李元忠，譚國(guó)生，李福安，張得鈞*

(1.青海省海東市樂(lè)都區(qū)中醫(yī)院，青海 樂(lè)都 810799；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001)

五味余甘子散對(duì)大鼠心肌缺血再灌損傷Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

李元忠1，譚國(guó)生2，李福安2，張得鈞2*

(1.青海省海東市樂(lè)都區(qū)中醫(yī)院，青海 樂(lè)都 810799；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001)

摘要目的探討藏方五味余甘子散對(duì)大鼠心肌缺血再灌損傷相關(guān)細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響及其可能機(jī)理。方法96只SD大鼠隨機(jī)分成6組，分別為五味余甘子散高、中、低劑量組，偽手術(shù)組，模型組以及陽(yáng)性對(duì)照組，每組16只。用結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支法制備心肌缺血再灌注模型，再灌注40 min后，檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)。結(jié)果五味余甘子散能顯著提高心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制Bax蛋白的表達(dá)，同時(shí)提高Bcl-2/Bax比值。結(jié)論五味余甘子散對(duì)大鼠心肌缺血再灌損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過(guò)上調(diào)凋亡Bcl-2蛋白表達(dá)，提高Bcl-2/Bax比值，下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞五味余甘子散心肌缺血再灌注損傷Bcl-2 Bax

通信作者*：，博士，教授，E-mail：djzhang@ nwipb.ac.cn

※：李元忠(1975~)，男，漢族，青海籍，主治醫(yī)師

中圖分類(lèi)號(hào)R932

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼識(shí)碼A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.02.012

AbstractObjectiveTo explore the influence of apoptosis-associated protein expression and its possible mechanism of Wuwei Yuganzi San，one of Tibetan medicine，on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats. Methods Ninety-six Sprague-Dawley rats were assigned randomly into six groups including high dose group，moderate dose group and low dose group according to the dosage of Wuwei Yuganzi San administrated.Moreover，Sham-operation group，Model group and Positive control group were supplemented.And each group was 16 rats，Myocardial ischemia-reperfusion injury model was established by ligation of the left anterior descending coronary artery(LAD)of the heart.Following 40 min reperfusion in rats，Bcl-2 and Bax protein expression in cardiomyocytes were detected.Results Myocardial Bcl-2 protein expression was significantly augmented well paralleling with an increase in ratio of Bcl-2 to Bax，while Bax protein expression was inhabited.Conclusion WuweiYuganzi San may have a protective effect on myocardial ischemia-reperfusion injury model.The mechanisms may associate with an up-regulated expression of Bcl-2，and an increased ratio of Bcl-2/Bax and a low-regulated expression of Bax，resulting in suppression of apoptosis.

KeywordsWuweiyuganzisanMyocardial ischemia-reperfusion injuryBcl-2 and Bax

收稿日期2015-01-03

THE INFLUENCE OF TIBETAN MEDICINE WUWEIYUGANZISAN

ON Bcl-2 AND Bax EXPRESSION IN MYOCARDIAL

ISCHEMIA-REPERFUSION INJURY IN RATS

Li Yuanzhong1，Tan Guosheng2，Li Fuan2，Zhang Dejun2

(1.Ledu Hospital of Traditional Chinese Medicine，Haidong，Qinghai，810799；

2.Qinghai University Medical College，Xining，Qinghai，810001)

心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)機(jī)制很多，細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞死亡重要的形式之一[1]。近年來(lái)，對(duì)抗心肌缺血再灌注損傷凋亡的報(bào)道較多，但所述機(jī)制不一，且無(wú)相應(yīng)解決方法。五味余甘子散化裁于《帝瑪醫(yī)著選集》[2]中“居如聶莪”方，其由余甘子、藏錦雞兒等組成，臨床應(yīng)用效果明顯，但缺乏相關(guān)應(yīng)用依據(jù)。因此，本研究通過(guò)觀測(cè)心肌缺血再灌注損傷后心肌組織中Bcl-2蛋白及Bax蛋白表達(dá)變化，來(lái)探討五味余甘子散對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象

清潔級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體重180～220 g，共96只，購(gòu)自甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK(甘)2011-0001。

1.1.2藥品及試劑

五味余甘子散(由青海省金訶藏藥有限公司提供)，普萘洛爾(山西晉太藥業(yè)，規(guī)格：10mg/片，批號(hào)：20110502)，氨基甲酸乙酯(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H14021523)；大鼠心肌凋亡Bc1-2及Bax蛋白試劑盒(20131113. 60284R)。

1.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器

YP601N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，星海Seastar旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(錫市星海五生化設(shè)備有限公司)，SHB-B型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)，動(dòng)物人工呼吸機(jī)(浙江醫(yī)科大學(xué)儀器實(shí)驗(yàn)廠)，ML818 PowerLab生物信息信息采集系統(tǒng)(澳大利亞ADinstrument公司)，TDL50B飛鴿牌臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1藥物制備

將五味余甘子散各味藥按一定比例配制，總量500 g，將諸藥飲片稍加粉碎，混勻置砂鍋中，加8倍藥量蒸餾水，浸泡1 h后，先以武火煮沸，后用文火煎煮50 min后將藥液倒出，再加約為藥量4倍的蒸餾水再煎提一次，最后將兩次煎提液充分混勻，四層紗布過(guò)濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(40℃～50℃，30r/min)中進(jìn)行減壓濃縮，濃縮至100%濃縮液，即1 mL濃縮液含生藥1 g。將500 mL濃縮液按60 kg成人與200 g大鼠的劑量估算關(guān)系進(jìn)行折算[3]，配成低、中、高三個(gè)劑量，分別為0.093、0.187、0.373 g/mL(分別為人的7、14、28倍劑量)；普萘洛爾濃度配成0.0013 g/mL，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2動(dòng)物分組及給藥

經(jīng)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)，96只大鼠隨機(jī)分成6組，分別為五味余甘子散高、中、低劑量組，偽手術(shù)組，模型組以及陽(yáng)性對(duì)照組，每組16只，雌雄各半。五味余甘子散低、中、高組分別給予1.40、2.80、5.60 g/(kg·d)五味余甘子散，偽手術(shù)組及模型組分別給予相應(yīng)濃度生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給予0.02 g/(kg·d)普萘洛爾，每日1次灌胃，連續(xù)灌胃10 d。

1.2.3動(dòng)物模型制備

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[4]稍加改進(jìn)，大鼠經(jīng)稱(chēng)重后，以20%的氨基甲酸乙酯溶液(5mL/kg)行腹腔麻醉，固定，備皮，連接好Powerlab數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)并記錄正常心電圖，于頦下頸部逐層鈍性分離氣管，甲狀軟骨下0.8 cm處，剪一倒置“T”型切口，進(jìn)行氣管插管，并連接動(dòng)物呼吸機(jī)，調(diào)整呼吸頻率至70次/min，潮氣量15～20 mL/kg，呼吸比3：1，壓力5～25 cm H2O。沿距胸骨左緣第三肋間0.8 cm處，用組織剪縱向剪開(kāi)約2.5 cm(為第三肋至第六肋之間)切口，充分暴露胸腔，仔細(xì)將心包剝離，暴露心臟，于左心耳與肺動(dòng)脈圓錐間處找到左冠狀動(dòng)脈主干，用棉簽輕輕將左側(cè)心臟托起，于左心耳下緣左冠脈左前降支1.5～2 mm處，用帶5/0號(hào)絲線(xiàn)的無(wú)創(chuàng)眼科縫合針進(jìn)針，深度為1～1.5 mm，寬度為2～3 mm，從肺動(dòng)脈圓錐旁出針。將肝素化的聚乙烯管于結(jié)扎處與血管平行、貼壁放置，后結(jié)扎并關(guān)閉胸腔，觀察心電圖變化及心尖部顏色改變。以心電圖QRS波增寬及J點(diǎn)抬高或降低超過(guò)三分之一穩(wěn)定10 min以上、心尖部呈暗紫色為結(jié)扎成功標(biāo)志。30 min后，將結(jié)扎線(xiàn)從聚乙烯管腔中剪斷，緩慢拔出線(xiàn)頭，再灌40 min，以心電圖恢復(fù)、心尖部明顯顏色改善為再灌注成功標(biāo)志，否則給予剔除。偽手術(shù)組，只穿線(xiàn)而不結(jié)扎，30 min后將線(xiàn)撥出。

1.2.4標(biāo)本采集及指標(biāo)測(cè)定

造模結(jié)束后，摘取心臟，用4 ℃生理鹽水沖洗血漬，濾紙吸干，迅速以液氮固定，固定好之后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)錅y(cè)。Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)通過(guò)酶聯(lián)免疫法測(cè)定。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1　對(duì)心肌缺血再灌注大鼠心肌組織Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的影響(表1)

表1 五味余甘子散對(duì)心肌缺血再灌損傷大鼠心肌組織中Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的影響(±s)

Table 1 The effect of Wuwei Yuganzi San on rats myocardial tissue Bcl-2 and Bax expressions in MIRI(±s)

表1 五味余甘子散對(duì)心肌缺血再灌損傷大鼠心肌組織中Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的影響(±s)

組別例數(shù)(n)Bcl-2(%)Bax(%)Bcl-2/Bax比值偽手術(shù)組120.075±0.0150.077±0.0150.984±0.014模型組140.114±0.021☆0.311±0.017☆0.351±0.026☆普萘洛爾陽(yáng)性對(duì)照組90.084±0.014△0.078±0.007△1.076±0.026△五味余甘子散低劑量組110.077±0.011△0.085±0.015△0.887±0.015☆△◇五味余甘子散中劑量組110.079±0.010△0.090±0.014△0.879±0.016☆△◇五味余甘子散高劑量組110.088±0.014△0.094±0.020△0.946±0.028△◇▼●F-12.292477.0521817.703P-<0.001<0.001<0.001

注：☆表示與偽手術(shù)組比較，P<0.05，△表示與模型組比較，P<0.05，◇表示與普萘洛爾陽(yáng)性對(duì)照組比較，P<0.05，▼表示與五味余甘子散低劑量組比較，P<0.05，●表示與五味余甘子散中劑量組比較，P<0.05.

表1示，模型組與偽手術(shù)組比較，凋亡Bcl-2蛋白及相關(guān)Bax蛋白表達(dá)量升高(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值下降(P<0.01)，有顯著性差異，表明缺血再灌注可引起B(yǎng)cl-2、Bax蛋白表達(dá)上調(diào)。五味余甘子散各組與模型組比較，凋亡Bcl-2蛋白表達(dá)降低及Bax蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值升高(P<0.01)，有顯著性差異，表明五味余甘子散干預(yù)心肌缺血再灌損傷有效；與陽(yáng)性對(duì)照組比較(P<0.01)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明五味余甘子散干預(yù)作用與陽(yáng)性藥物相當(dāng)；五味余甘子散各劑量組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.01)，表明治療效果與劑量無(wú)關(guān)。

3討論

作為傳統(tǒng)藏藥藏方，五味余甘子散在藏醫(yī)中用于治療血熱血瘀證，具有清熱涼血、化瘀通脈的功效，臨床應(yīng)用于治療心絞痛、高血壓，高脂血癥等疾病，尤其是心絞痛，療效顯著，但其作用機(jī)理不清。故本研究從細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)量角度探討五味余甘子散對(duì)心肌缺血再灌注損傷的可能機(jī)制。

大量研究表明，MIRI的機(jī)理涉及到氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、鈣超載、壞死與凋亡[5-7]等，這些機(jī)制中一種或多種共同參與再灌注后的損傷。目前細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是心肌缺血再灌損傷的最終原因之一[8]。凋亡是一種細(xì)胞程序性死亡，主要有線(xiàn)粒體介導(dǎo)、死亡受體介導(dǎo)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)凋亡通路，其中對(duì)前兩者研究較多，其具體的機(jī)理仍未完全闡明，但Bcl-2家族蛋白在線(xiàn)粒體介導(dǎo)的凋亡通路中起到關(guān)鍵作用，其分為Bcl-2、Bcl-XL等為主的抗凋亡調(diào)節(jié)蛋白，以及以Bax、Bak等為主的促凋亡調(diào)節(jié)蛋白[9]。抗凋亡蛋白Bcl-2位于線(xiàn)粒體膜上，防止線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素C，而促凋亡蛋白Bax位于細(xì)胞質(zhì)中，可以誘導(dǎo)凋亡啟動(dòng)因子細(xì)胞色素C的釋放，而細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)結(jié)合并激活Caspase 9形成復(fù)合體，后者通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)可分離并激活Caspase 3，從而啟動(dòng)凋亡程序或增強(qiáng)凋亡信號(hào)[10]。因此，Bcl-2與Bax是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡體系，Bax蛋白過(guò)量表達(dá)則細(xì)胞凋亡處于促進(jìn)狀態(tài)，Bcl-2蛋白過(guò)量表達(dá)則細(xì)胞凋亡處于抑制狀態(tài)，Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比率決定細(xì)胞凋亡發(fā)生是否[11，12]。在缺血或再灌注期間，Bcl-2與Bax的表達(dá)量，不管在促使和(或)阻止心肌細(xì)胞凋亡方面都起著關(guān)鍵作用。因此，Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)量及Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)量比值可以在一定程度上反映心肌細(xì)胞凋亡情況。本研究結(jié)果表明五味余甘子散各組可以上調(diào)Bcl-2蛋白、下調(diào)Bax蛋白表達(dá)以及升高Bcl-2/Bax表達(dá)量的比值，表明五味余甘子散可能通過(guò)上調(diào)Bcl-2的表達(dá)量、下調(diào)Bax的表達(dá)量，來(lái)抑制或阻斷心肌缺血再灌注損傷的細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，五味余甘子散對(duì)心肌缺血再灌損傷具有保護(hù)作用，其可能的機(jī)理是通過(guò)上調(diào)抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及下調(diào)促細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax來(lái)實(shí)現(xiàn)保護(hù)缺血再灌注后的心肌細(xì)胞。但由于心肌缺血再灌損傷的機(jī)制較為復(fù)雜，五味余甘子散對(duì)缺血再灌損傷的保護(hù)作用是直接作用還是間接作用，尚待進(jìn)一步明確。

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