景晟（上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司 上海 200444）

自制5’-核苷酸酶試劑在生化檢驗(yàn)中的應(yīng)用

景晟*
（上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司 上海 200444）

摘 要目的：評(píng)價(jià)自主研發(fā)的5’-核苷酸酶試劑（速率法）在自動(dòng)化檢測(cè)血清或血漿中5’-核苷酸酶活性的應(yīng)用。方法：采用奧林巴斯AU680全自動(dòng)生化分析儀，通過重復(fù)性、線性試驗(yàn)、測(cè)定血清或血漿中5’-核苷酸酶活性，進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)并與美國(guó)Diazyme 5’-核苷酸酶試劑（速率法）比較。結(jié)果：兩個(gè)水平質(zhì)控中酶活性的變異系數(shù)（CV）分別為2.83% 和1.96%，在 5～200 U/L酶活范圍內(nèi)，線性良好。兩種試劑測(cè)定血清5’-核苷酸酶活性的相關(guān)系數(shù)較好，相關(guān)系數(shù)r 為0.995。結(jié)論：自主研發(fā)的5’- 核苷酸酶試劑盒操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，結(jié)果準(zhǔn)確，可滿足大批量臨床樣本的常規(guī)和自動(dòng)化分析，是一種值得推廣的方法。

關(guān)鍵詞5’-核苷酸酶 診斷試劑 臨床研究

The application of the homemade 5’-nucleotidase reagent in biochemical analysis

JING Sheng*
(Shanghai Fosun Long March Medical Science Co. Ltd., Shanghai 200444,China)

ABSTRACTObjective: To evaluate the application of the independent innovation reagent in the automatic determination of 5’-nucleotidase (5’-NT) activity in the clinical serum or plasma samples. Methods: 5’-NT activities were determined with Olympus AU680 automatic biochemical analyzer by repeatability and linearity tests, the evaluation of methodology was carried out and the results were compared with those determined by the reagent of Diazyme Laboratories. Results: The coefficients of variation (CV) of the enzyme activity at two levels of quality control were 2.83% and 1.96%. The determination of enzyme activity showed a good linearity over the range of 5~200 U/L. There was a good correlation between two reagents (r=0.995). Conclusion: The 5’-nucleotidase reagent made by our company can provide a simple, quick, accurate and stable method for the determination of 5′-NT activity in the clinical serum or plasma samples and meet the requirement of the automated analysis of mass clinical samples. This method may be worthy of promotion.

KEY WORDS5’-nucleotidase; clinical research; diagnostic reagent

1934年Reis第一次描述了心臟和骨骼肌中5′-核苷酸酶（EC3.1.3.5）的活性[1]。它的主要功能是將核苷酸5′-C上連接的磷酸催化水解生成核苷和正磷酸，其在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、運(yùn)動(dòng)、纖維蛋白合成、神經(jīng)傳遞、淋巴細(xì)胞的黏附、再循環(huán)、免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要作用及在缺血性心臟病、缺血性腎臟病、白血病、腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中的作用越來越受到人們的重視[2-4]。目前測(cè)定5′-核苷酸酶活性的方法有很多，包括鉬藍(lán)顯色法[5]、Kalckar 氏法[6]、改進(jìn)的Kalckar 氏法[7]、酶法[8]和速率法[5]。其中鉬藍(lán)顯色法和速率法是最常用的方法，但是鉬藍(lán)顯色法所需試劑種類多，操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，不適宜自動(dòng)化分析；速率法通常須采用昂貴的進(jìn)口試劑，而大部分國(guó)產(chǎn)5′-NT試劑只能用于血清樣本的檢測(cè)。本文采用復(fù)星長(zhǎng)征試劑測(cè)定血清或血漿中5′-核苷酸酶的活性，并對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 儀器

日本 Olympus AU680 全自動(dòng)生化分析儀。

1.2 試劑、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品

復(fù)星長(zhǎng)征自主研發(fā)5'-NT試劑（批號(hào)為D20130703，簡(jiǎn)稱復(fù)星長(zhǎng)征試劑）；對(duì)照試劑（批號(hào)為 8746）、校準(zhǔn)品（批號(hào)為NTS001120）、配套質(zhì)控品1（批號(hào)為NTC101310）和配套質(zhì)控品2（批號(hào)為NTC201310）均購(gòu)自美國(guó)Diazyme公司。

1.3 標(biāo)本

本研究收集的標(biāo)本為上海復(fù)星長(zhǎng)征公司醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司員工的100人，靜脈采血，樣本新鮮無溶血、無黃疸。同一份樣本各采兩管血，一份血清樣本一份肝素血漿樣本。

1.4 測(cè)定方法及條件

按照以下參數(shù)來設(shè)置奧林巴斯AU680全自動(dòng)生化分析儀：

速率法：溫度37 ℃，主波長(zhǎng)546 nm，副波長(zhǎng)800 nm，吸光度范圍0～2 A，比色杯光徑1.0 cm，反應(yīng)方向?yàn)槲舛壬仙姆磻?yīng)，樣本用量6 μl，復(fù)星長(zhǎng)征試劑和Diazyme試劑均為液體雙試劑，分別由試劑1（R1）和試劑2（R2）組成。R1用量225 μl，孵育時(shí)間5 min；R2用量75 μl，延遲時(shí)間120 s，測(cè)定時(shí)間120 s，校準(zhǔn)模式為兩點(diǎn)定標(biāo)。

1.5 空白吸光度

用試劑（盒）測(cè)試生理鹽水，記錄試劑（盒）參數(shù)規(guī)定讀數(shù)點(diǎn)546 nm下的吸光度值（A），重復(fù)兩次。

1.6 重復(fù)性

在重復(fù)條件下，測(cè)試5′-NT活性標(biāo)示值分別為28.3 U/L和141.2 U/L的控制血清，將這兩水平控制血清分別測(cè)試10次，計(jì)算測(cè)量值的平均值（x）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）和變異系數(shù)（CV）。

1.7 線性試驗(yàn)

用接近線性范圍下限的低活性樣品與接近線性范圍上限的高活性樣品混合配制成5、12.5、25、50、100、200 U/L的6個(gè)樣品（xi），分別用測(cè)試試劑（盒）對(duì)各樣品進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)樣品測(cè)試3 次，分別求出每個(gè)活性濃度樣品檢測(cè)結(jié)果的均值（yi）。以6個(gè)濃度（xi）為自變量，以檢測(cè)結(jié)果均值（yi）為因變量作線性回歸。

1.8 血清和血漿測(cè)定結(jié)果比較

100人份的血漿和血清樣本同時(shí)檢測(cè)5’-NT活性，并比較測(cè)定結(jié)果。

1.9 復(fù)星長(zhǎng)征試劑與Diazyme試劑的對(duì)比試驗(yàn)

隨機(jī)選擇50份樣本，每份樣本作雙份測(cè)定，取均值，按NCCLS EP9[9]的評(píng)價(jià)方案統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 空白吸光度

三次試劑空白的檢測(cè)結(jié)果分為0.016 7，0.017 2，0.015 9，試劑的空白變化率的檢測(cè)結(jié)果分別為0.001，0.000 8，0.000 9，結(jié)果表明試劑空白小于0.5，試劑的空白變化率小于0.005，檢測(cè)結(jié)果符合產(chǎn)品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)，試劑性能可控。

2.2 重復(fù)性

低、高活性兩個(gè)水平質(zhì)控中酶活性的平均值分別為27.8 U/L和139.6 U/L，變異系數(shù)（CV）分別為2.83% 和1.96%，均小于5%。試劑的重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果符合產(chǎn)品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)，試劑性能可控。

2.3 線性試驗(yàn)理論值(x)與測(cè)定值(Y)之間的線性回歸

所得數(shù)據(jù)的線性回歸方程為Y=0.987 6 X-0.746 2，R=0.999 9，5′-NT酶活濃性在5～200 U/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 血清與血漿標(biāo)本5′-NT測(cè)定結(jié)果比較

復(fù)星長(zhǎng)征公司試劑對(duì)血清和血漿中5′-NT活性的檢測(cè)結(jié)果的均值為3.85 U/L和3.81 U/L，兩者差異無顯著意義（t=0.23，P>0.05），血清和血漿測(cè)定結(jié)果之間具有良好的相關(guān)性（r=0.999，圖1）。

圖1 復(fù)星長(zhǎng)征試劑測(cè)定血清和血漿中5′-NT活性

2.5 復(fù)星長(zhǎng)征試劑（速率法）與Diazyme試劑的比對(duì)以及偏倚評(píng)估

Diazyme公司試劑和復(fù)星長(zhǎng)征試劑對(duì)100例血清5′-NT活性檢測(cè)的均值分別為3.97 U/L和3.85 U/L，兩者無顯著差異（t=0.23，P>0.05），所測(cè)5′-NT活性具有良好的相關(guān)性（r=0.995，圖2）。兩方法均值相對(duì)偏差的偏置曲線圖可以看出兩種試劑檢測(cè)同一樣本的相對(duì)偏差結(jié)果良好，部分樣本的相對(duì)偏差絕對(duì)值雖然超過15%，但都集中在4 U/L以下，這可能是由于樣本濃度極低、試劑以及機(jī)器的系統(tǒng)偏差所致；另一方面，參考值為0～11 U/L，低于該值的樣本不影響結(jié)果的判斷。顯示兩種試劑測(cè)定單個(gè)樣本偏差較小，分布較合理。

圖2 Diazyme試劑和復(fù)星長(zhǎng)征試劑測(cè)定血清樣本中5′-NT活性

3 討論

5′-NT廣泛存在于肝臟和各種組織中。血清中5′-NT活性增高主要見于肝膽系統(tǒng)疾病，如阻塞性黃疸、原發(fā)及繼發(fā)性肝癌等，通常酶活性變化與堿性磷酸酶（ALP）活性變化相平行。但在骨骼系統(tǒng)疾病中，如腫瘤骨轉(zhuǎn)移、畸形性骨炎等疾病中ALP活性增高，而5′-NT活性正常。所以，對(duì)ALP活性增高的患者，測(cè)定5′-NT活性有助于臨床判斷ALP活性增高原因是肝膽系統(tǒng)疾病，還是骨骼系統(tǒng)疾病[5]。

周永年等[10]研究發(fā)現(xiàn)在肝膽發(fā)生病變時(shí)其釋放的5′-NT經(jīng)膽汁酸作用后進(jìn)入血液循環(huán)，使血清中的5′-NT活性升高。故血清中5′-NT活性的變化較少受到肝外其他疾病的影響，有助于臨床鑒別診斷。劉新等[11]研究表明，當(dāng)肝膽疾病發(fā)生時(shí)，5′-NT活性升高的同時(shí)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷氨酸轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、ALP活性亦見增高，其增高程度與病情的嚴(yán)重度密切相關(guān)。

復(fù)星長(zhǎng)征試劑可檢測(cè)血清和血漿樣本的5′-NT活性，并且血清和血漿測(cè)定結(jié)果之間具有良好線性相關(guān)性；與Diazyme公司試劑所測(cè)5′-NT活性也具有良好的線性相關(guān)性。表明采用我公司自制試劑進(jìn)行5′-NT活性測(cè)定的方法操作簡(jiǎn)單、線性范圍寬、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確，完全可以替代美國(guó)Diazyme公司的5′-NT試劑應(yīng)用于血漿和血清中5′-NT活性測(cè)定。

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收稿日期：（2014-07-30）

作者簡(jiǎn)介：*景晟（1980-），男，工程師，生化研發(fā)經(jīng)理，從事于體外診斷試劑生化試劑的研發(fā)。E-mail: jingsh@ fosunpharma.com

中圖分類號(hào)：R981; R446.112

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-1533(2015)01-0030-03