邢東旭 李慶榮 肖陽(yáng) 葉明強(qiáng) 楊瓊

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東廣州 510610）

省力化養(yǎng)蠶是當(dāng)前蠶桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)實(shí)需求，抗性家蠶品種的應(yīng)用是實(shí)現(xiàn)省力化養(yǎng)蠶的重要途徑。近年來(lái)，華康2號(hào)、桂蠶N2等抗家蠶核型多角體病毒病的選育成功，表明利用家蠶抗性品種資源改良品種抗性具有較大的潛力[1-3]。開(kāi)展抗性品種選育，首先需要建立一套可靠的檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)，確保調(diào)查數(shù)據(jù)真實(shí)可靠、結(jié)果可重復(fù)。然而，對(duì)于家蠶真菌病的抗性檢測(cè)，目前國(guó)內(nèi)尚未有統(tǒng)一規(guī)范的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。此外，白僵菌是重要的生防菌株，在農(nóng)業(yè)、林業(yè)病蟲(chóng)害防治上具有較高的應(yīng)用價(jià)值[4-5]。通過(guò)對(duì)各種白僵菌菌株進(jìn)行毒力檢測(cè)，從而篩選到高致病力的白僵菌也具有較大意義，這同樣需要一套實(shí)用的檢測(cè)方法。因此，項(xiàng)目組通過(guò)系統(tǒng)研究，摸索出了一套科學(xué)、穩(wěn)定測(cè)定家蠶白僵病的抗檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試家蠶品種為湘A、春5和抗8，供試病原為球孢白僵菌，均由本實(shí)驗(yàn)室繼代保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗性檢測(cè)平臺(tái)的建立

以浸浴攻毒法作為白僵菌感染家蠶的方法。在此基礎(chǔ)上對(duì)病原制備、家蠶選擇、浸浴攻毒、養(yǎng)蠶環(huán)境、數(shù)據(jù)調(diào)查等主要技術(shù)環(huán)節(jié)制定具體操作標(biāo)準(zhǔn)，建立抗性檢測(cè)技術(shù)規(guī)程。

1.2.2 檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)誤差分析

利用新建立的檢測(cè)平臺(tái)對(duì)3個(gè)家蠶品種進(jìn)行抗性測(cè)定，于4齡起蠶進(jìn)行攻毒，接種病原濃度為103個(gè)/mL。每個(gè)品種設(shè)3區(qū)重復(fù)，每區(qū)30頭。統(tǒng)計(jì)發(fā)病率，以各品種死亡率的標(biāo)準(zhǔn)差反映該方法的重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)誤差。同時(shí)將上述家蠶品種進(jìn)行體噴法攻毒作為對(duì)照，以此對(duì)比兩種方法重復(fù)性的差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 抗性檢測(cè)流程與技術(shù)規(guī)范

2.1.1 病原制備

將供試白僵菌菌株用PDA培養(yǎng)基在26℃、RH 95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15d。用含0.2%吐溫80的無(wú)菌水溶液沖洗平板表面，孢子液用紗布過(guò)濾、離心，然后用含0.2%吐溫80的無(wú)菌水將病原調(diào)整到實(shí)驗(yàn)需要的濃度，于半日內(nèi)使用。

此外，病原也可直接從蠶體分離，獲得的孢子粉經(jīng)冷凍干燥后于低溫保存?zhèn)溆谩２≡褂们斑M(jìn)行活孢率檢測(cè)。具體測(cè)定方法如下：配制1×107個(gè)/ml的孢子液，取1 ml孢子液與9 ml營(yíng)養(yǎng)液（含2%蔗糖、0.5%蛋白胨）混合，于26±1℃振蕩（150 r/min）24 h，然后通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算活孢率。根據(jù)活孢率對(duì)孢子液濃度進(jìn)行校正。

2.1.2 家蠶選擇標(biāo)準(zhǔn)

選擇4齡或5齡起蠶用于試驗(yàn)。另外，家蠶剛眠起時(shí)體壁嫩薄，多褶皺，白僵菌容易粘附和穿透。如試驗(yàn)用蠶個(gè)體間體壁發(fā)育有差異，則影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，一般選擇眠起后8 h-12 h、大小勻一的起蠶。

2.1.3 浸浴攻毒

同一個(gè)試驗(yàn)區(qū)的家蠶放入一個(gè)球形濾網(wǎng)中，然后將濾網(wǎng)閉合。根據(jù)家蠶齡期、大小選擇不同規(guī)格的濾網(wǎng)，保證濾網(wǎng)閉合后蠶體間不發(fā)生擠壓刮傷。將病原液倒入燒杯，濾網(wǎng)浸沒(méi)到病原液以下并不斷搖動(dòng)15 s，然后提起濾網(wǎng)將水瀝干，把蠶轉(zhuǎn)到鋪好塑料蠶網(wǎng)的飼養(yǎng)盒內(nèi)，并用不銹鋼筷把蠶分開(kāi)。更換病原液，開(kāi)始下一區(qū)試驗(yàn)。攻毒1 h后給桑。

2.1.4 養(yǎng)蠶環(huán)境控制

白僵菌粘附到昆蟲(chóng)體表后，在適宜的溫濕度下發(fā)芽長(zhǎng)出芽管，然后借助芽管伸長(zhǎng)的機(jī)械壓力進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)寄生。白僵菌生長(zhǎng)的溫濕度為：溫度24℃-28℃、相對(duì)濕度 90%以上。攻毒后的蠶于生物培養(yǎng)箱或蠶室中飼養(yǎng)，各處理組和對(duì)照組家蠶均處于同樣的溫濕度環(huán)境中。

圖1 家蠶白僵病抗性檢測(cè)流程

2.1.5 數(shù)據(jù)調(diào)查

每天調(diào)查家蠶死亡情況。對(duì)出現(xiàn)的病死蠶及時(shí)揀出，蟲(chóng)尸保濕培養(yǎng)，觀察是否有氣生菌絲和分生孢子長(zhǎng)出。對(duì)其它病癥死亡的蠶進(jìn)行鏡檢，確認(rèn)發(fā)病原因。對(duì)調(diào)查數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率，分析試驗(yàn)蠶品種間的抗性差異。

2.2 實(shí)驗(yàn)誤差分析

分別利用本抗性檢測(cè)平臺(tái)和體噴法兩種方法對(duì)3個(gè)家蠶品種進(jìn)行抗性檢測(cè)。由圖2可以看出，以該檢測(cè)平臺(tái)進(jìn)行抗性檢測(cè)，各品種死亡率的標(biāo)準(zhǔn)差均較小，表明調(diào)查數(shù)據(jù)在各重復(fù)區(qū)間基本一致，重復(fù)性較好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為可靠。而且，在用于品種間抗性大小比較時(shí)能夠得到更為準(zhǔn)確的結(jié)果。如圖2（左）所示，春5的抗性稍弱于抗8，而用體噴法則很難判定它們的抗性大小。

圖2 兩種不同檢測(cè)方法獲得的抗性調(diào)查數(shù)據(jù)比較

3 討論與結(jié)論

開(kāi)展抗性蠶品種選育，建立技術(shù)規(guī)范、數(shù)據(jù)可靠、結(jié)論可重復(fù)的檢測(cè)方法是必要條件。不同于細(xì)菌和病毒，白僵菌主要經(jīng)表皮感染，再穿透體壁進(jìn)入蠶體內(nèi)寄生。目前試驗(yàn)中白僵菌感染家蠶的主要方法是體噴法[6]，該方法存在的主要問(wèn)題是：無(wú)法保證每條蠶接種的病原量一致，無(wú)法判斷試驗(yàn)誤差是來(lái)源于試驗(yàn)個(gè)體間抗性存在的固有差異還是由于蠶體病原量不一造成，給試驗(yàn)結(jié)果斷定帶來(lái)干擾；數(shù)據(jù)重復(fù)性不佳。

項(xiàng)目組建立了以浸浴攻毒為核心的抗性檢測(cè)平臺(tái)，通過(guò)對(duì)濾網(wǎng)和浸浴時(shí)間的規(guī)范，能夠保證家蠶個(gè)體體表接觸、粘附病原的機(jī)會(huì)是基本均等的。通過(guò)體噴法和本方法進(jìn)行了試驗(yàn)誤差比較，發(fā)現(xiàn)本方法的試驗(yàn)誤差明顯低于體噴法，各重復(fù)區(qū)數(shù)據(jù)具有更好的重復(fù)性，證實(shí)本檢測(cè)平臺(tái)具有較好的實(shí)用性、準(zhǔn)確性和可靠性。

利用該檢測(cè)平臺(tái)，一方面可用于家蠶抗白僵病的抗性評(píng)價(jià)。本項(xiàng)目組對(duì)本單位保存的家蠶品種資源進(jìn)行了白僵病抗性評(píng)價(jià)，篩選到數(shù)個(gè)對(duì)白僵病抗性較高的家蠶品種和敏感品種，為相關(guān)研究提供了品種素材。另一方面也可用于對(duì)白僵菌的毒力測(cè)定，從而發(fā)現(xiàn)優(yōu)良的菌株。我們對(duì)從蠶區(qū)分離獲得的白僵菌菌株進(jìn)行毒力比較，篩選到一株對(duì)家蠶具高致病力的球孢白僵菌菌株[7]，在中藥材白僵蠶的人工生產(chǎn)上具有極大的應(yīng)用價(jià)值。

[1]徐安英,林昌麒,錢(qián)荷英,等.耐家蠶核型多角體病毒病蠶品種“華康2號(hào)”的育成[J].蠶業(yè)科學(xué),2013,39(2):275-282.

[2]吳忠明,向志輝,韓世玉,等.耐家蠶核型多角體病毒蠶品種華康2號(hào)在黃平縣試養(yǎng)初報(bào)[J].中國(guó)蠶業(yè),2014,35(3):36-38.

[3]石美寧,閉立輝,顧家棟,等.家蠶抗血液型膿病新品種桂蠶N 2的選育[J].廣西蠶業(yè),2012,49(4):1-12.

[4]杜威,江萍,王彥蘇,等.白僵菌施加對(duì)水稻三種抗氧化酶活力及葉際微生物多樣性的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2014,34(23):6975-6984.

[5]杜廣祖,和淑琪,李正躍,等.幾株球孢白僵菌對(duì)縱坑切梢小蠹毒力測(cè)定[J].中國(guó)森林病蟲(chóng),2014,33(4):19-22.

[6]羅成，應(yīng)盛華，馮明光.球孢白僵菌對(duì)斜紋夜蛾高毒菌株篩選與制劑的研發(fā)[J].中國(guó)生物防治學(xué)報(bào),2011,27(2):188-196.

[7]邢東旭,李麗,廖森泰,等.一株感染家蠶的高致病性白僵菌的鑒定及在僵蠶生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].蠶業(yè)科學(xué),2014,40(5):879-883.