發(fā)生變異的情況下做出準確診斷。不僅可為患者提供可靠診斷，還可為表型正常的攜帶者提供遺傳咨詢。大致可分為分子雜交檢測技術(shù)、基因擴增檢測技術(shù)和基因測序技術(shù)三大類。

1 分子雜交檢測技術(shù)

分子雜交檢測技術(shù)是通過已知基因序列的探針對靶序列進行特異性的捕獲檢測。主要技術(shù)有斑點雜交(dot blot, DB)、反向斑點雜交(reverse dot blot, RDB)、Southern印跡、Northern印跡、Western印跡、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、基因芯片(gene chips)等。

1.1 反向斑點雜交(RDB) Saiki等[6]于1989年最早發(fā)明RDB技術(shù)，并證實該技術(shù)在突變檢測中的確定性。1999年，Chan等[7]將該技術(shù)應用于中國人群αCSα、αQSα、αCD59α和αCD30α4種非缺失型α-地中海貧血的突變檢測。RDB法為目前臨床常用的常規(guī)檢測方法，原理是將一系列可與疾病相關(guān)等位基因雜交的特異性寡核苷酸探針排列在尼龍膜上，經(jīng)擴增、雜交、洗脫及顯色，最后判讀受檢樣品是否攜帶與膜上探針雜交的基因突變。其優(yōu)點在于可在一張雜交膜上同時檢測樣品中多種點突變，結(jié)果可靠、可重復性好、靈敏度高，且檢測時所耗樣品量少、經(jīng)濟方便，尤為適用于基因分型、已知基因序列的突變檢測。缺點是膜條制備時間長，雜交操作繁雜、很難進行大批量檢測。

1.2 熒光原位雜交(FISH) 1977年，Rudkin[8]發(fā)明了FISH技術(shù)，在原位雜交技術(shù)的基礎上使用熒光素取代同位素標記探針，更安全、快速、準確、靈敏，且探針標記更穩(wěn)定，能同時顯示多色，不但能對中期分裂相進行分析，還能顯示于間期核中。其基本原理遵循堿基互補原則，將熒光標記的已知探針與受檢樣品DNA進行雜交，通過檢測熒光信號實現(xiàn)受檢樣品DNA的定性、定位分析。FISH技術(shù)自20世紀70年代問世以來已在臨床廣泛應用，由于其直觀性、特異性已成為染色體微缺失/微重復診斷的金標準，在分子領域主要適用于基因定位、腫瘤基因檢測等方面[9]。

1.3 微陣列基因芯片 微陣列基因芯片，簡稱基因芯片，是由千萬個DNA或寡核苷酸探針密集排列在小面積載體表面組成的微點陣列。在一定條件下，載體上的DNA或寡核苷酸探針可與來自樣品中序列互補的核酸片段雜交，通過檢測雜交信號實現(xiàn)樣品DNA序列分析[10]。該技術(shù)具有高通量、高分辨率、微型化、自動化程度高等優(yōu)勢，可用于基因定位、已知突變檢測、DNA測序、遺傳圖譜構(gòu)建等[11]。但存在著芯片制作技術(shù)復雜、檢測應用的芯片掃描儀成本高、檢測數(shù)據(jù)分析難度較高的問題，阻礙了其應用于基層醫(yī)院臨床檢測中。國產(chǎn)的遺傳性耳聾基因檢測芯片目前在臨床上應用較多，它可以同時檢測GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體12S rRNA這4個基因中的9個基因突變熱點，是世界上第一個被批準用于臨床診斷的基因芯片產(chǎn)品。

2 基因擴增檢測技術(shù)

臨床應用最廣泛的單基因遺傳疾病分子診斷技術(shù)是聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)以及其衍生方法。如巢式PCR(nested PCR)、多重PCR(multiplex PCR)、三引物PCR(tri-primer PCR, TP-PCR)、逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)、實時熒光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR, RTFQ-PCR/qPCR)、數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR)[12]、變性高效液相色譜分析(denaturing high-performance liquid chromatograph, DHPLC)[13]、高分辨熔解曲線分析(high-resolution melting curve analysis, HRM)[14]、多重連接依賴探針擴增(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)[15]等?，F(xiàn)今幾乎所有的基因突變檢測技術(shù)都是基于PCR發(fā)展的。

2.1 數(shù)字PCR dPCR是20世紀初發(fā)展起來的新型核酸分子定量檢測技術(shù)，較傳統(tǒng)定量PCR技術(shù)具有更高的準確性、靈敏性及可重復性，可對大量背景分子中的微量模板進行定量分析[12,16]。按分液技術(shù)不同分為三類：微孔板[17]、微流體芯片[18]和微滴式。由于dPCR的本質(zhì)是通過單分子擴增將低豐度的基因信號從復雜背景中提取出來，故在無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中可對受到大量母體背景DNA影響的低含量胎兒游離DNA進行檢測。2010年，Chu等[19]首次將數(shù)字化PCR應用于無創(chuàng)單基因疾病診斷，進行單分子等位基因檢測并通過等位基因比值法推斷胎兒是否受累。Lam等[20]于2012年依據(jù)父源性的遺傳單倍型設計了針對珠蛋白及其外部SNP位點的探針來篩選可提供信息位點，并根據(jù)母源性單倍型將SNP分為α和β兩組，借助dPCR技術(shù)推斷胎兒基因型，成功分析2個β-地中海貧血家系。Tsui等[21]應用dPCR檢測X染色體上的基因位點，在12個樣本中成功檢測出7例發(fā)生血友病基因突變的男胎。

2.2 變性高效液相色譜分析 DHPLC技術(shù)是通過分析異質(zhì)性雙鏈結(jié)構(gòu)從而對DNA序列變異進行篩選。在不變性的溫度條件下可用于分離不同分子量的雙鏈DNA、分析具有長度多態(tài)性的片段；在部分變性的條件下，突變型和野生型分別形成同源雙鏈，同時錯配產(chǎn)生異源雙鏈，由于雜合與純合二倍體在柱中保留時間的差異而在色譜圖中呈現(xiàn)雙峰或多峰的洗脫曲線，以識別突變型[22]。該技術(shù)可分析SNP、檢測單個堿基置換、插入或缺失，具有自動化程度高、敏感性和特異性較高等優(yōu)點。

2.3 高分辨熔解曲線分析 HRM技術(shù)是利用突變型片段與野生型片段加熱變性時熔解曲線形狀和位置的差異，從而區(qū)分突變樣本與正常樣本，不受突變堿基位點及類型的限制，既可掃描擴增片段的未知突變又可進行已知突變的基因分型[23]。該技術(shù)操作便捷、通量高、成本低，且特異性優(yōu)于其他突變初篩技術(shù)，如單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)技術(shù)，適用于單堿基突變及小片段插入、缺失的檢測，但無法準確檢測具體突變[24]。

2.4 多重連接依賴探針擴增 MLPA技術(shù)是荷蘭學者Schouten等[15]于2002年在多重擴增探針雜交(multiplex amplifiable probe hybridization, MAPH)技術(shù)[25]的基礎上改進設計的，其原理是對可與樣本DNA正確雜交并被連接酶連接的探針進行擴增和半定量分析。該技術(shù)融合了DNA探針雜交和PCR技術(shù)，且引入了連接依賴，其優(yōu)越性是特異性高、精確度高、重復性強、操作簡便、通量高?；贛LPA技術(shù)可檢測出若干人類基因拷貝數(shù)的變異，故現(xiàn)已廣泛應用于存在基因缺失/重復突變的人類遺傳疾病的分子診斷，如假肥大型肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne/Becker muscular dystrophy, DMD/BMD)、脊肌萎縮癥(spinal muscularatrophy, SMA)、DiGeorge綜合征(DiGeorge syndrome)等[26]。但遺憾的是該產(chǎn)品至今未申請中國的市場準入，僅能少量用于科研工作，而不能應用于基因診斷和產(chǎn)前診斷。

3 基因測序技術(shù)

基因測序技術(shù)作為現(xiàn)代生命科學研究的核心技術(shù)之一，不僅為遺傳信息的揭示和基因表達調(diào)控的基礎生物學研究提供重要數(shù)據(jù)，而且在疾病基因檢測與分子診斷等臨床應用研究中發(fā)揮著重要作用。

3.1 Sanger測序法 1977年，英國生物化學家Sanger等[27]發(fā)明了雙脫氧鏈末端終止法(dideoxy chain-termination method)，可以檢測物種或細胞的核酸序列，通過與基因庫進行比對分析被檢測物種或細胞的特性。Sanger測序法作為最經(jīng)典的測序方法廣泛應用于基因組DNA、cDNA等多重復序列的檢測。但該技術(shù)通量低、成本高、耗時長。1998年Ronaghi[28]發(fā)明了焦磷酸測序法，其基本原理是利用DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶的協(xié)同作用，檢測引物延伸過程中所釋放的熒光，通過峰值高低判斷與其匹配的堿基數(shù)量。該方法在通量、成本、耗時等方面優(yōu)于Sanger法，廣泛運用于SNP位點、等位基因突變檢測等。但由于遺傳病的異質(zhì)性及較大片段基因的檢測需求，新一代測序技術(shù)應運而生。

3.2 第二代測序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS) 單基因遺傳病具有明確的臨床、生化指征和/或已知突變熱點，則對靶區(qū)域進行Sanger測序可精確高效做出分子診斷；然而篩選未知候選基因是一大難題。同時，利用連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析定位遺傳病致病基因的傳統(tǒng)方法耗時費力，且當家系中受累親屬人數(shù)有限、或疾病遺傳不外顯或外顯不全，亦或是患者為自發(fā)突變，則連鎖分析法難以進行[29]。新興的第二代測序技術(shù)是用內(nèi)切酶將基因組DNA處理成一定長度范圍的DNA片段，然后進行文庫制備并擴增文庫DNA，測序過程可分為兩類：使用DNA聚合酶和熒光標記或H+標記的4種dNTP進行單堿基擴增延伸反應的合成測序；采用DNA連接酶和熒光標記的寡核苷酸探針進行雜交反應的連接測序[30]。NGS可快速進行大量靶基因篩選、人類全外顯子組測序、全基因組測序，通量更高、檢測更快[31]。

3.3 基于NGS技術(shù)的高通量測序檢測

3.3.1 全外顯子組捕獲技術(shù)(whole exome sequencing，WES) 現(xiàn)今已報道的絕大多數(shù)全基因組研究都僅集中在整個基因組序列的2%編碼區(qū)，且大約85%的已知孟德爾遺傳病致病基因都位于蛋白質(zhì)編碼區(qū)域[32]。近年來全外顯子組捕獲技術(shù)的發(fā)展為遺傳病快速診斷創(chuàng)造了條件。2009年，Ng等[33]對4例無親緣關(guān)系Freeman-Sheldon綜合征患者及8例正常個體進行外顯子組捕獲和第二代測序，在世界上首次證實外顯子組捕獲—第二代測序在確定罕見致病基因方面具有可行性和應用價值。隨后Ng等[34]利用相同的方法策略檢測出Miller綜合征的致病基因DHODH，這也是國際上首次成功應用外顯子組捕獲—第二代測序技術(shù)檢出遺傳病的未知致病基因。該技術(shù)所需樣本數(shù)量少、通量高、耗費低，大大推進了人類單基因遺傳病的分子診斷。

外顯子組捕獲集中于外顯子區(qū)域的測序，不能獲得完整的基因組信息，如啟動子區(qū)、增強子區(qū)、microRNAs編碼區(qū)等；其次，外顯子組捕獲過程中存在打斷再拼接，讀長較短將導致大的插缺難以拼接，故DNA結(jié)構(gòu)變異無法檢測；再者，難以檢出位于高度同源區(qū)的變異體，易出現(xiàn)假陽性、假陰性結(jié)果[35]。

3.3.2 分子倒位探針平行測序(MIPs) 分子倒位探針(molecular inversion probes, MIPs)技術(shù)所采用的探針是與基因組靶點互補的單鏈DNA分子，可與基因組靶點雜交并將其捕獲。MIPs探針由兩側(cè)向內(nèi)部共包含7個基本結(jié)構(gòu)[36-38]：位于兩端的2段與目的基因互補的序列；向內(nèi)為2段對所有MIPs通用的PCR引物序列，可視為探針釋放位點，通常還包含一個限制酶切位點；以及一段探針特異性標簽序列和一個限制酶切位點，作為標簽釋放位點。當探針的互補序列與基因組靶點結(jié)合后環(huán)化，在內(nèi)切酶Ⅰ的作用下釋放探針形成倒位序列，然后以通用引物完成靶序列富集，內(nèi)切酶Ⅱ處理釋放Tag標簽序列，進而實現(xiàn)目的基因測序。該技術(shù)具有高通量、高靈敏度、高準確性，目前多重MIPs分析技術(shù)已可在同一體系檢測超過55 000個基因座[36]，適用于大規(guī)模檢測。分子倒位探針平行測序技術(shù)已廣泛應用于SNP分型、拷貝數(shù)變異檢測、等位基因失衡分析等。

單基因遺傳病具有復雜的表型異質(zhì)性及遺傳異質(zhì)性，基因突變可涉及點突變、片段缺失/重復、整個基因的缺失/重復、以及動態(tài)突變等眾多類別，針對不同遺傳病使用不同的解決方案，是目前單基因遺傳病分子診斷的主流思想。隨著分子遺傳學診斷技術(shù)的飛速發(fā)展，基因診斷新技術(shù)將廣泛應用于出生缺陷與遺傳病診斷中。基因診斷相關(guān)人員不僅要了解遺傳疾病致病基因及其突變特點，還要熟知各種檢測技術(shù)的特點，合理選擇。

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編輯：宋文穎

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.03.002

國家自然科學基金(81260415)、云南省衛(wèi)生領軍人才項目(L-201201)

R714.55

A

2016-07-22)

*通信作者：朱寶生，E-mail：bszhu@aliyun.com