王新，耿文文，畢冬松(沂南縣人民醫(yī)院，山東沂南7600;山東大學(xué)齊魯醫(yī)院青島院區(qū);山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)

p53突變型結(jié)直腸癌組織中miR-4484的表達(dá)變化及意義

王新1，耿文文2，畢冬松3
(1沂南縣人民醫(yī)院，山東沂南276300;2山東大學(xué)齊魯醫(yī)院青島院區(qū);3山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)

摘要:目的觀察p53野生型和p53突變型結(jié)直腸癌組織中微小RNA-4484(miR-4484)的表達(dá)及轉(zhuǎn)染抗miR-4484后癌細(xì)胞增殖的變化。方法采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)p53野生型和突變型結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中miR-4484的表達(dá);將抗miR-4484和空載體分別轉(zhuǎn)入p53野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和p53突變型結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29中，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。結(jié)果p53突變型、野生型結(jié)直腸癌組織中miR-4484高表達(dá)者分別占68.1%、14.4%，二者比較P＜0.05。轉(zhuǎn)染抗miR-4484后，HCT116細(xì)胞OD值無(wú)明顯變化(P＞0.05)，HT29細(xì)胞OD值顯著下降(P＜0.05)。結(jié)論p53突變型結(jié)直腸癌組織中miR-4484呈高表達(dá)，轉(zhuǎn)染抗miR-4484可抑制HT29細(xì)胞增殖，miR-4484可能成為p53突變型結(jié)直腸癌的治療靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞:腸腫瘤;結(jié)直腸癌;微小RNA-4484; p53突變;細(xì)胞增殖

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤。p53是目前研究最廣泛的抑癌蛋白，已用于腫瘤常規(guī)病理檢查，p53突變提示患者預(yù)后較差。miRNA是生物體內(nèi)的非編碼RNA分子，通過(guò)參與細(xì)胞增殖、分化以及凋亡等多項(xiàng)生命活動(dòng)調(diào)控生物體的發(fā)育、衰老及腫瘤發(fā)生等一系列生理病理過(guò)程［1］。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2～5］。2014年6月～2015年2月，我們檢測(cè)了p53野生型與p53突變型結(jié)直腸癌組織中miR-4484的表達(dá)，觀察癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染抗miR-4484后細(xì)胞增殖的變化，探討其臨床意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取191例結(jié)直腸癌患者，男117例、女74例，年齡40～60歲，TNM分期T1～T3期。均行手術(shù)切除，病理檢查確診。其中p53陰性(野生型)97例，p53陽(yáng)性(突變型)94例。野生型中復(fù)發(fā)7例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移38例;突變型中復(fù)發(fā)12例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移49例。

1.2相關(guān)指標(biāo)觀察

1.2.1miR-4484檢測(cè)采用實(shí)時(shí)定量PCR方法。取結(jié)直腸癌組織及癌旁組織各0.5 g，加入TRIzol提取miRNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度。取2 μg模版RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件: 95℃3min預(yù)熱，95℃12 s、62℃40 s共40個(gè)循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，使用實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。應(yīng)用2－ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)量。以腫瘤組織相應(yīng)的癌旁組織miRNA表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)，判定腫瘤組織中miRNA的表達(dá)水平高低。

1.2.2細(xì)胞增殖檢測(cè)將p53野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116及p53突變型結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29分別加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116和HT29，分別用DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基配制成濃度2×104/mL的細(xì)胞懸液，以100 μL/孔接種于96孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h。按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)步驟將抗miR-4484和空載體分別轉(zhuǎn)入HCT116和HT29中，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處的OD值，連續(xù)觀察5d。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，比較采用χ2檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料的比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1野生型與突變型結(jié)直腸癌組織中miR-4484表達(dá)比較97例p53野生型結(jié)直腸癌組織中，miR-4484高表達(dá)14例(14.4%)、低表達(dá)83例(85.6%); 94例p53突變型結(jié)直腸癌組織中，miR-4484高表達(dá)64例(68.1%)、低表達(dá)30例(31.9%)。p53野生型與突變型miR-4484高表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2野生型與突變型結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖情況比較見(jiàn)表1。

表1　HCT116和HT29細(xì)胞增殖的OD值比較()

表1　HCT116和HT29細(xì)胞增殖的OD值比較()

注:與轉(zhuǎn)染空載體比較，*P＜0.05。

細(xì)胞類(lèi)型OD 值第2天　　第3天　　第4天　　第5天HCT116轉(zhuǎn)染空載體　0.033±0.003 0.058±0.007 0.096±0.002 0.209±0.008轉(zhuǎn)染抗miR-4484 0.033±0.002 0.068±0.003 0.119±0.003 0.244±0.007 HT29轉(zhuǎn)染空載體　0.045±0.002 0.078±0.009 0.159±0.008 0.321±0.011轉(zhuǎn)染抗miR-4484 0.027±0.002 0.045±0.004*0.078±0.009*0.151±0.007*

3　討論

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在人類(lèi)多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用［6］。miRNA能夠特異性識(shí)別靶基因的mRNA并與之結(jié)合，從而干擾mRNA的翻譯，促進(jìn)mRNA降解［7］，具有與抑癌基因相似的作用，能夠調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［8］;另一方面，miRNA也受到其他分子的精細(xì)調(diào)控，以發(fā)揮其正常生理功能［9］。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA相關(guān)基因可作為預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者的治療反應(yīng)及預(yù)后的標(biāo)志［10～12］。p53是重要的抑癌基因，參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［13］。p53突變是人類(lèi)結(jié)直腸癌細(xì)胞常見(jiàn)的突變類(lèi)型，p53突變往往提示結(jié)直腸癌惡性程度較高，預(yù)后較差［14］。本研究結(jié)果顯示，p53野生型結(jié)直腸癌組織中miR-4484高表達(dá)率顯著低于p53突變型。提示miR-4484表達(dá)與p53基因狀態(tài)有關(guān)，其表達(dá)可能受到p53的負(fù)向調(diào)節(jié)，miR-4484可能成為p53突變型結(jié)直腸癌的治療靶點(diǎn)。

為了進(jìn)一步明確miR-4484對(duì)腫瘤增殖的影響，我們檢測(cè)了miR-4484水平下調(diào)時(shí)癌細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染抗miR-4484的HCT116細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載體的HCT116細(xì)胞相比，細(xì)胞增殖無(wú)明顯變化，表明miR-4484表達(dá)對(duì)p53野生型癌細(xì)胞的增殖率無(wú)明顯影響;而轉(zhuǎn)染抗miR-4484的HT29細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載體的HT29細(xì)胞相比增殖明顯下降，表明HT29細(xì)胞的增殖與miR-4484表達(dá)呈正相關(guān)，提示miR-4484可能對(duì)p53突變型結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，p53能夠通過(guò)反饋機(jī)制對(duì)miRNA的表達(dá)水平及功能進(jìn)行調(diào)節(jié)［15］，但p53對(duì)miR-4484的調(diào)節(jié)機(jī)制是否也依賴(lài)于反饋環(huán)的形成仍有待研究。p53作為核心抑癌分子，亦有可能通過(guò)對(duì)miR-4484下游分子通路的抑制發(fā)揮其抑癌功能。

綜上所述，miR-4484的表達(dá)水平及對(duì)直結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用與p53狀態(tài)有關(guān)，p53可能通過(guò)反饋?zhàn)饔秘?fù)向調(diào)控miR-4484的表達(dá)，亦可能通過(guò)對(duì)miR-4484下游通路的負(fù)向調(diào)控抑制miR-4484的功能，其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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收稿日期:( 2015-04-01)

文章編號(hào):1002-266X(2015)34-0070-02

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

中圖分類(lèi)號(hào):R735.3

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.031