吳巧玉，莫一杰，汪燕利，蔣冬花

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華　321004)

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一株高產(chǎn)淀粉酶紅曲霉菌株的分離鑒定及其培養(yǎng)特性研究

吳巧玉，莫一杰，汪燕利，蔣冬花

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華321004)

摘要：從全國(guó)各地收集的自然發(fā)酵紅曲米中分離純化獲386株紅曲霉菌株；經(jīng)篩選獲1株高產(chǎn)淀粉酶的Mp-42優(yōu)質(zhì)菌株，根據(jù)Mp-42菌株的形態(tài)、生理生化和ITS基因序列，鑒定為紫色紅曲霉(Monascus purpureus).Mp-42菌株具有高產(chǎn)淀粉酶、生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)孢量多等優(yōu)良特性，在發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為6.0，培養(yǎng)溫度為30 ℃條件下，Mp-42菌株淀粉酶酶活可達(dá)168 178 U/mL.

關(guān)鍵詞：淀粉酶；紫色紅曲霉；篩選；優(yōu)化

目前能夠滿足工業(yè)應(yīng)用需求的淀粉酶主要來(lái)源于細(xì)菌和絲狀真菌[1].紅曲霉(Monascus)在生長(zhǎng)過(guò)程中能產(chǎn)生多種酶，如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、脂肪酶等[2].同時(shí)，它也是我國(guó)重要的食用、藥用真菌，是傳統(tǒng)中藥紅曲的基原菌，也是制作傳統(tǒng)飲品紅曲酒的主要菌種，被廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵、食品著色、中藥配伍等方面.

淀粉酶是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物(主要是胞外酶)中的水解酶[3].它可以將淀粉水解形成糊精、低聚糖和葡萄糖等低分子物質(zhì)，可改善制品的風(fēng)味，生成的葡萄糖的產(chǎn)物又可以進(jìn)一步異構(gòu)化成果糖，得到商品化的高果糖漿[4].近年來(lái)，對(duì)淀粉酶的研究大力推動(dòng)著淀粉深加工的發(fā)展，淀粉酶在造紙制漿、啤酒和威士忌的生產(chǎn)，食品業(yè)，飼料，酒精的生產(chǎn)及醫(yī)藥都應(yīng)用廣泛，它占據(jù)了大約全國(guó)四分之一的酶市場(chǎng)[5-7].

本研究旨在從全國(guó)各地收集的自然發(fā)酵紅曲米中篩選、分離、純化獲高產(chǎn)淀粉酶優(yōu)質(zhì)菌株，可用于淀粉酶的生產(chǎn)、食品加工、調(diào)味品生產(chǎn)、酒類釀造、酒精的生產(chǎn)等.

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌株來(lái)源

從全國(guó)各地收集的自然發(fā)酵紅曲米中分離純化所獲的386株紅曲霉菌株.

1.1.2培養(yǎng)基

1)PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂粉2.0%，H2O 1 L，pH 6.0～6.5.用于紅曲霉菌株的分離純化.

2)淀粉分離培養(yǎng)基：蛋白胨，20 g；K2HPO4，2 g；MgSO4，0.5 g；KCl，0.5 g；酵母粉，1 g；瓊脂，15 g；可溶性淀粉，50 g；H2O，1 L；pH 4.0～5.0.用于產(chǎn)淀粉酶紅曲霉菌株的初篩.

3)種子培養(yǎng)基：蛋白胨，1 g；NaCl，1 g；可溶性淀粉，1 g；H2O，1 L；pH，7.0～7.2.它1∶1用于產(chǎn)淀粉酶紅曲霉菌株的種子培養(yǎng).

4)發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨，10 g；NaCl，5 g；牛肉膏，3 g；可溶性淀粉，2.5 g；H2O，1 L；pH，7.0～7.2.它1∶1用于產(chǎn)淀粉酶紅曲霉菌株的復(fù)篩.

1.1.3主要試劑和溶液的配制

DNS試劑主要參照《食品成分分析手冊(cè)》[8]上的方法：稱取3，5-二硝基水楊酸3.15 g，加水500 mL.攪拌5 s，水浴至45 ℃.然后逐步加入100 mL 0.2 g/mL的氫氧化鈉溶液，同時(shí)不斷攪拌.直到溶液清澈透明.再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0 g、苯酚2.50 g和無(wú)水亞硫酸鈉2.50 g.繼續(xù)45 ℃水浴加熱，同時(shí)補(bǔ)加水300 mL，不斷攪拌，直到加入的物質(zhì)完全溶解.冷卻至室溫后，用水定容至1000 mL.過(guò)濾后取濾液，儲(chǔ)存在棕色瓶中，避光保存?zhèn)溆?

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1紅曲霉菌株的分離純化

將紅曲米0.5 g研磨成粉，取少量均勻的灑入PDA培養(yǎng)基表面，30 ℃培養(yǎng)48 h，待白色絨毛狀菌絲長(zhǎng)出后，取少許菌絲轉(zhuǎn)接于另一PDA培養(yǎng)平板上繼續(xù)培養(yǎng)1周后，重復(fù)上述分離純化3次，即可得到得性狀均一的紅曲霉菌株.將篩選獲得的紅曲霉菌株編號(hào)保存于25%甘油中，置于4 ℃冰箱備用.從全國(guó)各地收集的自然發(fā)酵紅曲米中分離純化共獲386株紅曲霉菌株.

1.2.2產(chǎn)淀粉酶紅曲霉菌株的初篩

用透明圈法.將分離純化得到的386株紅曲霉菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，轉(zhuǎn)接到淀粉分離培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)7 d后加入碘液染色，通過(guò)測(cè)量紅曲霉菌落周圍的透明圈大小和菌落直徑大小，計(jì)算a/b的比值，比值的大小可以作為紅曲霉菌株產(chǎn)淀粉酶活性大小的初篩指標(biāo)，篩選a/b比值大的菌株進(jìn)行復(fù)篩.

1.2.3產(chǎn)淀粉酶紅曲霉菌株的復(fù)篩

1)紅曲霉菌株的培養(yǎng)和淀粉粗酶液的制備

將初篩a/b比值較大的50株紅曲霉菌株先接入種子培養(yǎng)基中，在30 ℃，180 r/min下培養(yǎng)3 d后，取1 mL孢子懸液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在30 ℃，180 r/min下培養(yǎng)7 d后，培養(yǎng)液用8000 r/min離心10 min，取上清液即為淀粉粗酶液[9].

2)紅曲霉菌株淀粉酶活的檢測(cè)[10]

在50 mL三角瓶中，加入2 mL 5%可溶性淀粉和2 mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，先40 ℃水浴10 min，然后加1 mL粗酶液，40 ℃水浴反應(yīng)1 h后加入DNS試劑2 mL終止反應(yīng)，搖勻后置沸水浴中煮沸5 min，立即冷卻，用水定容至20 mL后，于520 nm波長(zhǎng)下，用10 mm比色皿在分光光度計(jì)迅速測(cè)定反應(yīng)液的吸光值.

3)紅曲霉菌株淀粉酶酶活的計(jì)算和定義

參照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[11](圖1)，根據(jù)淀粉酶酶活的定義計(jì)算不同紅曲霉菌株產(chǎn)淀粉酶的酶活.

淀粉酶酶活的定義：在以上反應(yīng)條件下，1 min釋放1 μg葡萄糖的酶量定義為1個(gè)活力單位.

1.2.4菌株的鑒定

將菌株在PDA培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)7 h后觀察菌落特征和菌絲的顯微特征[12-13].同時(shí)提取紅曲霉Mp-42菌株基因組，擴(kuò)增ITS基因組序列，送上海生物工程有限公司測(cè)序.

圖1　葡萄糖質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.5生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

1)Mp-42菌株的培養(yǎng)

淀粉分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的Mp-42菌株，用0.9 cm的打孔器打出菌餅6個(gè)接入50 mL的種子培養(yǎng)基中，置于30 ℃，180 r/min搖床中；培養(yǎng)3 d后，取1 mL孢子懸液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，置于30 ℃，180 r/min搖床中；培養(yǎng)7 d后，取1 mL培養(yǎng)液至1.5 mL離心管中測(cè)定菌絲干重.

2)菌絲干重的測(cè)定

1.5 mL空離心管先放于在105 ℃的烘箱中烘干15 min后取出，放于干燥器內(nèi)冷卻后稱取空離心管質(zhì)量為m；每管吸取1 mL培養(yǎng)液，在4 ℃，10 000 r/min離心10 min，棄上清；加入無(wú)菌蒸餾水，吹打均勻后再離心，棄上清，放入105 ℃烘箱中烘至恒重，放入干燥器內(nèi)冷卻后稱取質(zhì)量為M；菌絲的干重質(zhì)量為M-m，每隔8 h取1 mL Mp-42培養(yǎng)液測(cè)定菌絲干重[14].以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，Mp-42菌株菌絲干重為縱坐標(biāo)繪制Mp-42菌株的生長(zhǎng)曲線.

1.2.6培養(yǎng)溫度和初始pH對(duì)Mp-42菌株淀粉酶酶活的影響

培養(yǎng)溫度：淀粉分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的Mp-42菌株的菌落，用0.9 cm的打孔器打出菌餅6個(gè)接入50 mL的種子培養(yǎng)基中，分別置于24，26，28，30，32，34 ℃的溫度下，180 r/min搖床培養(yǎng)；3 d后取1 mL孢子懸液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，分別置于24，26，28，30，32，34 ℃的溫度下，180 r/min搖床培養(yǎng)7 d；培養(yǎng)液在8000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液.

根據(jù)紅曲霉菌株淀粉酶活的檢測(cè)法，參照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線和淀粉酶酶活的定義計(jì)算不同初始溫度對(duì)淀粉酶的酶活的影響.

初始pH：調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，接種、培養(yǎng)、酶活檢測(cè)等方法同培養(yǎng)溫度.

1.2.7碳源對(duì)Mp-42菌株淀粉酶酶活的影響

在產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，改變不同的碳源：分別以蔗糖，麥芽糖，木糖，葡萄糖，可溶性淀粉為碳源，檢測(cè)檢測(cè)不同碳源對(duì)Mp-42菌株淀粉酶酶活的影響.

1.2.8氮源對(duì)Mp-42菌株淀粉酶酶活的影響

在產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，改變不同的氮源：分別以牛肉膏，蛋白胨，酵母膏，硫酸銨，磷酸二氫銨為氮源，檢測(cè)不同氮源對(duì)Mp-42菌株淀粉酶酶活的影響.

2結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)淀粉酶紅曲霉菌株的初篩

將分離純化得到的386株紅曲霉菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，轉(zhuǎn)接到淀粉分離培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)7 d后加入碘液染色，測(cè)量紅曲霉菌落周圍的透明圈大小和菌落直徑大小，計(jì)算a/b的比值.表1為15株a/b比值較高的菌株.其中編號(hào)為Mp-42的菌株透明圈最大，a/b比值為0.1867(圖2).

表1　15株紅曲霉菌株透明圈的大小

圖2　Mp-42菌株在淀粉分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的菌落和透明圈

2.2產(chǎn)淀粉酶紅曲霉菌株的復(fù)篩

將15株紅曲霉菌株，先接入種子培養(yǎng)基中，然后將其孢子懸液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基，離心后獲得粗酶液.通過(guò)檢測(cè)和比較15株紅曲霉的淀粉酶酶活的大小，最終篩選出淀粉酶活性最高的Mp-42菌株.Mp-42菌株淀粉酶酶活可達(dá)168～178 U/mL.

2.3Mp-42菌株的形態(tài)特征及鑒定

圖3　Mp-42菌株在PDA培養(yǎng)基本上培養(yǎng)15 d菌落正面

菌落特征：PDA培養(yǎng)基上的菌落初期為白色絨毛狀，4 d后中心菌絲開始變紅色，氣生菌絲密而短小，培養(yǎng)15 d后色澤變?yōu)殚偌t色，邊緣呈白色，菌落直徑達(dá)54 mm(圖3)；在淀粉分離培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)7 d后，菌落直徑為2.58 cm，呈輻射狀、裂紋比較密集，邊緣光滑呈淡褐色，皮膜狀，正面從里到外顏色均為淡黃，微微隆起(圖2).

顯微特征：顯微鏡觀察菌絲光滑，有隔膜，直徑4～6 μm的分支狀，有深淺不一的紅褐色色素顆粒；分生孢子球形或倒梨形，單生或成鏈，直徑5～8 μm；閉囊殼呈球形，囊內(nèi)孢子可見，子囊孢子橢球形，直徑4～7 μm，透明淡紅色或無(wú)色(圖4).

圖4　Mp-42菌株顯微特征

生理生化特征：該菌株適宜生長(zhǎng)溫度范圍為26～38 ℃，適宜pH生長(zhǎng)范圍為4.0～8.0.能夠很好的利用各種有機(jī)碳源，如可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、番薯粉等；在氮源利用方面，可利用硝酸鈉、氯化銨、硝酸銨等無(wú)機(jī)氮源和牛肉膏、酵母粉、蛋白胨等多種有機(jī)氮源；Mp-42菌株能夠高產(chǎn)淀粉酶.

ITS基因序列：其長(zhǎng)度為604 bp(圖5)，與紫色紅曲霉的相似度達(dá)99%(圖6).

圖5　Mp-42菌株ITS基因序列(604 bp)

圖6　基于ITS基因序列建立的紅曲霉屬系統(tǒng)發(fā)育樹

根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特征和ITS基因序列分析，結(jié)合李鐘慶和郭芳紅曲菌分種檢索表，將Mp-42菌株鑒定為紫色紅曲霉.

2.4Mp-42菌株的生長(zhǎng)曲線

Mp-42菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度較快，培養(yǎng)8 ～40 h為遲緩期，40 ～120 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，120 ～176 h為穩(wěn)定生長(zhǎng)期，第176 h后進(jìn)入衰亡期(圖7).

圖7　Mp-42菌株在淀粉發(fā)酵培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)曲線

2.5培養(yǎng)溫度和初始pH對(duì)Mp-42菌株的淀粉酶活性影響

不同培養(yǎng)溫度對(duì)Mp-42菌株產(chǎn)淀粉酶酶活有一定的影響，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)，Mp-42菌株產(chǎn)淀粉酶活性最大，為168.1 U/mL(圖8).

圖8　培養(yǎng)溫度對(duì)Mp-42菌株的淀粉酶活性影響

不同培養(yǎng)基初始pH對(duì)Mp-42菌株產(chǎn)酶的活性的影響如圖9，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為6.0時(shí)，Mp-42菌株產(chǎn)淀粉酶活性最大，為178.2 U/mL.

圖9　培養(yǎng)基初始pH對(duì)Mp-42菌株的淀粉酶活性影響

2.6碳源和氮源對(duì)Mp-42菌株淀粉酶酶活的影響

不同碳源對(duì)Mp-42菌株產(chǎn)淀粉酶酶活有一定的影響，當(dāng)選擇的碳源為可溶性淀粉時(shí)，Mp-42菌株產(chǎn)淀粉酶活性最大，為173.9 U/mL(圖10).

圖10　碳源對(duì)Mp-42菌株的淀粉酶活性影響

不同氮源對(duì)Mp-42菌株產(chǎn)酶的活性有一定的影響，當(dāng)選擇的氮源為酵母膏時(shí)，Mp-42菌株產(chǎn)淀粉酶活性最大，為94.3 U/mL(圖11).

圖11　氮源對(duì)Mp-42菌株的淀粉酶活性影響

3討論

本研究從自然發(fā)酵的紅曲米中，經(jīng)篩選獲1株高產(chǎn)淀粉酶的Mp-42優(yōu)質(zhì)菌株，根據(jù)ITS基因序列鑒定為紫色紅曲霉.本研究篩選得到的Mp-42優(yōu)質(zhì)菌株，在培養(yǎng)基最適初始pH為6.0時(shí)，該菌株產(chǎn)淀粉酶酶活達(dá)最大值為178.2 U/mL，使用該酶進(jìn)行液化可避免 pH 的調(diào)節(jié)，節(jié)約成本，簡(jiǎn)化加工.

近年有相關(guān)研究報(bào)道，陳彬等[15]研究結(jié)果顯示紅曲菌GMA4經(jīng)液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的葡萄糖淀粉酶最高達(dá)到40.1 U/mL，紅曲菌SM005經(jīng)液態(tài)發(fā)酵酶活力達(dá)到65 U/mL.邵偉等[16]研究發(fā)現(xiàn)，紅曲霉培養(yǎng)約在第，淀粉酶酶活達(dá)最大值為85 U/mL，菌體生長(zhǎng)的穩(wěn)定階段一直可延續(xù)至第.本研究篩選的Mp-42紅曲霉菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)第時(shí)，檢測(cè)到紅曲霉生物量達(dá)到最大值為10.5 g/mL.Mp-42紅曲霉菌株在初始pH為6.0，初始培養(yǎng)溫度為30 ℃條件下，培養(yǎng)后，檢測(cè)Mp-42紅曲霉菌株淀粉酶酶活可達(dá)168～178 U/mL，菌體生長(zhǎng)的穩(wěn)定階段一直可延續(xù)至第8天，具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景.

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(編輯崔思榮)

On the Screening of OneMonascusStrain with High-yielding

Amylase and its Culture Characteristics

WU Qiaoyu, MO Yijie, WANG Yanli, JIANG Donghua

(College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal University，Jinhua Zhejiang 321004，China)

Abstract:To obtain Monascus strain which had high efficient degradation for starch,386 Monascus strains were separated and purified from the natural fermentation of red yeast rice all over the country.Strain Mp-42 which had high yield of amylase was obtained through screening.According to the morphologies,physiological and biochemical characteristics and ITS gene sequences, strain Mp-42 was identified as Monascus purpureus.Strain Mp-42 has many good qualities,such as high yield amylase, fast growth, high amount of spores.Strain Mp-42 of amylase enzyme activity is up to 168 U/mL -178 U/mL under the condition of the initial fermentation pH 6.0,temperature of 30 ℃.

Key words:amylase; Monascus purpureus; screen; optimization

中圖分類號(hào)：X172

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-358X(2015)04-0054-07

通訊作者：蔣冬花(1964-)，女，浙江東陽(yáng)人，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事微生物分子生物學(xué)與應(yīng)用微生物學(xué)研究.

作者簡(jiǎn)介：吳巧玉(1990-)，女，河南商城人，碩士研究生,主要從事應(yīng)用微生物研究.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué) (31270061)

收稿日期：2015-07-08