李欽芳　湛先保

200433　上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化內(nèi)科

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急性胰腺炎與自噬及其關(guān)鍵分子Beclin1相關(guān)研究進(jìn)展

李欽芳湛先保

200433上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化內(nèi)科

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是指多種病因引起的胰酶激活，伴有胰腺局部炎癥反應(yīng)，病情較重者可發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合癥(SIRS)，并可并發(fā)器官功能障礙[1]。長期以來人們都認(rèn)為腺泡細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶原的異?；罨茿P的主要發(fā)病機(jī)制。然而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，它只是在AP的病程早期發(fā)揮重要作用，而與局部及全身炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的是早期階段腺泡細(xì)胞內(nèi)炎癥因子活化[2]。隨著發(fā)病率逐年升高，AP發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域已成為熱點(diǎn)，自噬在胰腺外分泌部的生理功能和AP中發(fā)揮著重要的作用，AP發(fā)病機(jī)制的完善有待于包括對腺泡細(xì)胞內(nèi)自噬、溶酶體功能等在內(nèi)的深入研究。

一、自噬與胰腺炎

“自噬”一詞源于希臘，寓為“自我吞食”，它是將細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)利用的有效途徑，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。自噬至少分為3種類型：巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬，此外還有與巨自噬形態(tài)學(xué)相似的過氧化物酶體自噬、線粒體自噬等。而通常所說的自噬往往指的是巨自噬。首先，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體形成雙層膜結(jié)構(gòu)的隔離膜[3]，隔離膜將胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器和蛋白包繞隔離起來形成吞噬泡，吞噬泡邊緣的新生膜延伸融合形成雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡，即為自噬體。自噬體經(jīng)歷了逐步成熟的過程，包括與酸化的內(nèi)涵體和(或)溶酶體融合，最終胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)進(jìn)入溶酶體中融合、降解和重新利用。哺乳動物的自噬過程主要分為起始、成核、延伸、閉合、成熟和降解6個(gè)步驟。

胰腺是人體重要的器官，外分泌胰腺的基本生理功能為分泌大量的消化酶包括淀粉酶、脂肪酶和各種蛋白酶。Mizushima等[4]發(fā)現(xiàn)胰腺外分泌部的基礎(chǔ)自噬水平顯著高于肝臟、腎臟、心臟或胰腺內(nèi)分泌部，并發(fā)現(xiàn)自噬可調(diào)節(jié)胰蛋白酶原顆粒的數(shù)量。Gukovskaya等[5]對小鼠離體實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在胰腺腺泡細(xì)胞中存在大量的生理性自噬。這可能是由于胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝旺盛，容易產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊蛋白的積聚之故。Gukovsky等[6]認(rèn)為高效的生理性自噬能預(yù)防胰腺炎。當(dāng)敲除自噬相關(guān)基因Atg7時(shí)，可導(dǎo)致腺泡細(xì)胞萎縮退化，胰腺纖維化，繼而引發(fā)慢性胰腺炎(CP)。

自噬在胰腺炎中的作用目前仍存在較多爭議。Hashimoto等[7]敲除小鼠自噬相關(guān)基因Atg5后并未觀察到胰腺炎的表型，但胰蛋白酶原活性下降，從而認(rèn)為自噬是胰腺炎危險(xiǎn)因素，在AP早期自噬可通過溶酶體機(jī)制活化胰蛋白酶原。 但Grasso等[8]則認(rèn)為選擇性自噬是胰腺炎的保護(hù)因素，能在胰腺炎早期清除異?；罨囊鹊鞍酌冈?。而最新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，至少在小鼠中，自噬障礙能導(dǎo)致胰腺炎的發(fā)生[9-11]。Gukovsky等[12]在胰腺炎相關(guān)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，胰腺腺泡細(xì)胞中存在溶酶體和線粒體等重要細(xì)胞器的功能障礙。自噬是一個(gè)動態(tài)的過程即自噬流(autophagic flux)，包括自噬體的形成、自噬體底物向溶酶體的運(yùn)送以及在溶酶體內(nèi)降解的整個(gè)過程。自噬體只是自噬流過程中的一個(gè)中間產(chǎn)物，僅僅以自噬體數(shù)量來反映自噬強(qiáng)弱并不準(zhǔn)確。AP時(shí)溶酶體功能障礙導(dǎo)致自噬流不暢，引起溶酶體相關(guān)的自噬障礙。有觀點(diǎn)認(rèn)為胰腺炎時(shí)的溶酶體功能障礙是由組織蛋白酶(包括組織蛋白酶B和組織蛋白酶D等)和大部分溶酶體水解酶成熟和活化異常引起。也有觀點(diǎn)認(rèn)為是由于胰腺炎中溶酶體膜蛋白LAMP-1和LAMP-2下降所致。溶酶體功能障礙在胰腺炎的早期起著重要的促進(jìn)炎癥發(fā)生和進(jìn)展的作用。自噬受損導(dǎo)致腺泡細(xì)胞中空泡堆積；組織蛋白酶成熟及活化異常導(dǎo)致腺泡細(xì)胞內(nèi)活化的胰蛋白酶原顆粒堆積，胰蛋白酶異?；罨纳呤且认傺椎闹匾獦?biāo)志；而LAMP-2缺乏導(dǎo)致炎癥和腺泡細(xì)胞壞死。因此，自噬和溶酶體功能障礙在胰腺炎中起著重要作用。另外，線粒體受損促進(jìn)自噬，使溶酶體負(fù)荷增加，從而進(jìn)一步導(dǎo)致溶酶體功能受損。因此，溶酶體和線粒體功能不全都可通過影響細(xì)胞的自噬功能，從而在胰腺炎的發(fā)生過程中起著促進(jìn)作用。而自噬功能不全導(dǎo)致胰腺炎的機(jī)制尚待闡明。

二、Beclin1在自噬中的作用

自噬往往依賴于Atg5和Atg7基因，Atg5/Atg7依賴性自噬與微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)的切斷和脂化有關(guān)。然而Atg5/Atg7敲除的細(xì)胞仍可見自噬體，卻無LC3的表達(dá)，說明Atg5/Atg7非依賴性的自噬通路與LC3無關(guān)，但參與了晚期內(nèi)涵體和轉(zhuǎn)運(yùn)高爾基體源性的自噬體的形成。值得一提的是，無論是Atg5/Atg7依賴性還是非依賴性的自噬均需要Beclin1的參與[13]。Beclin1是酵母自噬基因Atg6/Vps30在哺乳動物中的同源類似物。1998年Liang等[14]發(fā)現(xiàn)Bcl-2為Sindbis病毒性腦炎的保護(hù)性因素，于是運(yùn)用酵母雙雜交系統(tǒng)研究與Bcl-2相互作用的因子時(shí)發(fā)現(xiàn)在熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微鏡下有一個(gè)分子量為60 000的新型蛋白，即Beclin1。Beclin1主要存在于胞質(zhì)中，形態(tài)卷曲，包含BH3、CCD與ECD 3種結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域可以與多種蛋白相互作用，參與自噬和凋亡的調(diào)節(jié)。通過ECD結(jié)構(gòu)域，Beclin1與PtdIns3KC3結(jié)合，使其磷酸化為有活性的PtdIns(3)P，然后與Atg蛋白相互作用，參與自噬體的形成；Beclin1通過CCD和BH3結(jié)構(gòu)域相互聚合形成寡聚體，參與一些自噬因子的活化，從而起到正向調(diào)節(jié)自噬作用。酵母及哺乳動物中均存在兩種穩(wěn)定的Beclin1復(fù)合體。Atg6/Beclin 1、Vps34/PtdIns3KC3和Vps15/p150(后者是PtdIns3KC3的蛋白調(diào)節(jié)激酶)形成復(fù)合體，并在此基礎(chǔ)上與不同的蛋白相互結(jié)合，在自噬的不同階段中發(fā)揮作用。一方面，該復(fù)合體與Atg14或其哺乳動物的同源物質(zhì)Atg14L(又名Barkor)結(jié)合，稱為復(fù)合物Ⅰ，在Atg14或Atg14L引導(dǎo)下，參與自噬前體結(jié)構(gòu)(PAS)的形成。另一方面，該復(fù)合體與Vps38或其哺乳動物的同源物質(zhì)UVRAG結(jié)合，稱為復(fù)合物Ⅱ，在酵母中參與液泡蛋白的分選，但在哺乳動物中該復(fù)合物是否參與自噬體的形成仍有爭議。近年研究的結(jié)果傾向于復(fù)合物Ⅱ與自噬無關(guān)，而最新研究則認(rèn)為復(fù)合物Ⅱ參與胞內(nèi)物質(zhì)的降解和細(xì)胞分裂過程。在鼠類巨噬細(xì)胞和線蟲中發(fā)現(xiàn)Beclin1參與細(xì)胞的內(nèi)吞作用和蛋白分選，但是否需要UVRAG的參與還有待進(jìn)一步研究。此外，與Beclin1相互作用的蛋白還有Ambra1、Bif-1、Rubicon和Bcl-2。這些分子抑或是這兩種復(fù)合物的抑制因子，抑或是促進(jìn)因子，參與自噬的調(diào)節(jié)，其調(diào)節(jié)作用多為一過性，在特定的病理或生理情況下參與復(fù)合物Ⅰ及Ⅱ的調(diào)節(jié)[15]。如Bcl-2通過與Beclin1的BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合可以抑制自噬的發(fā)生。而一旦Bcl-2或Beclin1磷酸化，或者Beclin1泛素化，二者的結(jié)合將受影響，使Beclin1從Bcl-2/Bcl-XL上解離下來，促進(jìn)自噬的產(chǎn)生。

三、Beclin1與急性胰腺炎

Beclin1與胰腺疾病間的關(guān)系尚不明了。較為肯定的是沉默Beclin1可以促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的自噬及降低吉西他濱誘導(dǎo)的凋亡，換而言之，Beclin1可以抑制胰腺癌細(xì)胞的自噬，促進(jìn)凋亡[16]。Beclin1在AP中的作用研究很少。Zhang等[17]注射雨蛙素(10或50 μg/kg)至雄性小鼠的腹腔內(nèi)。采用免疫組化技術(shù)發(fā)現(xiàn)正常對照組Beclin1散在于腺泡細(xì)胞胞質(zhì)中，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和非特異性區(qū)域；10 μg/kg雨蛙素造模組的Beclin1聚集于腺泡細(xì)胞中央位置，總量稍有減少；50 μg/kg雨蛙素造模組的Beclin1濃聚于大的自噬體和小的自噬泡中，但總量驟降。蛋白印跡法提示雨蛙素造模后Beclin1總量明顯降低。免疫共定位技術(shù)觀察到VMP1、Beclin1、LC3共同位于自噬體膜上，提示這些蛋白可能相互作用誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生。免疫細(xì)胞化學(xué)和蛋白印跡法檢測均發(fā)現(xiàn)在雨蛙素誘導(dǎo)的胰腺炎中Beclin1表達(dá)下調(diào)，提示細(xì)胞內(nèi)存在Beclin1的消耗或者其他未知作用機(jī)制存在。在雨蛙素誘導(dǎo)的小鼠AP模型中，Beclin1的下調(diào)程度與雨蛙素劑量成正相關(guān)。Miller等[18]認(rèn)為VMP1是自噬相關(guān)膜蛋白，它參與雨蛙素誘導(dǎo)的AP時(shí)細(xì)胞的自噬的形成。近期研究發(fā)現(xiàn)，VMP1通過與Beclin1的BH3結(jié)構(gòu)域相互作用調(diào)節(jié)胰腺細(xì)胞中自噬體的形成。在人體細(xì)胞中，它可以使Beclin1-hVps34復(fù)合體聚集，從而調(diào)節(jié)自噬體的形成。Miller等[18]還發(fā)現(xiàn)，VMP1的Atg結(jié)構(gòu)域與Beclin1-BH3的親和力大于Beclin1與Bcl-2的親和力，可以使Beclin1與Bcl-2解離，促進(jìn)自噬的產(chǎn)生。VMP1-Atg也參與Ⅲ型PI3K復(fù)合物的形成，并且在自噬中有協(xié)同作用。此外，VMP1-Beclin1-hVps34復(fù)合物還參與LC3的形成。Mareninova等[19]采用蛋白質(zhì)印跡法檢測到雨蛙素誘導(dǎo)的AP大鼠Beclin1表達(dá)上調(diào)，提示AP時(shí)Beclin1相關(guān)的自噬增加。盡管迄今研究結(jié)果不一，但可見Beclin1與雨蛙素誘導(dǎo)的AP的自噬有關(guān)。

綜上所述，自噬是AP發(fā)生過程重要的病理現(xiàn)象，自噬流障礙參與了胰蛋白酶原的活化和AP的發(fā)生。自噬啟動的關(guān)鍵分子Beclin1在AP發(fā)生中的變化研究結(jié)果尚不一致，其病理生理意義也不明了。進(jìn)一步深入研究將有助于闡明AP時(shí)自噬的發(fā)生機(jī)制，不僅有助于深入揭示AP的發(fā)生機(jī)制，甚至有助于探索AP的治療方法和靶點(diǎn)。

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(本文編輯：屠振興)

(收稿日期：2015-12-07)

通信作者：湛先保，Email: zhanxianbao@126.com

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.02.018