張　為，譚　璐，張廣求，劉　文

(黃岡市中心醫(yī)院藥劑科，黃岡　438000)

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高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定參菊洗劑中苦參堿和蛇床子素的含量

張為，譚璐，張廣求*，劉文

(黃岡市中心醫(yī)院藥劑科，黃岡438000)

摘要：目的建立同時(shí)測(cè)定參菊洗劑中苦參堿和蛇床子素含量的方法。方法采用高效液相色譜法。色譜柱為Dionex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-2.4 mL·L-1三乙胺水溶液(用磷酸調(diào)pH至7.6)，梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果苦參堿和蛇床子素分別在30～192 μg·mL-1(r=0.999 5)，4.4～70.4 μg·mL-1(r=0.999 5)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；平均回收率分別為99.4%和97.2%，RSD分別為1.4%和4.1%(n=9)。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于參菊洗劑的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：參菊洗劑；苦參堿；蛇床子素；高效液相色譜法；含量測(cè)定

參菊洗劑是黃岡市中心醫(yī)院根據(jù)臨床驗(yàn)方研制的中藥制劑(批準(zhǔn)文號(hào)：鄂藥制字Z20110230)，主要由苦參、野菊花、蛇床子、黃柏等中藥制成。該藥具有消炎、止癢、除穢、殺菌等功效，用于細(xì)菌性、真菌性、滴蟲性陰道炎及多種皮膚瘙癢癥，具有較好的臨床療效[1]。為更好地控制該制劑的質(zhì)量，本文參考有關(guān)文獻(xiàn)[2-4]，建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定參菊洗劑中苦參堿和蛇床子素含量的方法。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于參菊洗劑的質(zhì)量控制。

1儀器與試藥

1.1儀器戴安Ultimate3000型高效液相色譜儀(包括Ultimate3000泵，Ultimate3000紫外儀器有限公司)；pHs-3C型pH計(jì)(杭州奧立龍儀器有限公司)；HN1006型超聲清洗機(jī)(廣州華南超聲設(shè)備廠)。

1.2試藥苦參堿對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110805-200508)；蛇床子素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110822-200305)；參菊洗劑(黃岡市中心醫(yī)院自制，批號(hào)130804，131221，140318)；甲醇、乙腈均為色譜純；水為純化水；三氯甲烷、三乙胺、磷酸均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Dionex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-2.4 mL·L-1三乙胺水溶液(用磷酸調(diào)pH至7.6)，采用梯度洗脫(0～10 min：乙腈體積分?jǐn)?shù)25%，10～17 min：乙腈體積分?jǐn)?shù)25%～75%，17～21 min：乙腈體積分?jǐn)?shù)75%)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液精密稱取苦參堿對(duì)照品3.0 mg、蛇床子素對(duì)照品2.2 mg，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得含苦參堿0.3 mg·mL-1、蛇床子素0.22 mg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2供試品溶液取參菊洗劑超聲處理30 min，放置過夜，離心(3 000 r·min-1，10 min)，精密量取上清液10 mL，用濃氨溶液調(diào)pH至9.2，再用三氯甲烷振搖提取4次(20，15，10和10 mL)。合并三氯甲烷液，用飽和氯化鈉水溶液洗滌2次(20和10 mL)，將三氯甲烷液置于60 ℃水浴上氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?0 mL甲醇超聲溶解，置于10 mL量瓶中稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.2.3陰性對(duì)照溶液按照處方比例及生產(chǎn)工藝，制備不含苦參和蛇床子的陰性樣品，依照2.2.2項(xiàng)下所述供試品溶液的制備方法制備即得。

2.3系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各20 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。由圖1可見，苦參堿和蛇床子素保留時(shí)間內(nèi)分別為10.97和18.85 min，且分離度較好，理論塔板數(shù)以苦參堿計(jì)大于3 000，陰性對(duì)照品溶液在相應(yīng)保留時(shí)間內(nèi)無色譜峰出現(xiàn)，對(duì)2組分的分析未見干擾，結(jié)果表明，該方法系統(tǒng)適用性良好。

2.4線性關(guān)系考察精密量取2.2.1項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液適量，分別制備成含苦參堿30，60， 120，168和192 μg·mL-1，蛇床子素4.4，8.8，17.6，35.2和70.4 μg·mL-1的溶液，分別進(jìn)樣20 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以峰面積(Y)為橫坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(X)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得苦參堿和蛇床子素的回歸方程分別為：Y=0.809 2X+0.444 5(r=0.999 5，n=5)；Y=1.278 8X+0.829 1(r=0.999 5，n=5)。結(jié)果表明，苦參堿和蛇床子素分別在30～192和4.4～70.4 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度實(shí)驗(yàn)取同一質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜峰面積。結(jié)果顯示，苦參堿和蛇床子素的RSD分別為0.47%(n=5)和0.62%(n=5)，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取2.2.2項(xiàng)下制備的供試品溶液適量(批號(hào)130804)，分別于0，2，4，6，8，10和12 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，苦參堿和蛇床子素的RSD值分別為0.11%(n=7)和0.32%(n=7)，結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)樣品(批號(hào)130804)5份，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備5份供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定色譜峰面積。結(jié)果顯示，苦參堿和蛇床子素的RSD分別為0.10%(n=5)和0.19%(n=5)，表明該方法的重復(fù)性良好。

圖1HPLC圖

A.對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.苦參堿；2.蛇床子素

Fig.1 HPLC chromatograms

A.substance control；B.test sample；C.negative control；

1.matrine；2.osthole

2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密量取已知含量的樣品(批號(hào)130804)10 mL，分別加入相當(dāng)于樣品中已知含量80%，100%和120%的苦參堿和蛇床子素對(duì)照品，按照2.2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。苦參堿平均加樣回收率為99.4%，RSD=1.4%；蛇床子素平均加樣回收率為97.2%，RSD=4.1%。

表1加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of recovery tests

(n=9)

2.9樣品含量測(cè)定取3批樣品，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算苦參堿和蛇床子素的含量，結(jié)果3批參菊洗劑中苦參堿含量分別為279.1，24.8和276.0 μg·mL-1，RSD分別為0.98%，1.12%和1.26%；蛇床子素含量分別為11.30，9.980和10.20 μg·mL-1，RSD分別為1.02%，1.37%和1.82%。

3討論

3.1提取條件的選擇苦參堿溶于水、苯、三氯甲烷、甲醇和乙醇等溶劑，蛇床子素溶于甲醇、乙醇、三氯甲烷和丙酮等有機(jī)溶劑。綜合考慮，選擇三氯甲烷和乙酸乙酯作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三氯甲烷提取率更高；苦參堿在堿性條件下以分子形式存在，能更好地溶于有機(jī)溶劑，最終選擇用三氯甲烷在堿性條件下提取樣品的有效成分[5]。

3.2流動(dòng)相的選擇根據(jù)文獻(xiàn)[4-5]選用不同比例的甲醇-水洗脫，發(fā)現(xiàn)苦參堿色譜峰存在不同程度的拖尾現(xiàn)象，調(diào)節(jié)pH值也無法完全解決問題。用乙腈-三乙胺水溶液作為流動(dòng)相[2]，調(diào)整三乙胺的含量和流動(dòng)相的pH值。pH值較低時(shí)，苦參堿出峰較早，不能與雜質(zhì)峰分開；pH值較高時(shí)，苦參堿分離效果較好，但pH值超出色譜柱的耐受范圍，易損壞色譜柱。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)三乙胺含量為2.4 mL·L-1、pH值為7.6 時(shí)苦參堿的出峰時(shí)間及峰形均較好，且不會(huì)損害色譜柱。此外，苦參堿和蛇床子素的極性相差較大，用等度洗脫很難達(dá)到較好的分析效果，采用梯度洗脫效果較好，故最終選用乙腈-2.4 mL·L-1三乙胺水溶液(用磷酸調(diào)pH值至7.6)作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

3.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇文獻(xiàn)報(bào)道，苦參堿的最大紫外吸收波長(zhǎng)有210[6]，200～205[7]和220 nm[8]不等，蛇床子素的紫外最大吸收波長(zhǎng)在203[6]和322 nm[9]不等，綜合考慮苦參堿和蛇床子素吸收峰的強(qiáng)弱及樣品中二者含量的高低，選擇210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果顯示，2組分在此波長(zhǎng)處都有較好的吸收。

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Simultaneous determination of matrine and osthole in Shenju Lotion by HPLC

ZHANG Wei，TAN Lu，ZHANG Guangqiu*，LIU Wen(Department of Pharmacy，Huanggang Central Hospital，Huanggang 438000，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method for content determination of matrine and osthole in Shenju Lotion. MethodsHPLC method was used.The sample(20 μL) was separated on a Dionex C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm)with a gradient elution using acetonitrle-2.4 mL·L-1triethylamine (pH was adjusted to 7.6 with phosphoric acid) as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 210 nm，and the column temperature was 30 ℃. ResultsMatrine and osthole showed good linearity in the ranges of 30-192 μg·mL-1(r=0.999 5)and 4.4-70.4 μg·mL-1(r=0.999 5)，respectively；the average recoveries of matrine and osthole were 99.4% and 97.2%，with RSD 1.4% and 4.1%(n=9)，respectively. ConclusionThis method is simple，rapid and accurate，and can be used for the quality control of Shenju Lotion.

Key words:Shenju Lotion；matrine；osthole；HPLC；content determination

收稿日期：(2015-05-28)

通信作者：*張廣求，男，副主任藥師

作者簡(jiǎn)介：張為，女，藥師，碩士

基金項(xiàng)目：湖北省黃岡市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：黃科字[2013]76號(hào))

中圖分類號(hào)：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)01-0040-03

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.01.013