李彥騰 程崗 張雷鳴 張劍寧*

(1海軍總醫(yī)院神經(jīng)外科, 北京 100048; 2解放軍醫(yī)學(xué)院研究生二隊(duì), 北京 100853)

·綜述·

微透析技術(shù)在腦膠質(zhì)瘤研究方面的應(yīng)用

李彥騰1,2程崗1張雷鳴1張劍寧1*

(1海軍總醫(yī)院神經(jīng)外科, 北京 100048;2解放軍醫(yī)學(xué)院研究生二隊(duì), 北京 100853)

微透析; 膠質(zhì)瘤; 神經(jīng)遞質(zhì); 細(xì)胞因子類

腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤。由于其呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)和手術(shù)切除后易復(fù)發(fā)等生物學(xué)特性，預(yù)后較差，病死率高，是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。近年來(lái)，隨著科技的進(jìn)步和相關(guān)研究的不斷深入，患者預(yù)后有了一定程度的改善，但遠(yuǎn)未達(dá)到令人滿意的水平。微透析技術(shù)，自1972年Delgado[1]發(fā)明第一根微透析探針以來(lái)，被用于多種研究領(lǐng)域，它是一種新型的在體連續(xù)動(dòng)態(tài)采樣技術(shù)，為腦膠質(zhì)瘤的研究提供了一種新的手段，可以提供多項(xiàng)局部微環(huán)境中物質(zhì)濃度的數(shù)據(jù)，對(duì)膠質(zhì)瘤患者的個(gè)體化治療有很大的指導(dǎo)作用。

一、基本原理和方法

微透析技術(shù)是模擬生物膜的通透作用，小分子物質(zhì)在半透膜兩側(cè)可沿濃度梯度擴(kuò)散的原理設(shè)計(jì)的。它是一種先進(jìn)的活體采樣技術(shù)，可在麻醉或清醒的生物體上，在基本不影響其正常生理生化條件下對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、連續(xù)取樣、分析與檢測(cè)。其具有適用范圍廣，結(jié)果準(zhǔn)確度高，可即時(shí)反饋等優(yōu)點(diǎn)，因此，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于化學(xué)檢測(cè)分析領(lǐng)域。

用于膠質(zhì)瘤研究的腦部微透析系統(tǒng)的構(gòu)成有：微透析探針、微量泵、灌流液、連接管、收集小瓶和立體定位儀等。其中，微透析探針是該系統(tǒng)的核心元件，半透膜管位于探針的頂部。灌流液由微量泵經(jīng)入液管到達(dá)植入膠質(zhì)瘤組織的探針，透過(guò)探針頂部的半透膜與組織間液進(jìn)行物質(zhì)交換后，經(jīng)出液管流出進(jìn)入收集小瓶，之后，再對(duì)流出液進(jìn)行相應(yīng)的定性或定量分析。衡量微透析效率的主要指標(biāo)是探針的回收率，回收率與透析膜面積、灌流速度、透析時(shí)間、溫度、pH值和分析物的跨膜能力有關(guān)[2～4]。另外，微透析系統(tǒng)在用于治療時(shí)，一些化療藥物也可經(jīng)灌流液輸入腫瘤間質(zhì)內(nèi)，到達(dá)間質(zhì)內(nèi)化療的效果。

探針植入時(shí)，需先將受測(cè)者麻醉，然后借助立體定向儀將探針插入待測(cè)的目標(biāo)腦區(qū)，之后連接好微量泵和各個(gè)導(dǎo)管，以恒定流速注入灌流液，最后對(duì)收集液進(jìn)行檢測(cè)。在探針植入后的樣本采集過(guò)程中，受測(cè)者可以自由活動(dòng)。

二、在腦膠質(zhì)瘤研究中的應(yīng)用

微透析技術(shù)與高效液相色譜技術(shù)的結(jié)合，使其應(yīng)用得到了廣泛的推廣。近年來(lái)．一些學(xué)者采用該技術(shù)測(cè)定與腦膠質(zhì)瘤有關(guān)的生化指標(biāo)的變化，以求對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療效果有進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，進(jìn)而指導(dǎo)臨床治療。目前主要的監(jiān)測(cè)指標(biāo)有神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、代謝產(chǎn)物和局部藥物濃度等。

1.神經(jīng)遞質(zhì)：神經(jīng)遞質(zhì)是由神經(jīng)細(xì)胞合成，在突觸前膜釋放，特異性作用與突觸后膜受體，從而實(shí)現(xiàn)突觸間的信號(hào)傳遞。膠質(zhì)瘤的局部占位侵襲作用、合成物質(zhì)和新生血管等必然對(duì)神經(jīng)信息的正常傳遞產(chǎn)生影響。腦微透析可以對(duì)細(xì)胞外液中的物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，因而可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)術(shù)前術(shù)后、放化療前后神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化，對(duì)腦功能受損、治療效果等情況進(jìn)行評(píng)估。檢測(cè)較多的神經(jīng)遞質(zhì)有興奮性氨基酸、乙酰膽堿、多巴胺、五羥色胺等。Behrens等[5]證實(shí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在其侵襲性生長(zhǎng)時(shí)，可向間質(zhì)內(nèi)釋放谷氨酸，谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性氨基酸，它濃度過(guò)高可導(dǎo)致腫瘤周圍神經(jīng)元的興奮性中毒而死亡。另外，用微透析技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)有一個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)，它能動(dòng)態(tài)測(cè)定受測(cè)者自由活動(dòng)時(shí)遞質(zhì)水平的變化，使測(cè)量結(jié)果更能反映檢測(cè)目的。

2.細(xì)胞因子：膠質(zhì)瘤在生長(zhǎng)、侵襲及血管形成等過(guò)程中，有多種細(xì)胞因子參與。除此之外，手術(shù)、放化療等引起的炎癥反應(yīng)也會(huì)引起白細(xì)胞介素和趨化因子水平的改變。Marcus等[6]發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤周邊組織中，多種生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α、內(nèi)源性配體表皮生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) ，白細(xì)胞介素(interleukin, IL)，如IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-1受體拮抗劑以及金屬蛋白酶2、金屬蛋白酶9，和金屬蛋白酶抑制劑1、金屬蛋白酶抑制劑2等都有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性的變化。Jana等[7]發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤切除術(shù)后，周邊組織中多種細(xì)胞因子，如IL-6、IL-8、IL-12p40/p70、白介素2受體、干擾素α、干擾素誘導(dǎo)蛋白10、單核細(xì)胞趨化蛋白1、粒細(xì)胞集落刺激因子、單核細(xì)胞炎性蛋白1α、單核細(xì)胞炎性蛋白1β水平都有顯著性升高，這可能與術(shù)后的炎癥反應(yīng)有關(guān)，其中大部分都會(huì)隨著時(shí)間下降。

3.代謝產(chǎn)物：腫瘤組織的代謝模式與正常腦組織有顯著不同，這正是一些功能性成像，如功能磁共振成像fMRI和正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像PET的機(jī)理。但僅僅依靠這些影像學(xué)技術(shù)來(lái)研究膠質(zhì)瘤的代謝顯然是不夠的，腦微透析技術(shù)以其對(duì)組織損傷小而較小影響組織代謝和可持續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的特點(diǎn)為研究膠質(zhì)瘤的代謝提供了有力的工具。葡萄糖是腦組織的主要供能物質(zhì)，通過(guò)有氧氧化或無(wú)氧酵解給組織供能，而乳酸是葡萄糖無(wú)氧酵解的產(chǎn)物，常用乳酸/葡萄糖比值來(lái)反映組織的糖代謝水平，若該值高，則組織代謝旺盛或氧供不足。Roslin等[8]用微透析技術(shù)測(cè)定了15名高級(jí)別星型細(xì)胞瘤患者，每名患者植入兩枚探針，一枚在腫瘤組織內(nèi)，另一枚在瘤組織周邊，測(cè)定葡萄糖、乳酸、丙酮酸、谷氨酸和甘油的水平，建立了這些測(cè)量物質(zhì)的基線水平。另外，他們還發(fā)現(xiàn)瘤組織中的乳酸水平高于周邊組織，而葡萄糖水平低于周邊組織，反映了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的高代謝水平，這與其他腫瘤的代謝模式相一致。腺苷是星形細(xì)胞瘤嘌呤代謝在細(xì)胞外液中的標(biāo)記物。Melani等[9]用腦微透析技術(shù)結(jié)合高效液相色譜法評(píng)估了21位高級(jí)別星型細(xì)胞瘤患細(xì)胞外液中的腺苷水平，在對(duì)照組織和腫瘤組織中分別為(2.99±0.37)μM 、(1.56±0.46)μM，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4.化療藥物：在對(duì)膠質(zhì)瘤患者實(shí)施化療時(shí)，血腦屏障的存在使腫瘤組織局部很難達(dá)到較高的藥物濃度并且對(duì)腫瘤具有強(qiáng)效的抑制作用而不帶來(lái)全身的毒副作用。間質(zhì)內(nèi)化療，包括Ommaya囊、Gliadel植入片等，解決了這一困境，但患者的預(yù)后還遠(yuǎn)未達(dá)到令人滿意的程度。微透析技術(shù)可以用于分析腫瘤間質(zhì)內(nèi)的化療藥物濃度和化療效果，為篩選新的化療藥物和對(duì)患者進(jìn)行個(gè)體化治療有指導(dǎo)意義。Grossman等[10]用微透析技術(shù)研究西地尼布對(duì)U87腦膠質(zhì)瘤大鼠模型腦內(nèi)替莫唑胺濃度的影響, 結(jié)果顯示: 替莫唑胺聯(lián)合西地尼布較單用替莫唑胺，瘤內(nèi)藥物濃度有輕微上升，但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P=0.3)。Sandhya等[11]用動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)在用吉西他濱進(jìn)行系統(tǒng)化療時(shí)，腫瘤區(qū)的藥物濃度高于非腫瘤區(qū)。Lu等[12]用C6腦膠質(zhì)瘤大鼠模型研究了不同結(jié)合形式的阿柔比星在腫瘤組織中的藥物濃度，顯示陽(yáng)離子白蛋白結(jié)合聚乙二醇的載阿柔比星微粒效果較好。

5.其他：微透析技術(shù)除用于分析檢測(cè)，還可作為治療手段。增強(qiáng)對(duì)流輸注(convection-enhanced delivery, CED)是最近廣受關(guān)注的一種新型的針對(duì)顱內(nèi)腫瘤的化療方式，屬于間質(zhì)內(nèi)化療，藥物順濃度梯度直接擴(kuò)散到靶組織，有效地提高膠質(zhì)瘤局部的藥物濃度，收到相對(duì)較好的治療效果[13,14]。逆向增強(qiáng)對(duì)流輸注(retro-convection enhanced delivery, R-CED)，是用微透析探針去除組織間液，同時(shí)通過(guò)血管途徑向瘤組織內(nèi)輸送藥物，透析液先將組織間液移除一部分，降低組織內(nèi)的壓力，進(jìn)而使毛細(xì)血管內(nèi)的液體易于滲入組織內(nèi)，同時(shí)血液內(nèi)的藥物也跨血管進(jìn)入組織內(nèi)，提高藥物的局部跨膜效率[15,16]。Grace等[16]發(fā)現(xiàn)用R-CED可增加系統(tǒng)化療時(shí)瘤組織中心和腫瘤與腦組織交界區(qū)的藥物濃度，提高化療藥物的有效性。單獨(dú)或聯(lián)合使用CED和R-ECD為間質(zhì)內(nèi)化療提供了有效的工具。

三、問(wèn)題與展望

微透析技術(shù)自上世紀(jì)90年代被用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)研究以來(lái)，隨著探針植入、探針設(shè)計(jì)改良和高效液相色譜技術(shù)等的發(fā)展，在實(shí)驗(yàn)和臨床上的應(yīng)用越來(lái)越廣。然而，該技術(shù)還有一些不足和在操作時(shí)需要注意的情況[17～21]：①該技術(shù)屬于有創(chuàng)操作，對(duì)腦組織有一定的損傷，在用于臨床時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌觀念，并注意局部的護(hù)理，防止發(fā)生皮膚甚至顱內(nèi)感染；②需具有顱內(nèi)腫瘤精確定位和高效監(jiān)測(cè)分析等設(shè)備，費(fèi)用較高，患者不易接受，因此，目前主要用于實(shí)驗(yàn)室研究，而臨床應(yīng)用較少；③所收集的透析液總量較少，而所含成分復(fù)雜，在用于多種分析物檢測(cè)時(shí)，常遇到分離困難和標(biāo)本不夠的情況；④探針植入時(shí)可引起局部血流量增加、組織水腫，細(xì)胞死亡、神經(jīng)膠質(zhì)增生、出血等，影響檢測(cè)結(jié)果；⑤隨著探針植入時(shí)間的延長(zhǎng)，回收率會(huì)有所降低；⑥測(cè)得結(jié)果受灌流液類型和灌流速度的影響，因此，需有標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的操作規(guī)程，以便不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的比較；⑦在測(cè)定藥物濃度時(shí)，只能反映處于游離狀態(tài)的藥物分子而不包括蛋白結(jié)合型；⑧主要用于生物化學(xué)分析檢測(cè)，在治療方面的應(yīng)用較少；⑨臨床應(yīng)用還涉及相關(guān)的倫理學(xué)問(wèn)題。

微透析技術(shù)在膠質(zhì)瘤研究方面是一種有力的手段，可在體實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)目標(biāo)組織內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、代謝產(chǎn)物和局部藥物濃度等生物化學(xué)指標(biāo)，進(jìn)而對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展的病理生理機(jī)制有更充分的認(rèn)識(shí)，評(píng)價(jià)不同治療手段的療效和相互作用，指導(dǎo)個(gè)體化治療。隨著微透析檢測(cè)設(shè)備商品化的生產(chǎn)，它的應(yīng)用會(huì)越來(lái)越廣。另外，該技術(shù)在膠質(zhì)瘤的治療方面的應(yīng)用也不斷發(fā)展?？梢灶A(yù)見(jiàn)，微透析技術(shù)的廣泛應(yīng)用將會(huì)給膠質(zhì)瘤的研究帶來(lái)巨大的進(jìn)步。

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2015-03-30；

2015-06-10)

J Neurosurg. 2016 Oct 7:1-12. [Epub ahead of print]

Aggressive resection at the infiltrative margins of glioblastoma facilitated by intraoperative fluorescein guidance

NeiraJA1,UngTH1,SimsJ1,MaloneHR1,ChowDS2,SamanamudJL1,ZanazziGJ3,GuoX4,BowdenSG1,ZhaoB4,ShethSA1,McKhannGM2nd1,SistiMB1,CanollP3,D'AmicoRS1,BruceJN1

1DepartmentofNeurologicalSurgery;2DepartmentofNeuroradiology;3DepartmentofPathologyandCellBiology;4DepartmentofRadiology,ColumbiaUniversityMedicalCenter,NewYork,NewYork.

ObjectiveExtent of resection is an important prognostic factor in patients undergoing surgery for glioblastoma (GBM). Recent evidence suggests that intravenously administered fluorescein sodium associates with tumor tissue, facilitating safe maximal resection of GBM. In this study, the authors evaluate the safety and utility of intraoperative fluorescein guidance for the prediction of histopathological alteration both in the contrast-enhancing (CE) regions, where this relationship has been established, and into the non-CE (NCE), diffusely infiltrated margins.MethodsThirty-two patients

fluorescein sodium (3 mg/kg) intravenously prior to resection. Fluorescence was intraoperatively visualized using a Zeiss Pentero surgical microscope equipped with a YELLOW 560 filter. Stereotactically localized biopsy specimens were acquired from CE and NCE regions based on preoperative MRI in conjunction with neuronavigation. The fluorescence intensity of these specimens was subjectively classified in real time with subsequent quantitative image analysis, histopathological evaluation of localized biopsy specimens, and radiological volumetric assessment of the extent of resection.ResultsBright fluorescence was observed in all GBMs and localized to the CE regions and portions of the NCE margins of the tumors, thus serving as a visual guide during resection. Gross-total resection (GTR) was achieved in 84% of the patients with an average resected volume of 95%, and this rate was higher among patients for whom GTR was the surgical goal (GTR achieved in 93.1% of patients, average resected volume of 99.7%). Intraoperative fluorescein staining correlated with histopathological alteration in both CE and NCE regions, with positive predictive values by subjective fluorescence evaluation greater than 96% in NCE regions.ConclusionsIntraoperative administration of fluorescein provides an easily visualized marker for glioma pathology in both CE and NCE regions of GBM. These findings support the use of fluorescein as a microsurgical adjunct for guiding GBM resection to facilitate safe maximal removal.

1671-2897(2016)15-463-03

李彥騰，碩士研究生，E-mail：yantenglibj@sina.com

*通訊作者：張劍寧，教授、主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，E-mail：jnzhang2005@163.com

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