李云靜， 張建逵， 何婉婉， 康廷國， 王 冰

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 遼寧 大連116600）

中藥黃芩為唇形科植物黃芩（Scutallaria baicalensis Georgi）的干燥根。味苦性寒。具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎之功效［1］。目前市售黃芩的主流商品是栽培品。但栽培黃芩的種子質(zhì)量參差不齊，種子質(zhì)量直接影響到種苗的生長以及藥材的品質(zhì)與產(chǎn)量。因此，需要通過科學(xué)有效的方法對市場流通的黃芩種子進行質(zhì)量檢驗。本實驗對黃芩種子質(zhì)量檢驗方法進行了初步研究，以期為今后制定黃芩種子質(zhì)量檢驗規(guī)程以及質(zhì)量分級標準提供參考。

1 材 料

黃芩種子分別采自山東省沂水縣，河北省承德市，陜西省澄城縣，山西省長治縣，安徽省亳州市和甘肅省隴西縣等6地。經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)王冰教授鑒定，均為唇形科植物黃芩（Scutallaria baicalensis Georgi）的種子。

2 方 法

2.1 扦 樣

參照《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程扦樣》（GB／T 3543.2）的標準執(zhí)行［2］。根據(jù)黃芩種子市場流通情況和單次可能的交易量，凈度分析不少于2 500粒種子，送檢樣品量應(yīng)不少于凈度分析10倍量原則，確定凈度分析及送檢的最小樣品量。

2.2 凈度分析

依照《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程凈度分析》（GB／T 3543.3）執(zhí)行［2］。將扦樣得到的種子，分別稱取5g，置于潔凈的玻璃板上，在不損傷種子的基礎(chǔ)上，用鑷子將凈種子與雜質(zhì)及其他種子區(qū)分開，并分別稱重，重復(fù)3次，計算凈種子率。

凈種子率（%）＝凈種子質(zhì)量／（雜質(zhì)質(zhì)量＋其他種子質(zhì)量）×100%。

2.3 真實性鑒定

觀察種子外觀形態(tài)表面特征及顏色，每個產(chǎn)地隨機數(shù)取100粒凈種子，4次重復(fù)，用游標卡尺對種子的長度、寬度與厚度進行逐粒測量，并對測量結(jié)果進行記錄。

2.4 重量測定［2］

分別用百粒法、五百粒法和千粒法測定每份種子樣品的重量。分別計算變異系數(shù)。

2.5 水分測定

參照《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程水分測定》（GB／T 3543.6）執(zhí)行［10］。分別采用高溫烘干法和低恒溫烘干法測定每個產(chǎn)地種子樣品的含水量。

1）低恒溫烘干法：分別在（105±2）℃低恒溫條件下設(shè)置5，10，15，20h計算種子水分損失量。

2）高溫烘干法：分別在（133±2）℃高溫條件下，設(shè)置1，2，3，4，5h計算種子水分損失量。

以上測定每產(chǎn)地3次重復(fù)，每重復(fù)（5±0.001）g。

2.6 生活力測定［3］

2.6.1 氯化三苯基四氮唑法（TTC法）

將各產(chǎn)地的黃芩種子編號，每產(chǎn)地種子隨機分為2組，一組用沸水煮15min至失活，作為空白對照，另一組用蒸餾水在室溫下浸泡5h，使種皮軟化種子吸脹。每批種子均用濃度為0.4%，0.7%，1%的氯化三苯基四氮唑溶液染色，染色溫度為25，30，35，40℃共4個水平，染色時間分別為2，4，6h。染色結(jié)束后根據(jù)種胚的著色部位及著色程度來鑒定種子的生活力，每個處理設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)100粒。并計算有生活力種子的百分率。用均勻設(shè)計法來優(yōu)化種子的最優(yōu)染色條件。

2.6.2 紅墨水染色法

將各產(chǎn)地的黃芩種子編號，每產(chǎn)地種子隨機分為2組，一組用沸水煮15min至失活，作為空白對照（死種子），另一組直接染色。用靛紅染色劑配制成濃度為5%的靛紅染色液，在30℃恒溫條件下染色，染色時間分別為2，3h。染色完畢后，用自來水沖洗4～5次，洗去染色液，根據(jù)種胚著色程度及空白對照來鑒定種子的生活力，每個處理3次重復(fù)，每重復(fù)100粒。計算有生活力種子的百分率。

2.6.3 溴麝香草酚藍法（BTB法）

將各產(chǎn)地的黃芩種子編號，每產(chǎn)地種子隨機分為2組，一組用沸水煮15min至失活，作為空白對照，另一組用蒸餾水在室溫下浸泡5h使種子吸脹。然后分別把已經(jīng)吸脹的黃芩種子整齊的接種于備好的0.05%，0.1%，0.2%的 BTB瓊脂凝膠中，在30℃恒溫條件下培養(yǎng)2h后，觀察種子周圍出現(xiàn)黃色暈圈的情況，若出現(xiàn)暈圈則表明種子有活力。每個產(chǎn)地各濃度水平設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)100粒。計算有生活力種子的百分率。

2.7 發(fā)芽率測定［2－3］

2.7.1 發(fā)芽前處理方法的選擇

種子先用0.1%的次氯酸鈉溶液浸泡10min消毒，再用蒸餾水沖洗4～5遍，之后進行發(fā)芽前處理。1）種子未用蒸餾水常溫浸泡吸脹，直接進行發(fā)芽試驗；2）種子用蒸餾水常溫浸泡過夜，吸脹后進行發(fā)芽試驗。以上種子以紗布墊雙層濾紙為發(fā)芽床，恒溫25℃無光照培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽試驗，每處理3次重復(fù)，每重復(fù)100粒種子。

2.7.2 發(fā)芽床的選擇

各產(chǎn)地種子經(jīng)蒸餾水常溫浸泡過夜吸脹后，選取紙上，紙間，沙上，沙間，紗布，紗布墊紙6種發(fā)芽床試驗。將各個產(chǎn)地的種子分別置于6種不同發(fā)芽床，在25℃恒溫，無光照條件的培養(yǎng)箱中發(fā)芽。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)100粒種子并計算發(fā)芽率。

2.7.3 發(fā)芽溫度的選擇

各產(chǎn)地種子經(jīng)蒸餾水常溫浸泡過夜吸脹后，以紗布墊紙為發(fā)芽床，分別置于15，25，35℃恒溫無光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)，每重復(fù)100粒種子并計算發(fā)芽率。

2.7.4 發(fā)芽首次和末次計數(shù)時間的確定

記錄種子初次和末次發(fā)芽時間，以胚根突出種皮長度達到種子長度一半時的天數(shù)作為初次計數(shù)時間；以種子發(fā)芽數(shù)達到最高，以后再無發(fā)芽種子出現(xiàn)時的天數(shù)作為末次計數(shù)時間。

2.7.5 發(fā)芽率和發(fā)芽勢的測定

通常種子著床后3～5d時種子發(fā)芽速度最大，因此在種子培養(yǎng)5d時計算發(fā)芽勢。

發(fā)芽率（%）＝發(fā)芽種子總數(shù)／供試種子數(shù)×100%；

發(fā)芽勢（%）＝發(fā)芽高峰期發(fā)芽的種子數(shù)／供試種子數(shù)×100%。

2.8 種子健康檢驗

2.8.1 帶菌率檢驗

各產(chǎn)地種子隨機抽取10粒，參照文獻［2］和文獻［3］的方法操作。

2.8.2 害蟲檢驗

各產(chǎn)地種子隨機抽取50粒，參照文獻［4］的方法操作。

3 結(jié)果與分析

3.1 扦 樣

參照《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》（GB／T 3543.2）的標準執(zhí)行，種子批的最大重量為10 000kg，送檢樣品最少為50g，凈度分析試樣最少為5g（不少于2 500粒）［2］。

3.2 凈度分析

各產(chǎn)地的黃芩種子凈度測定結(jié)果見表1。種子凈度均能達到90%以上。使用此方法做凈度分析，各組試樣增失差距均沒有偏離原始質(zhì)量的5%。因此，本方法科學(xué)可行。

3.3 真實性鑒定

種子真實性鑒定結(jié)果如下：小堅果，長圓形至卵圓形，扁平，腹面近基部具果臍，長0.85～2.35mm，寬0.38～1.75mm，厚0.19～1.36mm，黑褐色或淺黑褐色，種皮表面具不規(guī)則棱，千粒重一般為1.469～1.910g。

表1 種子的凈度分析

3.4 重量測定

采用3種不同方法對黃芩種子重量分析比較的結(jié)果見表2。百粒法的變異系數(shù)大于4.0%；通過方差分析，五百粒法及千粒法2種方法測定6份種子試樣的重量，各處理間無顯著性差異（p＝0.201＞0.05），并且數(shù)據(jù)重復(fù)間變異系數(shù)均小于4.0%，測定值均有效。因此，五百粒法和千粒法均可用于黃芩種子的重量測定，鑒于前者所需的種子量較少，故選用五百粒法。

表2 種子不同重量測定方法比較

3.5 水分測定

采用2種方法對各產(chǎn)地黃芩種子試樣進行水分測定，結(jié)果見表3。從表3可看出，黃芩種子在高溫下烘干4h后，失水量基本保持穩(wěn)定。低恒溫烘干后5～15 h內(nèi)失水量差異較大，20h后重量基本穩(wěn)定。對高溫烘干4h和低溫烘干15h進行差異顯著性檢驗，2種烘干方法間測定值無顯著性差異（p＞0.05）。鑒于低恒溫烘干法耗時較長，故選擇高溫烘干4h為宜。

3.6 生活力測定

3.6.1 氯化三苯基四氮唑法（TTC法）

影響染色效果的因素主要有染色溫度（A），染色時間（B），TTC濃度（C），采用均勻設(shè)計的方法，以種胚的染色率為評價指標，參照回歸方程選擇最佳染色條件?；貧w方程為：Y ＝－84.911＋2.651×A＋5.479×B＋23.611×C，R＝0.954。因此優(yōu)化的條件為：TTC濃度1%，染色溫度40℃，染色時間為6h。

3.6.2 紅墨水染色法

從表4可看出。對不同培養(yǎng)時間的具生活力種子平均比率進行差異性檢驗，結(jié)果無顯著性差異（p＞0.05），故紅墨水染色法的條件為30℃恒溫條件下染色2h。

3.6.3 溴麝香草酚藍法（BTB法）

從表5可看出，其中濃度為0.05%，0.1%的BTB瓊脂凝膠中均有種子周圍出現(xiàn)黃色暈圈，但濃度為0.2%BTB瓊脂凝膠中的種子周圍并未出現(xiàn)黃色暈圈，無法統(tǒng)計具生活力種子比率。其原因可能是由于黃芩種子呼吸作用釋放出的CO2濃度較低，未達到顯色的程度。對0.05%和0.1%2個濃度的具生活力種子比率進行差異性檢驗，結(jié)果并無顯著性差異（p＞0.05），考慮到節(jié)省實驗材料，故選擇濃度為0.05%，的BTB瓊脂凝膠進行顯色培養(yǎng)。

3.7 發(fā)芽試驗

3.7.1 發(fā)芽前處理方法

從表6可看出，吸脹處理和未吸脹處理種子發(fā)芽率有極顯著性差異（p＜0.01）。因此應(yīng)將種子用蒸餾水于室溫下浸泡過夜，使種子吸脹后置于發(fā)芽床上進行發(fā)芽培養(yǎng)。

3.7.2 發(fā)芽床與發(fā)芽溫度的選擇

不同產(chǎn)地的黃芩種子均已經(jīng)過1%的次氯酸鈉溶液消毒10min，并浸泡過夜使之吸脹，不同發(fā)芽床、不同發(fā)芽溫度下的發(fā)芽率和發(fā)芽勢見表7，由表7可見，種子在紗布墊紙的發(fā)芽床上的發(fā)芽率和發(fā)芽勢均為最高，25℃為最佳培養(yǎng)溫度。故種子最佳發(fā)芽條件為25℃時紗布墊紙培養(yǎng)床。

表3 不同烘干方法種子失水量的變化

表4 紅墨水法測定種子的生活力

表5 BTB法測定種子的生活力

表6 不同前處理方法的種子發(fā)芽率

3.7.3 發(fā)芽天數(shù)的確定

黃芩種子經(jīng)浸泡吸脹，置床后第2天便出現(xiàn)發(fā)芽現(xiàn)象，第5天后發(fā)芽速度明顯下降，逐漸緩慢，第8天幾乎停止發(fā)芽，見圖1。所以第2天為初次發(fā)芽記錄時間，第7天為末次發(fā)芽記錄時間。

圖1 種子發(fā)芽率隨發(fā)芽天數(shù)變化趨勢

3.7.4 種子生活力與種子發(fā)芽率相關(guān)性分析

選取最適發(fā)芽條件及3種生活力測定法的最優(yōu)條件對不同產(chǎn)地的種子進行培養(yǎng)，對其發(fā)芽率與生活力進行測定，結(jié)果如表8所示。

將3種生活力測定方法的結(jié)果與相應(yīng)的發(fā)芽率結(jié)果進行相關(guān)性分析，其中BTB法和紅墨水法測定結(jié)果與發(fā)芽率測定結(jié)果相關(guān)性均不顯著（p＞0.05）。TTC法測定結(jié)果與發(fā)芽率測定結(jié)果具有極顯著相關(guān)性（p＜0.01），相關(guān)系數(shù)為r＝0.943。故選擇 TTC法為黃芩種子生活力測定方法。

3.8 種子健康檢驗

對6批種子進行帶菌率及害蟲檢驗，結(jié)果見表9。

3.9 黃芩種子質(zhì)量檢驗方法的確定

根據(jù)以上實驗結(jié)果，初步建立了適合黃芩種子的質(zhì)量檢驗方法，見表10。

表7 不同發(fā)芽床、不同發(fā)芽溫度下的發(fā)芽率和發(fā)芽勢

表8 種子生活力與發(fā)芽率

表9 帶菌率及害蟲檢出率

表10 黃芩種子質(zhì)量檢驗方法

4 討 論

4.1 實驗分別使用了TTC法，BTB法及紅墨水染色法對6份不同產(chǎn)地的黃芩種子進行了生活力檢測，種子均能檢測出有較高的生活力，但考慮到生活力與種子實際發(fā)芽率間的關(guān)系，只有將生活力測定結(jié)果與種子的實際發(fā)芽率進行相關(guān)性分析之后，才可根據(jù)相關(guān)性的大小來判定哪種生活力檢測方法最適合。本實驗所采用的生活力檢測方法與國家標準的相同，亦可說明TTC法檢測的科學(xué)合理性。

4.2 本實驗的種子質(zhì)量檢驗方法與地方標準［5－6］相比，增加了種子健康度的檢驗，可為今后種子分級標準的制定提供更全面的參考。

4.3 在重量，含水量，生活力，發(fā)芽率及健康度等指標的檢測中均采用了不同的方法，而測定方法的不同，測出的結(jié)果也不同。所以若要使種子質(zhì)量檢驗結(jié)果準確、一致，則必須要制定一個統(tǒng)一、科學(xué)有效的種子質(zhì)量檢驗方法。

4.4 開展中藥材種子質(zhì)量研究，制定中藥材種子質(zhì)量級標準，是推進中藥材規(guī)范化栽培的一項重要任務(wù)［7］。近5年來，已有白花蛇舌草［8］、川白芷［9］、苦參［10］、王不留行［11］、水 飛 薊［12］牛 蒡［13］、云 木 香［14］等 種 子 的 質(zhì)量檢驗方法研究報道。黃芩種子目前還沒有國家質(zhì)量標準，本研究選參照《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》，從扦樣、凈度分析、真實性鑒定，重量測定、發(fā)芽試驗、水分測定、生活力測定、健康度測定8個方面對黃芩種子質(zhì)量檢驗方法進行了研究，初步確定了黃芩種子的質(zhì)量檢驗方法，為制定黃芩種子檢驗規(guī)程及分級標準奠定了基礎(chǔ)，對促進黃芩規(guī)范化種植具有推動作用。

［1］國家藥典委員會，中華人民共和國藥典（一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：301－302.

［2］國家技術(shù)監(jiān)督局，農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程（GB／T 3543－1995）［S］.1995.

［3］孫榮進，杜婷，楊光義，等.蔓荊子種子生活力的測定及其與發(fā)芽率的相關(guān)性研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（17）：130－133.

［4］周陛勛.林木種子檢驗［M］.北京：中國標準出版社，1986：171－172.

［5］安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.安徽省地方標準：黃芩種子（DB 34／554－2005）［S］.2005.

［6］河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.河北省地方標準：中藥材種子質(zhì)量標準第2部分：黃芩（DB 13／T 1083.2－2009）［S］.2009.

［7］任德全，周榮漢.中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GAP）實施指南［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003：26－26.

［8］盧魏魏，朱再標，郭巧生，等.白花蛇舌草種子質(zhì)量檢驗方法研究［J］.中國中藥雜志，2012，37（10）：1 366－1 371.

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