安　玲，縱　媛，吉棟德，王榮華，李正娥，曹成珠，蘇占海#

(1.青海省人民醫(yī)院；2.青海大學醫(yī)學院；3.青海大學附屬醫(yī)院；4.青海紅十字醫(yī)院)

一氧化氮在TRAIL誘導凋亡中對p53和VCP蛋白表達的影響※

安玲1，縱媛2，吉棟德1，王榮華3，李正娥4，曹成珠2，蘇占海2#

(1.青海省人民醫(yī)院；2.青海大學醫(yī)學院；3.青海大學附屬醫(yī)院；4.青海紅十字醫(yī)院)

摘要目的研究NO在TRAIL誘導凋亡過程中對p53和VCP蛋白表達的影響。方法利用Western blot蛋白印跡法檢測各蛋白表達水平；用MTT方法檢測細胞凋亡和caspase-3激酶激活狀態(tài)。結(jié)果內(nèi)源性NO表達產(chǎn)生的一氧化氮可提高TRAIL誘導的細胞凋亡率，同時增加caspase-3激酶激活活性。內(nèi)源性NO對p53蛋白表達水平無影響，但是對VCP蛋白表達的上調(diào)有一定促進作用。結(jié)論內(nèi)源性NO對管家基因p53蛋白無明顯影響，但對與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力相關(guān)的VCP蛋白有調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞TRAILiNOSp53VCP細胞凋亡

通信作者安玲(1981～)，女，漢族，青海籍，主治醫(yī)師.#：，教授、博士、碩士生導師，email：suzhanhai@qhu.edu.cn

※：國家自然基金項目(81160259)；青海省自然科學基金面上項目(2013-Z-907)；青海省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目(2013-Z-726)

中圖分類號R735

文獻標識碼識碼A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.02.005

AbstractObjectiveTo investigate the influence of nitric oxide(NO)on the p53 and valosin-containing protein(VCP)protein expression in the process of tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand(TRAIL)mediated apoptosis signal pathway.Method Through Western blot to detect the protein expression.The cell apoptosis and caspase-3 activity were analyzed by MTT.Results Endogenous nitric oxide enhances the TRAIL-induced apoptosis level，and it also promoted caspase-3 activity.The p53 protein expression has not been effected by inducible nitric oxide synthase(iNOS)expression，but VCP protein expression can be increased by iNOS expression after induction.Conclusion Endogenous NO shows no influence on the p53 expression，but it regulates reticulum pressure-related protein VCP.

KeywordsTRAILiNOSp53VCPcell apoptosis

收稿日期2014-11-29

THE INFLUENCE OF NITRIC OXIDE ON THE p53 AND

VCP PROTEIN EXPRESSION IN THE PROCESS OF

TRAIL-INDUCED APOPTOSIS SIGNAL PATHWAY

An Ling1，Zong Yuan2，Ji Dongde1，Wang Ronghua3，Li Zhenge4，Cao Chengzhu2，Su Zhanhai2#

(1.The people′s hospital of Qinghai Province；2.Qinghai University Medical College；

3.Qinghai University Affiliated Hospital；4.Qinghai Red Cross Hospital)

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)在調(diào)節(jié)細胞凋亡、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)及細胞內(nèi)其他信號傳導途徑中有重要作用[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL可誘導腫瘤或有炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)的細胞進入凋亡信號，但是對正常組織或正常細胞的毒性幾乎很小，一般不會引起正常組織或細胞發(fā)生凋亡。TRAIL誘導細胞進入凋亡主要包括其與細胞膜上受體結(jié)合形成凋亡誘導復(fù)合體，并激活半胱氨酸蛋白酶-8(pro-caspase-8)的前體成為活性狀態(tài)體(caspase-8)。當caspase-8數(shù)量足以激活“死亡執(zhí)行激酶”caspase-3時，細胞立刻進入凋亡；否則將通過Bid蛋白在線粒體中釋放caspase-9激酶，最終使得細胞進入凋亡[3-5]。許多腫瘤組織，如結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤等組織中發(fā)現(xiàn)可誘導性一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表達，腫瘤組織通過獲得性iNOS后，可持續(xù)表達一氧化氮[6-8]。因一氧化氮對基因組、細胞及組織均有毒性，推測腫瘤組織通過表達iNOS激酶，釋放一氧化氮，逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。一氧化氮在體內(nèi)外實驗中均可以抑制細胞增殖，同時也可以在濃度較高時誘導細胞進入凋亡[9-11]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)最大的鈣離子存儲場地。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在受到細胞內(nèi)外信號刺激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白積累、加工異常，使得其功能發(fā)生改變，可引起細胞生理學、病理學異常，此異常變化稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力。已經(jīng)報道和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力有關(guān)的激酶caspase-12與FAS誘導的細胞凋亡有關(guān)。除了caspase-12激酶外，纈酪肽蛋白VCP(valosin-containing protein，VCP)蛋白表達程度也與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力有關(guān)，VCP蛋白表達異常，將導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，最終導致下游相關(guān)蛋白或激酶激活，從而誘導細胞進入凋亡[12-15]。P53蛋白對細胞增殖、凋亡、分化、衰老以及基因組穩(wěn)定均有調(diào)節(jié)作用，影響到整個細胞生物功能的各個方面，因此被稱為“管家基因”。但是iNOS在TRAIL誘導的細胞凋亡過程中，是否對VCP和p53蛋白表達有調(diào)節(jié)作用，未見研究報道。本研究利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株EcR293，研究iNOS表達產(chǎn)生內(nèi)源性一氧化氮在TRAIL誘導凋亡過程中對VCP和p53蛋白表達的調(diào)節(jié)作用，從而闡明內(nèi)源性一氧化氮對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力的影響。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗對象

用人胚胎腎細胞HEK293成功構(gòu)建了EcR293細胞株，并對該細胞株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染iNOS重組質(zhì)粒，通過加入ponasterone A或不加該試劑，誘導細胞穩(wěn)定表達iNOS，從而產(chǎn)生內(nèi)源性一氧化氮。

1.1.2主要儀器及試劑

Binder 細胞培養(yǎng)箱(Tuttlingen，德國)，DMEM(Invitrogen，英國)，胎牛血清(Invitrogen，英國)，Ponasterone A誘導劑(Invitrogen，英國)，Lipofectamine 2000細胞轉(zhuǎn)染試劑(Life Technology，美國)，NP-40 裂解液(上海生工生物公司，上海)；iNOS多克隆抗體、VCP單克隆抗體、p53單克隆抗體(Santa Cruz，美國)，anti-Mouse secondary antibody(Sigma-Aldrich Corp，美國)。

1.2　方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

EcR293細胞用DMEM細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)(內(nèi)含10%胎牛血清、1%p/s雙抗、1% HEPES緩沖液，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng))。所有重組載體通過Lipofectmine 2000試劑進行轉(zhuǎn)染，其轉(zhuǎn)染效果通過Western blot蛋白印跡法進行檢測。

1.2.2Western blot 蛋白印跡法檢測

將待測細胞用細胞裂解液NP-40進行孵育和充分裂解、離心，并提取總蛋白上清，加入核酸降解酶以降解DNA和RNA，并在95 ℃變性5 min后，上樣于12% SDS-PAGE電泳凝膠中進行電泳分離；然后將凝膠蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)5% I-Block 37 ℃封閉1 h；加入相應(yīng)一抗進行孵育培養(yǎng)，之后用緩沖液進行三次清洗，再加二抗進行孵育培養(yǎng)。將PVDF膜與發(fā)光工作液充分接觸，室溫孵育1 min，在暗室進行曝光、顯影和定影，并將結(jié)果掃描于電腦上進行保存。

1.2.3Caspases-3活性檢測

EcR293細胞富集程度到達50%左右時，立刻用胰酶分離后將其分到6孔培養(yǎng)板中，按濃度加入ponasterone A誘導劑(濃度為0、0.5、1、3、5μM )并孵育24 h，以便誘導iNOS基因產(chǎn)生內(nèi)源性一氧化氮。之后用TRAIL(50ng/mL)處理24 h，用1000 μL 1% NP-40裂解并懸浮細胞，在冰上孵育15 min。對蛋白進行定量后，40 μg蛋白利用caspase-3活性檢測試劑盒進行活性檢測。所有反應(yīng)樣品在37 ℃黑暗狀態(tài)孵育2 h。將80 μL經(jīng)過孵育的樣品加入到24孔黑色樣品檢驗板，在405/535波長處檢驗其熒光光密度值，并將結(jié)果保存于電腦進行分析。

1.2.4細胞凋亡MTT法檢測

待測細胞培養(yǎng)板孔中加入10 μL MTT溶液，并繼續(xù)培養(yǎng)孵育4 h；之后加入400 μL Formanzan溶解液繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)進行孵育培養(yǎng)，待紫色物質(zhì)完全溶解后在全波長酶標儀波長570 nm處檢測。

2結(jié)果

2.1　一氧化氮增加TRAIL誘導的細胞凋亡率

為檢測內(nèi)源性NO對TRAIL誘導的細胞凋亡的影響，將生長到50%富集度的EcR293細胞分離到6孔培養(yǎng)板中，在加入ponasterone A 誘導劑0、0.5、5 μM 3h時間點，立刻加入TRAIL(30ng/mL)誘導細胞凋亡。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，去除培養(yǎng)液并用1XPBS清洗一次，立刻用MTT方法檢測其細胞凋亡率，并進行分析(圖1)。結(jié)果顯示，加入TRAIL后，可檢測到細胞凋亡(圖10 μM Pon.)，隨著ponasterone A誘導劑濃度增加(圖10.5和5 μM Pon.)，TRAIL誘導的細胞凋亡率亦有增加，說明iNOS表達產(chǎn)生的內(nèi)源性一氧化氮可提高TRAIL誘導的細胞凋亡率。同時，caspase-3激酶激活表示細胞也進入凋亡過程。通過檢測發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性一氧化氮可提高caspase-3激酶激活率(圖2)。

圖1一氧化氮增加TRAIL誘導的細胞凋亡

Figure 1NO enhances TRAIL-induced apoptosis

圖2　TRAIL誘導細胞凋亡后caspase-3激酶活性檢測

2.2　iNOS基因表達對p53基因表達的影響

為分析iNOS表達對p53蛋白表達的影響，EcR293細胞用誘導劑Ponasterone A 0、0.5、5 μM誘導24 h后，立刻用NP-40裂解液進行充分裂解，并以Western blot蛋白印跡法檢測其表達水平。結(jié)果顯示，隨著iNOS表達產(chǎn)生的內(nèi)源性一氧化氮被誘導增加，p53蛋白表達水平卻基本恒定，沒有發(fā)生較大變化(圖3)，提示p53基因或其產(chǎn)物不受iNOS表達的影響。

2.3　一氧化氮對VCP基因表達的影響

為分析iNOS基因表達產(chǎn)生的內(nèi)源性一氧化氮對VCP蛋白表達的影響，EcR293細胞用誘導劑Ponasterone A 0、0.5、5 μM進行誘導24 h后，立刻用NP-40裂解液進行充分裂解，并以Western blot蛋白印跡法檢測其表達水平。結(jié)果顯示，隨著iNOS被誘導表達導致內(nèi)源性一氧化氮逐步增加，VCP蛋白表達水平亦有所增加(圖4)，尤其在5 μM誘導劑加入時，VCP蛋白表達量比0 μM時要高，提示VCP蛋白表達受內(nèi)源性一氧化氮表達的影響，或許暗示iNOS表達產(chǎn)生的內(nèi)源性一氧化氮對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有壓力。

圖3iNOS對p53蛋白表達的影響圖

Figure 3The effect of iNOS on p53 expression

圖4　iNOS對VCP蛋白表達的影響圖

3討論

細胞凋亡不僅是生理性的細胞學過程，如組織或器官增殖、免疫應(yīng)答中誘導損傷細胞進入凋亡，也是一種病理性細胞過程，如細胞損傷或炎癥發(fā)生過程中，凋亡因子誘導細胞進入凋亡。其最大特征是維持細胞膜的完整性，保持溶酶體內(nèi)的酶不被釋放，細胞被分割成許多個凋亡小體，最終被吞噬細胞所消滅，而不引起機體炎癥反應(yīng)。一氧化氮作為信使在細胞內(nèi)行使不同功能，如抵抗病原體、誘導腫瘤細胞進入凋亡、傳遞信號途徑中的信息、調(diào)節(jié)血管增殖等。但是許多腫瘤細胞獲得性獲得iNOS基因表達，并通過表達一氧化氮，使得免疫細胞在監(jiān)督腫瘤過程中被誘導凋亡，從使得腫瘤逃避免疫監(jiān)視。TRAIL誘導的凋亡途徑是除CD95之外的經(jīng)典凋亡信號途徑，該信號通道牽涉到細胞膜表面表達的凋亡受體、caspase激酶激活、線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)，caspase-12與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力相關(guān)，參與細胞凋亡過程；同時鈣離子在此過程中也扮演一定角色[16-24]。腫瘤持續(xù)表達iNOS，從而產(chǎn)生內(nèi)源性一氧化氮，其作用一直未被闡明。因此，研究iNOS在凋亡信號途徑中的作用對理解細胞凋亡有重要意義。

本研究顯示，內(nèi)源性一氧化氮可增加TRAIL誘導的細胞凋亡，但是對管家基因p53蛋白表達沒有調(diào)節(jié)或影響，而對與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力有關(guān)的蛋白VCP有調(diào)節(jié)作用，說明iNOS在調(diào)節(jié)TRAIL誘導的細胞凋亡過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也參與此凋亡過程。由于TRAIL對正常細胞毒性較小，對腫瘤等非正常細胞毒性較大(表現(xiàn)在誘導其凋亡)，內(nèi)源性一氧化氮作用增加TRAIL誘導的細胞凋亡作用，有可能通過改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力相關(guān)蛋白這條途徑實現(xiàn)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在蛋白形成、加工和運輸中起重要作用，一氧化氮是極強的氧化劑，也對正在形成、加工的蛋白有修飾作用，從而導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白功能異常，增加細胞凋亡率。因此本實驗對理解一氧化氮在TRAIL誘導過程相關(guān)機制提供了重要的實驗依據(jù)。

參考文獻

[1]馮長根，周漢生.TRAIL促腫瘤細胞凋亡的研究進展[J].中國藥學雜志，2006，41(8)：561-564.

[2]酈萍，吳雪昌.腫瘤細胞抗TRAIL凋亡誘導的分子機制[J].細胞生物學雜志，2006，28(2)：153-159.

[3]劉靜，曲秀娟，劉云鵬，等.抑制JNK通路對TRAIL誘導胃癌細胞凋亡影響的研究[J].中華腫瘤防治雜志，2011，18(7)：481-484.

[4]胡璧，王建軍，徐根興.腫瘤壞死因子誘導凋亡配體(TRAIL)抗腫瘤治療研究進展[J].藥學與臨床研究，2008，16(3)：194-200.

[5]林海，侯敢，黃迪南.以TRAIL為靶點的腫瘤治療研究進展[J].生命科學，2007，19(5)：492-495.

[6]江從慶，樊利芳，刁路明，等.低氧及一氧化氮對SW480細胞缺氧誘導因子-1α、VEGF及iNOS表達的初步研究[J].中國病理生理雜志，2005，21(4)：722-726.

[7]楊紹松，陶凱，逯芳芳，等.iNOS在LPS誘導活化小膠質(zhì)細胞中的表達變化[J].神經(jīng)解剖學雜志，2014，30(6)：666-670.

[8]梅開，蔡曉虹，杜磊，等.內(nèi)皮型一氧化氮合酶來源的NO調(diào)節(jié)腫瘤血管的生成[J].癌癥，2010，29(1)：32-37.

[9]田俊強，李仁舉，王志平，等.一氧化氮對組織特異性溶瘤腺病毒轉(zhuǎn)染膀胱腫瘤細胞的影響[J].臨床泌尿外科雜志，2012，30(2)：150-153.

[10]楊鐘莉，鄧新超，湯春生.一氧化氮及一氧化氮合酶與卵巢腫瘤凋亡的關(guān)系[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展，2004，13(4)：281-283.

[11]劉學謙，王新景，張?zhí)?，?含纈酪肽蛋白基因單核苷酸多態(tài)性在肝細胞癌中的研究[J].外科理論與實踐，2014，19(3)：238-242.

[12]Franz A.，Ackermann L，Hoppe T.Create and preserve：proteostasis in development and aging is governed by Cdc48/p97/VCP[J].Biochim Biophys Acta，2014.1843(1)：205-15.

[13]Fujita K.，Nakamura Y.，Oka T.，et al.A functional deficiency of TERA/VCP/p97 contributes to impaired DNA repair in multiple polyglutamine diseases[J].Nat Commun，2013.289(4)：1816.

[14]Lee J.H.，Kwon J.H.，Jeon Y.H.，et al.Pro178 and Pro183 of selenoprotein S are essential residues for interaction with p97(VCP)during endoplasmic reticulμM-associated degradation[J].J Biol Chem，2014. 289(20)：13758-68.

[15]Lee J.J.，Park J.K.，Jeong J.，et al.Complex of Fas-associated factor 1(FAF1)with valosin-containing protein(VCP)-Npl4-Ufd1 and polyubiquitinated proteins promotes endoplasmic reticulμM-associated degradation(ERAD)[J].J Biol Chem，2013.288(10)：6998-7011.

[16]Ben Mosbah I.，Duval H.，Mbatchi S.F.，et al.Intermittent selective clamping improves rat liver regeneration by attenuating oxidative and endoplasmic reticulμM stress[J].Cell Death Dis，2014.302(5)：e1107.

[17]Brenner C.，Galluzzi L.，Kepp O.，et al.Decoding cell death signals in liver inflammation[J].J Hepatol，2013.59(3)：583-94.

[18]Curran J.，Tang L.，Roof S.R.，et al.Nitric oxide-dependent activation of CaMKII increases diastolic sarcoplasmic reticulμM calciμM release in cardiac myocytes in response to adrenergic stimulation[J].PLoS One，2014.9(2)：e87495.

[19]Galan M.，Kassan M.，Kadowitz P.J.，et al.Mechanism of endoplasmic reticulμM stress-induced vascular endothelial dysfunction[J].Biochim Biophys Acta，2014.1843(6)：1063-75.

[20]Hosoi T.，Honda M.，Oba T.，et al.ER stress upregulated PGE(2)/IFNgamma-induced IL-6 expression and down-regulated iNOS expression in glial cells[J].Sci Rep，2013.3：3388.

[21]Hosoi T.，Noguchi J.，Takakuwa M.，et al.Inhibition of inducible nitric oxide synthase and interleukin-1beta expression by tunicamycin in cultured glial cells exposed to lipopolysaccharide[J]. Brain Res，2014.1558：11-7.

[22]Lee da H.，Nam Y.J.，Kim Y.J.，et al.Rotundarpene prevents TRAIL-induced apoptosis in hμMan keratinocytes by suppressing the caspase-8- and Bid-pathways and the mitochondrial pathway[J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2014.387(12)：1209-19.

[23]Lim S.K.，Choi H.，Park M.J.，et al.The ER stress-mediated decrease in DDAH1 expression is involved in formaldehyde-induced apoptosis in lung epithelial cells[J].Food Chem Toxicol，2013.62(3)：763-9.

[24]Liu M.，Xiang G.，Lu J.，et al.TRAIL protects against endotheliμM injury in diabetes via Akt-eNOS signaling[J].Atherosclerosis，2014.237(2)：718-24.