喬 雨，石鳳翎，熊 梅，張凱旋

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院， 呼和浩特010019）

近年來，隨著人工草地種植面積的增加，對緣毛雀麥（Bromus ciliatus L．）和直立型扁蓿豆（Medicago ruthenica（L．）Sojak．cv．Zhilixing）種子需求量也日益增加［1］，但2種牧草均存在不同程度的缺陷。其中緣毛雀麥的抗旱性能一般，直立型扁蓿豆種子和牧草產(chǎn)量相對苜蓿較低，在生產(chǎn)應(yīng)用過程中表現(xiàn)出一定的局限性。

EMS（甲基磺酸乙酯）是誘變效率較高的一種誘變劑，已在大田作物突變體庫構(gòu)建和種質(zhì)創(chuàng)新中得到廣泛應(yīng)用［2－7］，如黑龍江省對大面積推廣的6個農(nóng)藝性狀優(yōu)良的大豆種子進行了EMS誘變處理，在其 M 4群體中篩選到抗草甘膦的突變株系，為大豆抗除草劑育種提供了重要種質(zhì)材料。針對上述2種牧草在生產(chǎn)應(yīng)用中存在的問題，本試驗擬通過EMS誘變處理緣毛雀麥和直立型扁蓿豆種子，以確定其適宜處理劑量，建立2種牧草廣譜的突變體庫，為牧草抗旱、高產(chǎn)育種提供新種質(zhì)。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

供試材料為錫林郭勒緣毛雀麥（Bromus ciliatus L．cv．Xilinguole）和直立型扁蓿豆（Medicago ruthenica（L．）Sojak．cv．Zhilixing），2013年收獲于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草試驗站。

1．2 試驗方法

1．2．1 EMS處理方法

選取吸脹的緣毛雀麥和直立型扁蓿豆各1 200粒，用0．1mol／L磷酸緩沖液（pH＝7．0）配制0．9%EMS溶液。分別選取100粒吸脹種子，置于100mL錐形瓶中，每一處理加入配好的0．9%EMS溶液60mL，對照（ck）加入60mL磷酸緩沖液。在60r／min、20℃的搖床中處理吸脹種子。在前期試驗基礎(chǔ)上得到直立型扁蓿豆種子處理24h后相對發(fā)芽率為86%，緣毛雀麥種子處理12h后相對發(fā)芽率為98%，因此本試驗將直立型扁蓿豆種子的處理時間設(shè)為45h和48h，緣毛雀麥種子處理時間設(shè)為15h和18h。每組試驗3次重復(fù)，處理后的種子用流水沖洗4h，然后置鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽試驗。

1．2．2 測定方法和指標(biāo)

每天觀察種子萌發(fā)情況，記載起始發(fā)芽時間及逐日發(fā)芽個數(shù)，并計算以下各指標(biāo)：

發(fā)芽率（%）＝發(fā)芽總數(shù)／供試種子數(shù)×100%。

相對發(fā)芽率（%）＝處理的發(fā)芽率／對照發(fā)芽率×100%。

發(fā)芽指數(shù)＝∑Gt／Dt，其中Gt為t天的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽日數(shù)。

相對發(fā)芽指數(shù)＝處理的發(fā)芽指數(shù)／對照發(fā)芽指數(shù)×100%。

活力指數(shù)＝發(fā)芽指數(shù)×苗鮮重。

相對活力指數(shù)＝處理的活力指數(shù)／對照的活力指數(shù)×100%。

1．3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel作圖，SAS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（9．0版）軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 EMS誘變對緣毛雀麥和直立型扁蓿豆種子發(fā)芽進程的影響

EMS誘變對緣毛雀麥種子發(fā)芽進程有延遲作用（圖1），與對照（ck）相比，緣毛雀麥種子發(fā)芽起始時間及高峰期均有所延遲，其中發(fā)芽起始時間延遲1～2d，發(fā)芽高峰期延遲2～3d；從發(fā)芽的第8天開始發(fā)芽數(shù)明顯減少，至第14天仍有少量發(fā)芽。直立型扁蓿豆種子發(fā)芽快而整齊，EMS誘變處理與否均在第2天達到發(fā)芽高峰期，在第7天基本結(jié)束。

注：同列不同大寫字母表示差異性達到極顯著水平（p＜0．01）；同列不同小寫字母表示差異性達到顯著水平（p＜0．05）。

圖1 EMS處理下緣毛雀麥和直立型扁蓿豆發(fā)芽率的變化

2．2 不同時間EMS誘變對緣毛雀麥和直立型扁蓿豆種子發(fā)芽力的影響

如表1所示，EMS誘變15h后緣毛雀麥種子的相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)和相對活力指數(shù)與ck無顯著差異，但EMS誘變18h后緣毛雀麥種子的相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)和相對活力指數(shù)均顯著下降，說明EMS誘變18h后緣毛雀麥種子萌發(fā)受到極顯著的抑制作用，其相對發(fā)芽率為ck的1／2，達到半致死處理時間。直立型扁蓿豆種子在EMS誘變45h和48h后其相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽指數(shù)和相對活力指數(shù)均顯著下降，其中處理48h后其相對發(fā)芽率降至49．7%，達到半致死處理時間，因此直立型扁蓿豆種子適宜處理時間為48h。

3 討 論

EMS是一種穩(wěn)定、高效的誘發(fā)點突變的誘變劑，而且是通過直接修飾堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)而改變DNA的性質(zhì)［8］。EMS處理的材料有體細(xì)胞、花粉、小孢子、細(xì)胞、干燥種子和成熟花粉等，處理部位不同所獲得的誘變效應(yīng)也存在一定的差異［9］。本試驗選擇吸脹種子，與干燥種子相比，吸脹種子可以使EMS充分均勻地滲入到種子胚中。在EMS濃度選擇上，由于高濃度的EMS毒性太強，同時在溶液中較難分布均勻［10］，通過對幾種牧草種子前期試驗研究，初步確定0．9%～1．2%EMS對緣毛雀麥和直立型扁蓿豆種子萌發(fā)有明顯抑制作用，因此本試驗采用對緣毛雀麥和直立型扁蓿豆吸脹種子進行低濃度長時間的處理，以獲得理想的誘變效果。

試驗中發(fā)現(xiàn)，0．9%EMS對緣毛雀麥種子的發(fā)芽進程有延遲作用，結(jié)果與在蒙農(nóng)紅豆草［11］和麻瘋樹［12］的研究類似。

在化學(xué)誘變研究中，選擇適宜的濃度和時間是獲得較好誘變效果的關(guān)鍵［11］，通常以半致死量為選擇標(biāo)準(zhǔn)［3］。用此標(biāo)準(zhǔn)確定了小麥［5］、甜菜［3］、番茄種子［2］等EMS誘變的適宜劑量，獲得了利用價值較高的突變體材料。本試驗也利用此方法，確定了在0．9%EMS濃度下緣毛雀麥和直立型扁蓿豆種子的適宜處理時間分別為18h和48h。

4 結(jié) 論

采用0．9%EMS處理緣毛雀麥和直立型扁蓿豆吸脹種子，其中緣毛雀麥發(fā)芽進程延遲，以相對發(fā)芽率達半致死劑量為標(biāo)準(zhǔn)，確定了2種牧草種子的適宜處理時間分別為18h和48h。

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