唐興平　劉　婧　羅小林　黃六蓮　陳禮輝

(福建農(nóng)林大學材料工程學院,福建福州,350002)

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研究論文

綠竹甲酸預處理脫木素的響應面法優(yōu)化

唐興平劉婧羅小林*黃六蓮陳禮輝

(福建農(nóng)林大學材料工程學院,福建福州,350002)

摘要：利用Design-Expert統(tǒng)計軟件對影響綠竹甲酸預處理過程中木素溶出率的4個自變量(甲酸含量、液比、最高溫度和保溫時間)進行四因素五水平的中心復合設(shè)計,建立全因素二項式方程(模型Ⅰ)。以參數(shù)的顯著性為判定依據(jù),對全因素二項式方程進行簡化處理,得到模型Ⅱ。將這2個模型用于木素溶出率預測，盡管2個模型的變異系數(shù)相近,且預測值與實測值的相關(guān)系數(shù)均高于0.9,但模型Ⅱ的信噪比比模型Ⅰ高近20%,表明簡化模型不僅可較好地預測綠竹甲酸預處理過程中的木素溶出率,且穩(wěn)定性較高。木素溶出率與固體基質(zhì)中纖維素酶水解轉(zhuǎn)化率之間為指數(shù)關(guān)系；但隨木素溶出率的增加,纖維素溶出率也隨之增加,最終酶水解葡萄糖得率呈先升高后降低的變化趨勢；為獲得更多的葡萄糖,較優(yōu)的木素溶出率約為50%。

關(guān)鍵詞：甲酸預處理；響應面法優(yōu)化；木素溶出率；纖維素酶水解；葡萄糖得率

為緩解化石能源有限儲量及其利用引起的環(huán)境問題,開發(fā)可再生清潔能源(如纖維素燃料乙醇等)已成為重要的研究課題[1]。然而,木質(zhì)生物質(zhì)的結(jié)構(gòu)非常致密,纖維素、半纖維素和木素通過共價鍵連接形成的異質(zhì)性高分子聚合物結(jié)構(gòu)嚴重影響纖維素酶水解生產(chǎn)可發(fā)酵葡萄糖的效率[2]。為了提高木質(zhì)生物質(zhì)中纖維素對酶的可及性,預處理已成為纖維素燃料乙醇生產(chǎn)過程中必不可少的過程[3]。

現(xiàn)有的預處理方法主要有物理法、化學法和生物法。物理法預處理主要包括研磨和盤磨處理等,這些預處理過程較為清潔,但設(shè)備投資和能耗相對較高[4]。化學法預處理主要包括熱水預處理、酸預處理、堿預處理、蒸汽爆破、有機溶劑預處理等[5- 8]?；瘜W預處理中熱水預處理最清潔,但對木質(zhì)生物質(zhì)中纖維素酶水解轉(zhuǎn)化率的提高不明顯[5]。稀酸(如稀硫酸和稀鹽酸)預處理可使半纖維素發(fā)生酸性水解而溶于預處理液中,固體基質(zhì)中纖維素酶水解轉(zhuǎn)化率得以顯著提高,但無機酸難以回收,且對設(shè)備的腐蝕性比有機酸強[9]。酸性亞硫酸鹽是化學預處理中效率較高的預處理方法,但大量硫化物(如二氧化硫、亞硫酸鹽和亞硫酸氫鹽等)殘留于預處理液和固體基質(zhì)中,不僅對操作人員的人身安全造成危害和對大氣產(chǎn)生不可忽視的影響,同時也對糖化和發(fā)酵過程使用的酶和微生物具有一定的毒害作用[10]。稀堿預處理對設(shè)備的腐蝕性相對較低,但固體基質(zhì)中殘留的堿以及木素的堿性降解產(chǎn)物會抑制酶的水解效率,將這些物質(zhì)洗出需耗用大量的潔凈水[11]。盡管有機溶劑(如乙醇等)預處理所用溶劑易于回收,但需添加無機酸或堿來提高預處理效率,最終也存在常規(guī)無機酸和堿法預處理所存在的問題[12]。典型的生物法預處理為白腐菌預處理,處理條件溫和,對設(shè)備和能耗的要求較低,基本無污染物產(chǎn)生,但處理周期過長,半纖維素和木素去除率低,預處理后固體基質(zhì)中纖維素酶水解效率也較低[13]。

綜上所述,現(xiàn)有預處理方法均無法同時滿足顯著提高纖維素酶水解效率、能耗低、環(huán)保、預處理液對人體無毒無害且易于回收等要求。相對而言,盡管有機酸預處理對設(shè)備也有一定的腐蝕性,但該方法所需能耗較低,預處理液易于回收,且可顯著提高木質(zhì)生物質(zhì)中纖維素酶水解效率。因此,本實驗采用有機酸(如甲酸)對我國豐富的非木材資源(綠竹)進行預處理；利用Design-Expert統(tǒng)計軟件對甲酸預處理實驗方案進行中心復合設(shè)計；同時考察甲酸預處理木素溶出量對固體基質(zhì)中纖維素酶水解轉(zhuǎn)化率和葡萄糖得率的影響,以期為以非木材資源為原料的纖維素燃料乙醇生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化提供理論基礎(chǔ)。

1實驗

1.1原料與藥品

實驗用原料為福建漳州某林場提供的3年生綠竹,經(jīng)切片、磨粉至過40～60目篩和風干后備用?？啡?F)、5-羥甲基糠醛(HMF)和乙酰丙酸(LA)購自Sigma公司,均為色譜純。用于預處理的甲酸購自國藥集團化學試劑有限公司,為分析純。綠竹磨木木素采用Argyropoulos 等[14]開發(fā)的兩步酶水解-弱酸水解的方法進行分離。

1.2綠竹的甲酸預處理

以木素溶出率為因變量,利用Design-Expert 8.0.6(Stat-Ease Inc,美國)統(tǒng)計軟件對影響木素溶出率的4個自變量進行四因素五水平的中心復合設(shè)計,并以+2、+1、0、-1、-2分別代表自變量的最高、高、中、低和最低水平(見表1),共30組實驗。

表1　響應面法優(yōu)化綠竹甲酸預處理木素溶出率的

注甲酸含量為甲酸在由甲酸和去離子水所組成混合溶液中的體積分數(shù)。

甲酸預處理實驗。首先取50 g竹粉置于1 L的圓底燒瓶中,添加一定量特定濃度的甲酸溶液,同時加入磁力攪拌子和玻璃珠,配置冷凝管,然后將整個裝置放入油浴鍋中。待油浴鍋升到特定溫度時開始計時,預處理結(jié)束后,用墊有2層慢速濾紙的布氏漏斗進行固液分離；收集濾液,然后用去離子水將濾紙表面固體基質(zhì)洗至中性,分散后密封于封口袋中平衡水分。取一定量固體基質(zhì),在105℃干燥后測定固體基質(zhì)得率,其余固體基質(zhì)用于酶水解實驗。

1.3木素溶出率的測定

以50%的甲酸溶液為溶劑,配置一定濃度的糠醛、5-羥甲基糠醛和乙酰丙酸溶液,在波長260～450 nm范圍內(nèi)測定其光譜。

稱取13.2 mg綠竹磨木木素,將其溶于20 mL 50%的甲酸溶液。以此溶液為母液,然后用50%甲酸溶液將其稀釋10、20、30、40、50倍。在紫外-可見光區(qū)測定稀釋后溶液的光譜,選定特定波長建立標準曲線。取一定量甲酸預處理液,經(jīng)50%甲酸溶液稀釋和0.45 μm水性微孔濾膜過濾后,測定濾液吸光度；基于此吸光度和已建立的標準曲線,可根據(jù)式(1)計算木素溶出率(RL)：

(1)

式中,A325為稀釋后的甲酸預處理液在325 nm處的吸光度；V為甲酸預處理液體積，L；ε是木素的摩爾吸光系數(shù),L/(mg·cm)；λ是甲酸預處理液的稀釋倍數(shù)；W1是用于甲酸預處理的竹粉絕干質(zhì)量,g；CL是竹粉原料中木素含量, %；l為吸光度測定時比色血的寬度，1 cm。

1.4纖維素溶出率的測定

采用兩步水解法測定竹粉原料和固體基質(zhì)中纖維素含量[4]。取0.6 g竹粉(40～60目)置于20 mL血清瓶中,加入6 mL、72 %硫酸溶液和磁力攪拌子,在30 ℃水浴中反應1 h；第一步酸水解結(jié)束后,將固液混合物倒入250 mL厚壁耐壓瓶(北京欣維爾玻璃儀器有限公司)中,然后加入168 mL去離子水,使硫酸稀釋至4%,然后用聚四氟乙烯蓋密封后在121℃油浴中反應1 h；反應結(jié)束后,用冷水終止反應,取1 mL上清液,經(jīng)NaOH溶液中和后,用生化分析儀(YSI 2900D,Yellow Springs Instrument Co.)測定其葡萄糖質(zhì)量濃度。甲酸預處理后綠竹纖維素溶出率(RC)的計算見式(2)和式(3)：

(2)

(3)

式中,Cg為葡萄糖質(zhì)量濃度,g/L；V為兩步水解最終的液體體積,mL；W2為加入竹粉的絕干質(zhì)量,g；C1和C2分別為竹粉原料和固體基質(zhì)中纖維素的含量, %；YS為甲酸預處理后固體基質(zhì)的得率, %。

1.5固體基質(zhì)的酶水解

按照參考文獻[15]的方法,固體基質(zhì)(質(zhì)量分數(shù)2%)的酶水解在恒溫空氣浴搖床(481HP,Waltham)中進行,以pH值4.8、50 mmol/L醋酸-醋酸鈉溶液為緩沖溶液,纖維素酶(Celluclast 1.5 L)和纖維二糖酶(Novozyme 188)的用量(對絕干固體基質(zhì))分別為15 FPU/g和22.5 CBU/g,酶水解溫度和轉(zhuǎn)速分別為50℃和200 r/min。酶水解72 h 后,取1 mL上清液,用生化分析儀測定其葡萄糖質(zhì)量濃度。固體基質(zhì)中纖維素酶水解轉(zhuǎn)化率(CEC)和葡萄糖得率(YG)分別按照式(4)和式(5)計算。

(4)

YG=CEC×(1-RC)

(5)

式中,ψ是酶水解液中固體基質(zhì)的質(zhì)量分數(shù), %；W3是加入固體基質(zhì)的絕干質(zhì)量,g；β是固體基質(zhì)的纖維素含量, %。

2結(jié)果與討論

2.1紫外光譜法測定木素質(zhì)量濃度時測定波長的優(yōu)化

對于酸法預處理,除木素溶出外,碳水化合物也會發(fā)生酸性降解反應,產(chǎn)生的物質(zhì)(如呋喃化合物和乙酰丙酸)在紫外光區(qū)也有吸收[16]。木素及干擾物的紫外光譜圖如圖1所示。由圖1可知,在 300 nm 前,50%的甲酸溶液具有一定的吸收；而在320 nm前,LA、F和HMF不僅分別在260、278和286 nm處具有最大吸收,三者在260～320 nm均具有明顯吸收,其可對甲酸預處理液中木素質(zhì)量濃度的測定產(chǎn)生較大干擾。因此,木素的測定波長應在260～320 nm區(qū)域外進行選擇。

值得注意的是,綠竹磨木木素的甲酸溶液不僅在上述碳水化合物降解產(chǎn)物紫外光吸收區(qū)域具有吸收,在320～420 nm區(qū)域也有吸收。在此區(qū)域,甲酸及其他碳水化合物降解產(chǎn)物均無吸收,不會對木素質(zhì)量濃度的測定產(chǎn)生干擾。木素質(zhì)量濃度相同時選擇較大吸光度所處的波長(325 nm)作為其測定波長。綠竹磨木木素質(zhì)量濃度與其在325 nm 處建立的標準曲線如圖2所示。從圖2可以看出,在325 nm處,綠竹磨木木素質(zhì)量濃度與其吸光度之間遵循朗伯-比爾定律,R2>0.99。因此,后續(xù)實驗中甲酸預處理液中木素質(zhì)量濃度的測定基于此波長處的線性曲線。

圖1　木素及干擾物的紫外光譜圖

2.2甲酸預處理脫木素工藝的響應面法優(yōu)化

圖2　綠竹磨木木素質(zhì)量濃度與其吸光度在325 nm處建立的標準曲線

對于甲酸預處理,甲酸含量(X1)、液比(X2)、最高溫度(X3)和保溫時間(X4)均可對木素溶出率產(chǎn)生影響。假設(shè)任意2個影響因素間均存在交互影響,則可根據(jù)全因素二次回歸方程對木素溶出率進行擬合,擬合結(jié)果如表2所示。

經(jīng)最小二乘法擬合,二次回歸方程中4個自變量及其交互所形成復合因素的系數(shù)擬合如表3所示。擬合模型及其檢驗如表4所示。對于擬合模型,其變異系數(shù)越低,表明實驗的可信度和精確度越高[17]；信噪比是有效信號與噪聲的比值,其大于4.0視為合理。實驗測得木素溶出率與模型預測值之間的關(guān)系如圖3所示。從表4和圖3可以看出,模型Ⅰ的變異系數(shù)和信噪比分別為9.37%和25.25,其實測值與預測值的相關(guān)系數(shù)(R2)高達0.94以上,表明該預測模型不僅具有較高的可信度和精確度,其預測效果也較好。然而,模型Ⅰ中包含14個參數(shù),模型稍顯復雜。為簡化模型,還需對各參數(shù)的顯著性進行判定。

表4　擬合模型及其檢驗

表2　以木素溶出率為因變量的四因素五水平

根據(jù)上述各單一和復合參數(shù)顯著性的判定,模型Ⅰ的二次回歸方程可簡化為模型Ⅱ。相對于模型Ⅰ,盡管模型Ⅱ的變異系數(shù)增大了1個百分點,但其模型參數(shù)從14個降至5個,可顯著簡化模型,增強其應用性。除變異系數(shù)外,模型Ⅱ的信噪比則從模型Ⅰ的25.25上升到31.13,進一步增強了模型的穩(wěn)定性。對于預測的準確性而言,模型Ⅱ所得預測值與實測值的相關(guān)系數(shù)(R2)也高于0.91。綜合可知,以單一和復合參數(shù)顯著性為判定依據(jù)來簡化二次回歸方程的方式具有可行性,所得簡化模型可較好地預測綠竹甲酸預處理過程中木素的溶出率。

表3　4個自變量及其交互影響的顯著性判定

注X0為二次方程的常數(shù)項；**表示存在顯著性。

2.3木素溶出率對纖維素酶水解轉(zhuǎn)化率和葡萄糖得率的影響

圖3　實驗測得木素溶出率與模型預測值之間的關(guān)系

木素溶出率(RL)對綠竹纖維素酶水解轉(zhuǎn)化率(CEC)和葡萄糖得率(YG)的影響如表5所示。從表5可看出,當纖維素酶和纖維二糖酶的用量分別為15 FPU/g和22.5 CBU/g時,未經(jīng)甲酸預處理的綠竹纖維素酶解轉(zhuǎn)化率低于5%。隨木素溶出率的不斷提高,纖維素酶水解轉(zhuǎn)化率也隨之提高。經(jīng)曲線擬合可知,木素溶出率與纖維素酶水解轉(zhuǎn)化率之間呈指數(shù)關(guān)系,其擬合方程為CEC=96.7+93.0/e0.04RL,R2=0.998。由此可見,根據(jù)表4中的模型Ⅱ可預測綠竹甲酸預處理過程中木素的溶出率；基于此指數(shù)函數(shù),可進一步預測固體基質(zhì)中纖維素的酶水解轉(zhuǎn)化率。

表5　木素溶出率對綠竹纖維素酶水解

從表5還可看出,隨木素溶出率的不斷提高,盡管固體基質(zhì)中纖維素酶水解轉(zhuǎn)化率不斷提高,綠竹中纖維素溶出率也隨之提高,但最終酶水解葡萄糖得率呈先升高后降低的變化趨勢。例如,當木素溶出率從19.2%提高至50%左右時,固體基質(zhì)中纖維素酶水解轉(zhuǎn)化率從56.2%提高到88.4%,纖維素溶出率也從5.8%提高到14.8%,但由于纖維素酶水解轉(zhuǎn)化率提高的速率大于纖維素溶出率提高的速率,最終葡萄糖得率從52.9%提高到75.3%；當木素溶出率繼續(xù)升高,由于纖維素酶水解轉(zhuǎn)化率提高的速率低于纖維素溶出率提高的速率,最終葡萄糖得率從75.3%降至71.5%。從獲得更高的可發(fā)酵葡萄糖得率的角度來看,綠竹甲酸預處理過程中較優(yōu)的木素溶出率約為50%。

3結(jié)論

3.1影響綠竹甲酸預處理木素溶出率的因素主要包括甲酸含量、液比、最高溫度和保溫時間；采用Design-Expert統(tǒng)計軟件對這4個因素進行四因素五水平的中心復合設(shè)計,可獲得用于預測木素溶出率的全因素二項式方程(模型Ⅰ),該模型含有14個參數(shù)。

3.2以參數(shù)的顯著性為判定依據(jù),去掉對木素溶出率無顯著影響的參數(shù)后,全因素二項式方程可精簡為僅含5個參數(shù)的簡化二項式方程(模型Ⅱ)。模型Ⅱ所得預測值與實測值的相關(guān)系數(shù)高于0.91,信噪比比模型Ⅰ高近20%,表明簡化模型可較好地預測綠竹甲酸預處理過程中木素的溶出率,且其穩(wěn)定性也較高。

3.3固體基質(zhì)中纖維素酶水解轉(zhuǎn)化率隨木素溶出率的提高而提高,但當木素溶出率高于50%以后,纖維素溶出率也隨之提高,最終酶水解葡萄糖得率呈先升高后降低的變化趨勢。為獲得更多的葡萄糖,較優(yōu)的木素溶出率約為50%。

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(責任編輯：陳麗卿)

Optimizing Lignin Removal of Green Bamboo during Formic Acid Pretreatment

by Response Surface Methodology

TANG Xing-pingLIU JingLUO Xiao-lin*HUANG Liu-lianCHEN Li-hui

(CollegeofMaterialEngineering,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,FujianProvince, 350002)

(*E-mail: xluo53@163.com)

Abstract：Central composite design (four-factor and five-level)of four independent variables influencing lignin removal rate(formic acid charge X1, the ratio of liquor to solid X2, pretreatment maximum temperature X3and the pretreatment time at maximum temperature X4) during formic acid pretreatment of green bamboo was conducted by Design-expert software. Based on this design, a binomial equation with full factors (Model Ⅰ) was developed to predict lignin removal rate. By removing the parameters without influence on lignin removal, the amount of parameters in prediction model was reduced from 14 to 5 based on the significance of single and multi parameters. As a result, a simplified binomial equation was obtained (Model Ⅱ). The coefficient variations (C.V.) of these two prediction models were similar. In the two models, the square of coefficients (R2) of both measured lignin removal rate and prediction value were higher than 0.9. But the ratio of signal-to-noise (SNR) of the simplified equation was 20% higher, which indicating the effectiveness and stability of the simplified model for predicting lignin removal during formic acid pretreatment of green bamboo. The exponential relationship between lignin removal (RL) and cellulose enzymatic conversion (CEC) could be expressed as CEC=96.7+93.0/exp(0.04RL), where R2was about 0.998. With the increase of RL, the cellulose removal (RC) also increased, but enzymatic hydrolysis glucose yield (YG) increased initially then reduced. The optimal RLwas approximately 50%.

Keywords：formic acid pretreatment; response surface methodology; lignin removal rate; cellulose enzymatic hydrolysis; glucose yield

作者簡介：唐興平,男,1958年生；高級實驗師；主要研究方向：生物質(zhì)精煉。

基金項目：國家自然科學基金項目(31300495)；教育部博士點基金項目(20123515120018) ；福建省自然科學基金項目(2013J05041,2014J05028)；中國博士后科學基金項目(2015M571955) ；福建省教育廳科技計劃項目(JB13033)。

收稿日期：2015- 08- 09

中圖分類號：TS749+.3

文獻標識碼：A

文章編號：1000- 6842(2015)04- 0001- 06

*通信聯(lián)系人：羅小林,E-mail:xluo53@163.com。