奚天雪， 楊 磊， 袁 玫， 李夢(mèng)琦， 張景華，周安琪， 高霞莉， 溫洪宇

（江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 江蘇 徐州221116）

土壤鹽漬化是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)重要的逆境脅迫因子之一，逐漸成為限制作物生長(zhǎng)、影響作物產(chǎn)量的主要因素［1］。我國(guó)鹽漬土總面積約3 600×104hm2，占全國(guó)可利用土壤面積的4.88%［2］。其中，我國(guó)耕地中鹽漬化的面積達(dá)920.9×104hm2，占全國(guó)耕地面積的6.62%，且土壤鹽堿化和次生鹽堿化逐年加重［2－3］。因此，研究作物抗鹽性，提高作物耐鹽性，是未來(lái)農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要課題之一［4］。

甘藍(lán)、白菜和油菜是中國(guó)重要的蔬菜作物。甘藍(lán)作為主要蔬菜作物，在我國(guó)各地廣泛栽種，到目前為止仍是占據(jù)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)主導(dǎo)地位的蔬菜品種之一［5］。白菜具有儲(chǔ)藏方便，耐久貯的特點(diǎn)，在蔬菜作物中保持較大比重，其種植面積居世界首位，2003年我國(guó)白菜播種面積達(dá)到269.9×104hm2，占全國(guó)蔬菜播種面積的15%［6－7］。蘇州青油菜具有早熟豐產(chǎn)、質(zhì)地鮮嫩、適應(yīng)性強(qiáng)、較耐寒等優(yōu)點(diǎn)，全國(guó)每年使用的蘇州青油菜種子達(dá)到50×104kg以上，并大量出口［8－10］。種子萌發(fā)期是植物對(duì)鹽脅迫非常敏感的時(shí)期，研究鹽脅迫下種子萌發(fā)以及對(duì)Na＋抗性規(guī)律，對(duì)提高蔬菜作物耐鹽水平和產(chǎn)量都具有重要意義。

非損傷微測(cè)技術(shù)（NMT）具有非損傷性、操作方便快捷、測(cè)量實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)、長(zhǎng)時(shí)間多維掃描、不受被測(cè)樣品的限制、高靈敏度和高分辨率等優(yōu)點(diǎn)，在植物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控、抗逆性等方面離子機(jī)制的研究中具有重要作用［11－14］。目前，NMT技術(shù)主要集中于植物葉片、根系等構(gòu)造上［13］，在種子耐鹽性方面的研究尚未見報(bào)道。

本研究以628甘藍(lán)、青雜中豐白菜、蘇州青油菜、茼蒿、上海雞毛菜種子為實(shí)驗(yàn)材料，采用非損傷微測(cè)技術(shù)，檢測(cè)NaCl處理下種子外Na＋流速的動(dòng)態(tài)變化，探究不同種子吸收或外排Na＋能力，并對(duì)不同NaCl濃度下種子萌發(fā)進(jìn)行研究，探究種子吸收或外排Na＋能力與其耐鹽性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

628甘藍(lán)、青雜中豐白菜、蘇州青油菜、茼蒿、上海雞毛菜種子均購(gòu)于江蘇省徐州市七里溝農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 非損傷微測(cè)實(shí)驗(yàn)

配制 NaCl濃度為10mmol／L的1／4Hoagland測(cè)試液。挑選顆粒飽滿、質(zhì)地均勻的628甘藍(lán)、青雜中豐白菜、蘇州青油菜、茼蒿、上海雞毛菜種子，每個(gè)種子設(shè)置10個(gè)重復(fù)，用蒸餾水清洗。利用非損傷微測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，灌充并校正玻璃微電極，固定電極作為參比電極。將種子置于測(cè)試液中固定好。將電極尖端置于距離種子表面10μm處作為遠(yuǎn)點(diǎn)，在垂直于種子表面方向約30μm處進(jìn)行兩點(diǎn)移動(dòng)，測(cè)量?jī)牲c(diǎn)電壓差。

1.2.2 種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)（培養(yǎng)皿濾紙法）

挑選顆粒飽滿、質(zhì)地均勻的628甘藍(lán)、青雜中豐白菜、蘇州青油菜種子，用3%NaClO消毒10min后用蒸餾水沖洗數(shù)遍，并用濾紙吸干種子表面水分。以1／4 Hoagland溶液為基本培養(yǎng)液，配制NaCl濃度分別為0，100，150，200，250，300mmol／L的處理液。在直徑9cm的培養(yǎng)皿底部鋪2層濾紙，每個(gè)培養(yǎng)皿中放入50粒種子，每種種子不同濃度各設(shè)置3個(gè)重復(fù)，并進(jìn)行編號(hào)。向培養(yǎng)皿中注入對(duì)應(yīng)鹽濃度的培養(yǎng)液，以浸濕濾紙和種子為宜，不要完全覆蓋種子，并使種子均勻分布于培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)，每天定時(shí)記錄萌發(fā)種子數(shù)，以胚根露出種皮0.2cm作為種子萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。每2d更換濾紙和培養(yǎng)液，培養(yǎng)至連續(xù)2d種子的萌發(fā)數(shù)不再增加為止。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 非損傷微測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

離子的流速可以通過(guò)Fick’s第一擴(kuò)散定律計(jì)算，計(jì)算公式如下：J＝－D·dc／dx。式中，J代表x方向的離子流，D是在特定的介質(zhì)中離子的擴(kuò)散常數(shù)，dc／dx表示離子濃度梯度［15］。Na＋離子流檢測(cè)數(shù)據(jù)處理通過(guò)旭月（北京）科技有限公司提供的軟件完成，并用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與作圖。

1.3.2 種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

每天記錄各處理種子萌發(fā)數(shù)，計(jì)算發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢(shì)，并找出耐鹽半致死濃度［16－19］。采用 Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與作圖。其中，耐鹽半致死濃度是指相對(duì)發(fā)芽率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的鹽濃度；發(fā)芽率（%）＝發(fā)芽結(jié)束時(shí)發(fā)芽種子數(shù)／供試種子數(shù)×100%；相對(duì)發(fā)芽率（%）＝處理發(fā)芽率／對(duì)照發(fā)芽率×100%；發(fā)芽指數(shù)（GI）＝∑（Gt／Dt），式中，Gt為發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)；發(fā)芽勢(shì)（%）＝前3d發(fā)芽種子數(shù)／供試種子數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl處理對(duì)種子吸收或外排Na＋的影響

在10mmol／L NaCl溶液處理下，甘藍(lán)和茼蒿種子外Na＋平均流速為正值，表明甘藍(lán)和茼蒿種子附近Na＋外流，即甘藍(lán)和茼蒿種子在10mmol／L NaCl溶液下排出Na＋（圖1）。其中，甘藍(lán)種子附近Na＋平均流速為0.009 21pmol／（cm2·s），茼蒿種子為0.000 65 pmol／（cm2·s），說(shuō)明排出 Na＋的效果：甘藍(lán)種子＞茼蒿種子。在10mmol／L NaCl溶液處理下，白菜、油菜和雞毛菜種子外Na＋平均流速為負(fù)值，表明白菜、油菜和雞毛菜種子附近Na＋內(nèi)流，即白菜、油菜和雞毛菜種子在10mmol／L NaCl溶液下吸收 Na＋（圖1）。其中，白菜附近Na＋平均流速分別為－0.033 19pmol／（cm2·s），油菜為－0.014 69pmol／（cm2·s），雞毛菜為－0.002 79pmol／（cm2·s）（表1），說(shuō)明吸收 Na＋的效果：白菜種子＞油菜種子＞雞毛菜種子。

圖1 10mmol／L NaCl處理下甘藍(lán)、茼蒿、白菜、油菜和雞毛菜種子外Na＋的平均流速

結(jié)果表明，不同種子對(duì)Na＋抗性不同。在10 mmol／L NaCl溶液處理下，甘藍(lán)和茼蒿種子排出Na＋，而白菜、油菜和雞毛菜種子吸收Na＋。其中，甘藍(lán)、白菜和油菜種子對(duì)Na＋吸收或外排的效果明顯。因此，選擇甘藍(lán)、白菜和油菜種子進(jìn)行不同NaCl濃度下種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，探究這3種種子的耐鹽性。

2.2 不同濃度的NaCl對(duì)種子萌發(fā)的影響

鹽脅迫對(duì)甘藍(lán)、白菜和油菜種子的萌發(fā)都有明顯的抑制作用。當(dāng)NaCl濃度為0mmol／L時(shí)，3種種子的發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)差別不大，但隨著NaCl濃度的增加，這些發(fā)芽指標(biāo)都呈明顯下降趨勢(shì)（表1，表2）。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到300mmol／L時(shí)，甘藍(lán)、白菜和油菜種子的發(fā)芽率分別為37.33%、14.67%和 10.00%，相 對(duì) 發(fā) 芽 率 分 別 為 50.45%、20.00%和13.16%（表1）；甘藍(lán)、白菜和油菜種子的發(fā)芽率下降率分別為49.55%、79.99%和86.84%，相對(duì)發(fā)芽 率 下 降 率 分 別 為49.55%、80.00% 和 86.84%（表2）。

以NaCl濃度為橫坐標(biāo)，以相對(duì)發(fā)芽率為縱坐標(biāo)，得甘藍(lán)和白菜回歸方程分別為：y＝－0.161 x＋102.121，y＝－0.223 x＋103.896。將50%帶入方程（即y等于50），求得甘藍(lán)和白菜耐鹽半致死濃度分別為：323.73mmol／L和241.68mmol／L。油菜耐鹽半致死濃度為200mmol／L（表2）。所以，耐鹽半致死濃度大小順序?yàn)椋焊仕{(lán)種子＞白菜種子＞油菜種子。

結(jié)果表明，甘藍(lán)種子的耐鹽性最強(qiáng)，其次是白菜種子，油菜種子的耐鹽性最差。

表1 NaCl脅迫對(duì)不同種子萌發(fā)的影響

表2 NaCl脅迫下不同種子萌發(fā)指標(biāo)的下降率（%）

3 討 論

高鹽脅迫對(duì)種子萌發(fā)具有顯著的抑制作用，在高鹽脅迫下，種子發(fā)芽率等指標(biāo)顯著降低，種子萌發(fā)受到嚴(yán)重抑制。這是因?yàn)楦啕}脅迫下，大量Na＋流入細(xì)胞，致使細(xì)胞膜電位發(fā)生去極化過(guò)程，使包括K＋、H＋和Ca＋在內(nèi)的大量陽(yáng)離子外流，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)外道南平衡被打破。K＋的嚴(yán)重缺失會(huì)導(dǎo)致植物抗寒性和抗旱性等耐受性下降，葉色變黃，植物易倒伏并逐漸壞死，而H＋和Ca＋缺失將導(dǎo)致細(xì)胞胞漿生化反應(yīng)紊亂，細(xì)胞分化發(fā)育終止［20］。同時(shí)，離子含量的變化也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞滲透勢(shì)調(diào)節(jié)能力大大降低，細(xì)胞內(nèi)水分大量外流，種子吸水困難，從而造成細(xì)胞內(nèi)水分虧缺，抑制種子萌發(fā)［21－23］。

自然進(jìn)化過(guò)程中，不同植物形成了不同的耐鹽機(jī)制，包括降低Na＋的吸收、增加Na＋的外排和Na＋在細(xì)胞內(nèi)區(qū)隔化等，如甜土植物擬南芥利用SOS1等家族蛋白置換體內(nèi)過(guò)多的Na＋，調(diào)節(jié)細(xì)胞K＋／Na＋平衡［24］，而植物體內(nèi)K＋／Na＋平衡是植物耐受鹽脅迫的主要機(jī)制［25－26］；大洋洲濱藜和四翅濱藜能夠通過(guò)區(qū)隔化的方式消除Na＋毒害［26］。本實(shí)驗(yàn)利用非損傷微測(cè)技術(shù)檢測(cè)10mmol／L NaCl溶液處理下種子外Na＋的平均流速，發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)外排Na＋，而白菜和油菜吸收Na＋，通過(guò)不同NaCl濃度下種子的萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，表明甘藍(lán)種子的耐鹽性明顯高于白菜和油菜種子，進(jìn)一步說(shuō)明植物可以通過(guò)增加Na＋的外排減弱Na＋對(duì)種子的毒害作用［26］。

［1］金美芳，朱曉清.NaCl脅迫對(duì)油菜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響［J］.種子，2009，28（9）：76－79.

［2］楊勁松.中國(guó)鹽漬土研究的發(fā)展歷程與展望［J］.土壤學(xué)報(bào)，2008，45（5）：837－845.

［3］周和平，張立新，禹鋒，等.我國(guó)鹽堿地改良技術(shù)綜述及展望［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2007（11）：159－164.

［4］劉念，范其新，蒙大慶，等.鹽脅迫對(duì)高芥酸、雙低油菜品種種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，29（4）：457－459.

［5］楊麗梅，方智遠(yuǎn)，劉玉梅，等.“十一五”我國(guó)甘藍(lán)遺傳育種研究進(jìn)展［J］.中國(guó)蔬菜，2011（2）：1－10.

［6］崔輝梅，陳曾.鹽脅迫對(duì)白菜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（18）：4 680－4 682.

［7］張鳳蘭，徐家炳.我國(guó)白菜育種研究進(jìn)展［J］.中國(guó)蔬菜，2005（10／11）：1－3.

［8］王國(guó)燦.秋季蘇州青高產(chǎn)高效栽培技術(shù)［J］.上海蔬菜，2010（6）：29－30.

［9］鄭賢利，程品晶，張泊麗，等.γ輻射對(duì)蘇州青種子萌發(fā)率及生長(zhǎng)的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（29）：17 845－17 846.

［10］楊利玲.氮、磷、鉀失調(diào)對(duì)“蘇州青”青菜生長(zhǎng)的影響［J］.北方園藝，2009（10）：71－73.

［11］丁亞男，許越.非損傷微測(cè)技術(shù)及其在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.物理，2007（7）：548－558.

［12］應(yīng)莉萍，上官宇，許越.非損傷性掃描離子選擇電極技術(shù)及其在高等植物研究中的應(yīng)用［J］.自然科學(xué)進(jìn)展，2006，16（3）：262－266.

［13］李靜，韓慶慶，段麗婕，等.非損傷微測(cè)技術(shù)在植物生理學(xué)研究中的應(yīng)用及進(jìn)展［J］.植物生理學(xué)報(bào)，2014，50（10）：1 445－1 452.

［14］王巧華，張濤，馬美湖.基于非損傷微測(cè)技術(shù)監(jiān)測(cè)貯期雞蛋氧呼吸規(guī)律［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2014，30（5）：255－261.

［15］朱會(huì)朋，孫健，趙楠，等.鹽脅迫下硫化氫調(diào)控楊樹根系的離子流［J］.植物生理學(xué)報(bào)，2013，49（6）：561－567.

［16］張秀玲.溫度和鹽分脅迫對(duì)野生大豆種子萌發(fā)的影響［J］.大豆科學(xué)，2014，33（2）：195－202.

［17］齊淑艷，段繼鵬，郭婷婷，等.入侵植物牛膝菊種子萌發(fā)對(duì)PEG模擬干旱脅迫的效應(yīng)［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2014，33（5）：1 190－1 194.

［18］孫西紅，趙凌平，王占彬.Na2CO3脅迫對(duì)高羊茅種子萌發(fā)的影響［J］.草業(yè)科學(xué)，2014，31（4）：677－682.

［19］羅永清，趙學(xué)勇，朱陽(yáng)春，等.不同培養(yǎng)條件下差巴嘎蒿種子萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)特征［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2014，25（1）：31－36.

［20］潘瑞熾.植物生理學(xué)［M］.北京：高等教育出版社，2012：36－38.

［21］楊飛，郭海波，吳菊，等.NaCl脅迫對(duì)白菜種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響［J］.北方園藝，2014（1）：26－29.

［22］胡曉輝，王素平，曲斌.NaCl脅迫下亞精胺對(duì)番茄種子萌發(fā)及幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，20（2）：449－450.

［23］陳敏，楊玉杰，李海云.NaCl脅迫對(duì)羽衣甘藍(lán)種子萌發(fā)的影響［J］.北方園藝，2011（16）：17－19.

［24］Magdalena M.Julkowska and Christa Testerink.Tuning plant signaling and growth to survive salt［J］.Trends in Plant Science，2015，1313：9.

［25］Jin－Lin Zhang，Timothy J.Flowers，Suo－Min Wang.Mechanisms of sodium uptake by roots of higher plants［J］.Plant and Soil，2010，326（1）：45－60.

［26］毛桂蓮，李國(guó)旗，許興，等.NaHCO3脅迫下3種灌木 Na＋、K＋、Ca＋的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)［J］.應(yīng)用生理學(xué)報(bào)，2014，25（3）：718－724.