劉漢蕓，關(guān)　巍，白振忠，烏仁塔娜，馮喜英，李　賀

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科)

青海藏、漢族肺結(jié)核患者N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶2基因型比較*

劉漢蕓1，關(guān)巍2**，白振忠1，烏仁塔娜1，馮喜英2，李賀1

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科)

摘要目的了解N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶2(NAT2)的基因型及其代謝表型在青海省藏、漢族肺結(jié)核患者之間的分布。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR Taqman探針?lè)z測(cè)114例肺結(jié)核患者(年齡18～79歲，藏族69例，漢族45例) NAT2基因的重要單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)基因型，并判定代謝表型，比較兩個(gè)民族的基因型及代謝型是否存在差異。結(jié)果青海省藏、漢族肺結(jié)核患者NAT2基因 7個(gè)SNP位點(diǎn)基因型比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。兩個(gè)民族NAT2代謝型比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。青海省藏、漢族肺結(jié)核患者NAT2的7個(gè)SNP位點(diǎn)基因型都以野生純合型和雜合突變型為主。兩個(gè)民族肺結(jié)核患者NAT2代謝型均以快代謝型和中間代謝型為主，其中藏族肺結(jié)核患者快代謝型、中間代謝型、慢代謝型頻率分別為40.58%、49.28%、10.14%，漢族肺結(jié)核患者為51.11%、35.56%、13.33%。結(jié)論青海省藏、漢族肺結(jié)核患者的NAT2基因型和代謝型無(wú)顯著性差異。

關(guān)鍵詞NAT2肺結(jié)核藏族漢族

通信作者：劉漢蕓(1987～)，女，漢族，青海籍，2012級(jí)科學(xué)班研究生.**教授，主任醫(yī)師，博士，weiguan110@163.com

*：青海省(應(yīng)用)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2013-Z-728)

中圖分類號(hào)R521

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼識(shí)碼A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.02.003

AbstractObjectiveThe aim of this study was to observe the genotype and phenotype polymorphism of NAT2 in Tibetan and Han patients with tuberculosis in Qinghai province.Methods A total of 114(45 Hans and 69 Tibetans)patients with pulmonary tube rculosis in Qinghai province，aged from 18 years to 79 years，were enrolled in this study.Genotype was test by Taq Man probe real-time PCR method，and metabolic phenotypes were identified by genotype．Results There was no difference in the genotype and metabolism of NAT2 in Tibetan and Han with pulmonary tuberculosis.The mainly genotype of NAT2 was wild homozygous and heterozygous in Tibetan and Han with pulmonary tuberculosis patients.The main metabolic types were the fast metabolism and middle one in both Tibetan and Hans.The number of slow metabolic type was least.The rate of fast，middle and slow metabolic types was 40.58%，49.28% and 10.14%，respectively，in ethnic group of Tibetan. Whereas，the rate of fast，middle and slow metabolic types was 51.11%，35.56% and 13.33%，respectively，in group of Han.Conclusion There was no difference in genotype and metabolic type of NAT2 in Tibetan and Han patients with pulmonary tuberculosis.

KeywordsNAT2TBTibetanHan

收稿日期2014-12-12

COMPARISON OF NAT2 GENOTYPE IN TIBETAN AND HAN

PATIENTS WITH TUBERCULOSIS IN QINGHAI PROVINCE

Liu Hanyun1，Guan Wei2**，Bai Zhenzhong1，Wuren Tana1，F(xiàn)eng Xiying2，Li He1

(1.Qinghai University Medical College；

2.Department of Respiratory Medicine，the Affiliated Hospital of Qinghai University)

1990年Blum等[1]發(fā)現(xiàn)了NAT2基因，從1995年Bell等[2]首次發(fā)現(xiàn)了NAT2的基因多態(tài)性到現(xiàn)在，目前已發(fā)現(xiàn)的NAT2多態(tài)性位點(diǎn)達(dá)40個(gè)之多，每年不斷有新的位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)。由于NAT2多態(tài)性存在種族及地區(qū)差異[3-4]，因此對(duì)少數(shù)民族的NAT2多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行研究尤為重要，查閱國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)，已經(jīng)有學(xué)者研究了部分少數(shù)民族的NAT2基因型。由于藏族是青海省少數(shù)民族之一，且藏族肺結(jié)核發(fā)病率也較高，目前未見(jiàn)與藏族肺結(jié)核患者的NAT2基因型相關(guān)的相關(guān)報(bào)道，因此研究藏族肺結(jié)核患者的NAT2基因型可以為臨床合理用藥提供參考。

1對(duì)象與方法

1.1　研究對(duì)象

選擇2013年12月～2014年5月在青海大學(xué)附屬醫(yī)院及青海省第四人民醫(yī)院確診的肺結(jié)核患者114例，其中藏族患者69例，男性41例，女性28例，平均年齡(38.3±12.0)歲；漢族患者45例，男性29例、女性16例，平均年齡為(42.8±16.6)歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)為2001年中華醫(yī)學(xué)會(huì)《肺結(jié)核診斷和治療指南》[5]。

1.2　實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

水平電泳儀(DYY-III穩(wěn)壓電泳儀 北京六一儀器廠)；分光光度計(jì)(DU800 Beckman Coulter 美國(guó))；低溫高速離心機(jī)(Eppendorf 德國(guó))；ABI7500熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(ABI公司 美國(guó))；人全血基因組DNA提取試劑盒(Qiagen 德國(guó))；TaqMan熒光探針(ABI公司 美國(guó))；SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑(probe，F(xiàn)P206-02天根生化科技有限公司)。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1基因組DNA提取

清晨空腹抽取肘靜脈血5 mL，放入EDTA抗凝管，采用人全血基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，溶于TE緩沖液中，經(jīng)凝膠電泳跑膠及紫外分光光度計(jì)測(cè)濃度后，于-20 ℃冰箱保存。

1.3.2NAT2多態(tài)性位點(diǎn)選擇

根據(jù)http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term=NAT2網(wǎng)站選擇NAT2多態(tài)性位點(diǎn)，分別為rs1799930、rs1801279、rs1801280、rs12720065、rs1280、rs1041983、rs1799929。

1.3.3NAT2基因型檢測(cè)

購(gòu)買ABI公司原裝TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assay，具體探針檢測(cè)序列見(jiàn)表1。NAT2反應(yīng)體系：2×SuperReal PreMix(Probe)10 μL，TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assay 1 μL ，DNA模板8.75 μL、50×ROX Reference Dye 0.25 μL 。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃變性3 sec、60 ℃退火32 sec、60 ℃延伸32 sec，循環(huán)40次。

表1　NAT2 TaqMan探針檢測(cè)序列表

1.3.4NAT2基因型判定

依據(jù)http：//nat.mbg.duth.gr/Human%20NAT2%20alleles_2013.htm網(wǎng)站判讀NAT2基因型，7個(gè)位點(diǎn)所涉及的單體型及代謝表型見(jiàn)表2。

表2　NAT2基因型及代謝表型判定表

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SHEsis在線軟件統(tǒng)計(jì)各SNP位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率，并檢驗(yàn)各SNP位點(diǎn)等位基因頻率是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，用SPSS 19.0(IBM SPSS Statistics)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，比較藏、漢族基因型頻率，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1　NAT2 SNP等位基因頻率及基因型頻率(表3，圖1~7)

表3顯示，藏、漢族肺結(jié)核患者NAT2 SNP基因型比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。三個(gè)位點(diǎn)分別為rs1801279、rs12720065、rs1208，海氏檢驗(yàn)P<0.05，不符合遺傳平衡定律，考慮原因?yàn)闃颖玖科俪霈F(xiàn)偏倚。

2.2　NAT2基因代謝型頻率(表4)

根據(jù)表2判定代謝型。表4顯示，青海省藏、漢族肺結(jié)核患者NAT2代謝型主要以快代謝型和中間代謝型為主，其中藏族肺結(jié)核患者快、中、慢代謝型頻率分別為40.58%、49.28%、10.14%，漢族為51.11%、35.56%、13.33%。比較藏、漢族代謝型無(wú)明顯差異(P>0.05)。

表3　藏、漢族肺結(jié)核患者NAT2 SNP位點(diǎn)等位基因頻率及基因型頻率

表4 藏、漢族NAT2代謝表型比較 (%)

圖1NAT2 rs1799930基因分型結(jié)果示意圖

Figure 1Genotype of rs1799930 polymorphic site of the NAT2

圖2NAT2 rs1801279基因分型結(jié)果示意圖

Figure 2Genotype of rs1801279 polymorphic site of the NAT2

圖3NAT2 rs1801280基因分型結(jié)果示意圖

Figure 3Genotype of rs1801280 polymorphic site of the NAT2

圖4NAT2 rs12720065基因分型結(jié)果示意圖

Figure 4Genotype of rs12720065 polymorphic site of the NAT2

圖5NAT2 rs1208基因分型結(jié)果示意圖

Figure 5Genotype of rs1208 polymorphic site of the NAT2

圖6NAT2 rs1041983基因分型結(jié)果示意圖

Figure 6Genotype of rs1041983 polymorphic site of the NAT2

圖7　NAT2 rs1799929基因分型結(jié)果示意圖

3討論

本研究結(jié)果顯示，青海省藏、漢族肺結(jié)核患者的NAT2基因型和代謝型無(wú)顯著性差異。

青海藏族肺結(jié)核發(fā)病率明顯高于漢族[6]?？拱A藥物(異煙肼等)其乙?；俾视绊懥怂幬锆熜7-8]，并與藥物副反應(yīng)相關(guān)，導(dǎo)致異煙肼等代謝速率不同的主要原因是NAT2具有遺傳多態(tài)性[9]。已有研究顯示根據(jù)NAT2基因型及代謝型選用異煙肼藥物劑量可提高療效，減少藥物性肝損害[10]。目前缺乏對(duì)青海藏族NAT2基因型及表型的研究。本研究對(duì)青海省藏、漢族肺結(jié)核患者的NAT2的重要多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)、分析，以了解藏、漢族之間基因型是否存在差異，同時(shí)了解藏族肺結(jié)核患者NAT2代謝型的分布情況，為藥物個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。

NAT2基因多態(tài)性具有顯著的種族和地區(qū)差異，其等位基因突變的發(fā)生導(dǎo)致酶活性下降、穩(wěn)定性降低及表達(dá)量減少使得乙?；x能力受損，造成個(gè)體對(duì)疾病易感性的差異。研究顯示我國(guó)人群中NAT2基因型以NAT2*4/*4純合野生型基因?yàn)橹?，NAT2*4/*6、NAT2*4/*7基因型常見(jiàn)，慢乙?；x型基因在我國(guó)少見(jiàn)，主要有NAT2*6/*7[11-12]。本研究45例漢族肺結(jié)核患者4個(gè)NAT2 SNP位點(diǎn)rs1799930、rs1801280、rs1041983、rs179992基因型與國(guó)內(nèi)相關(guān)研究基本一致。查閱相關(guān)文獻(xiàn)未發(fā)現(xiàn)藏族NAT2基因型的研究，本研究發(fā)現(xiàn)69例藏族肺結(jié)核患者4個(gè)NAT2 SNP位點(diǎn)rs1799930、rs1801280、rs1041983、rs179992基因型以野生型為主，雜合突變型頻率為49.27%。結(jié)果提示，藏族肺結(jié)核患者在以上4個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)了一定程度的突變，說(shuō)明藏族肺結(jié)核患者和漢族肺結(jié)核患者一樣在這幾個(gè)位點(diǎn)也存在多態(tài)性，在以后的研究中這幾個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)必不可少。本研究有三個(gè)位點(diǎn)(rs1801279、rs12720065、rs1208)不符合遺傳平衡定律，考慮原因?yàn)闃颖玖科俪霈F(xiàn)偏倚。

國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)NAT2基因多態(tài)性分布與結(jié)核病的遺傳易感性之間有一定關(guān)系[13-14]。李昕潔等[15]研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)漢族肺結(jié)核患者與健康人群間的具有不同的NAT2基因特征。劉芳等[16]的研究發(fā)現(xiàn)漢族健康人群NAT2 SNP位點(diǎn)rs1799929的基因型CC、CT、TT的頻率分別為98.8%、1.2%、0，而本研究漢族肺結(jié)核患者在該位點(diǎn)上的基因型CC、CT、TT頻率分別為28.89%、68.89%、2.22%，兩者比較χ2=125.582(P<0.05)存在明顯差異，該位點(diǎn)多態(tài)性與肺結(jié)核易感還應(yīng)做進(jìn)一步研究，但由于目前沒(méi)有藏族NAT2基因型的研究資料，因此還不能比較，是否同樣該位點(diǎn)多態(tài)性與肺結(jié)核易感需要更多的研究。

不同患者藥物代謝率不同，造成療效和副反應(yīng)不同。藥物在體內(nèi)的代謝都有相應(yīng)的藥物代謝酶參與，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)藥物代謝酶在人群中存在遺傳多態(tài)性，這種特性決定了藥物代謝酶在個(gè)體中的活性差異，從而導(dǎo)致藥物反應(yīng)的個(gè)體差異。NAT2基因的多態(tài)性影響了NAT2酶的活性，NAT2基因型對(duì)預(yù)測(cè)藥物的藥效和不良反應(yīng)十分重要，根據(jù)NAT2基因型檢測(cè)結(jié)果預(yù)測(cè)NAT2的代謝能力，制定異煙肼(INH)的個(gè)體化抗結(jié)核治療方案將大大提高INH的治療效果，降低不良反應(yīng)的發(fā)生率及發(fā)生程度。有研究顯示[10]，對(duì)慢乙?；Y(jié)核患者選擇2.5 mg/kg劑量，快乙?；呓o予7.5 mg/kg劑量，中間型給予5 mg/kg的劑量分別給藥，明顯減少藥物所致的肝損害，并減少早期治療失敗。在INH劑量相同的情況下，個(gè)體間INH血藥濃度仍有非常顯著的差異，有人發(fā)現(xiàn)，服用INH后2 h血藥濃度差異可達(dá)100～200倍[17]。INH在體內(nèi)主要代謝途徑是經(jīng)NAT2代謝為乙酰異煙肼(AcINH)，因此慢乙?；拇嬖谑荌NH及AcINH血藥濃度存在著顯著個(gè)體差異的重要原因[18]。Kita T等[19]研究了INH尿排回收率與NAT2基因型的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)野生型、雜合子型及突變型的INH尿排回收率分別為6.4%±2.2%、10.7%±2.2%和38.6%±6.4%，這些研究都證明了NAT2代謝能力與INH藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)青海省藏、漢族肺結(jié)核患者NAT2慢代謝表型頻率分別為10.14%和13.33%。 結(jié)果提示，該類患者的尿排回收率高，NAT2酶活性低，INH不能進(jìn)行及時(shí)有效的代謝，毒性物質(zhì)在體內(nèi)的滯留時(shí)間也比較長(zhǎng)，INH副作用的發(fā)生率也可能會(huì)相應(yīng)的提高。因此針對(duì)該類患者在抗結(jié)核過(guò)程中可能應(yīng)該適當(dāng)減少INH用量或延長(zhǎng)用藥間隔時(shí)間。研究結(jié)果顯示，藏、漢族肺結(jié)核患者的快代謝型頻率分別為40.58%、51.11%，提示該類患者INH在體內(nèi)代謝速度快，對(duì)結(jié)核桿菌起主要抗菌作用的代謝產(chǎn)物異煙酸在體內(nèi)停留時(shí)間短，導(dǎo)致抗菌效果下降。因此針對(duì)這類代謝型患者在INH的用藥上可能應(yīng)該適當(dāng)增加用藥劑量或縮短用藥間隔時(shí)間。

本研究比較藏族和漢族肺結(jié)核患者NAT2基因型和代謝型，兩者均沒(méi)用顯著性差異(P>0.05)。由于本研究樣本量有限，種族間NAT2基因型存在的差異可能沒(méi)能檢測(cè)出來(lái)，因此還需更多大樣本研究證實(shí)。

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