裴進(jìn)洪 綜述 李青峰 審校

脂肪活性檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

裴進(jìn)洪 綜述 李青峰 審校

脂肪細(xì)胞活性檢測(cè)方法用于在體外判斷脂肪細(xì)胞的活性，包括一般細(xì)胞活性檢查法，和脂肪細(xì)胞特異性檢驗(yàn)法。我們對(duì)常用的脂肪細(xì)胞活性檢測(cè)方法的原理、特性，以及相關(guān)應(yīng)用情況進(jìn)行綜述。

脂肪細(xì)胞活性檢測(cè)特異性

1893年，Neuber首先提出了自體脂肪移植的概念。上世紀(jì)80年代，隨著脂肪抽吸技術(shù)的出現(xiàn)，自體脂肪顆粒的獲取更加簡便。1986年，Illouz[1]將脂肪抽吸術(shù)所獲得的脂肪，注射到軟組織缺損的部位，開創(chuàng)了脂肪細(xì)胞移植。自體脂肪細(xì)胞移植無免疫及排斥反應(yīng)，取材容易、組織損傷小，同時(shí)可起到供區(qū)減脂瘦身的作用。但脂肪移植的存活率較低，且效果難以預(yù)測(cè)，移植的脂肪呈現(xiàn)進(jìn)行性體積縮小。為了尋找影響脂肪活性的因素，從而提高移植脂肪的存活率，出現(xiàn)了各種檢測(cè)脂肪細(xì)胞活性的方法。主要有通過檢測(cè)細(xì)胞膜完整性的臺(tái)盼藍(lán)染色、熒光染色，檢測(cè)亞細(xì)胞器功能的MTT法、XTT法、CCK-8法、alamarBlue、JC-1、溴-脫氧尿嘧啶摻入法，檢測(cè)細(xì)胞酶功能的LDH釋放法、GAPDH，以及檢測(cè)細(xì)胞死亡標(biāo)志物的FITC Annexin V等。本文對(duì)常用的脂肪細(xì)胞活性檢測(cè)方法的原理、特性，以及相關(guān)應(yīng)用情況進(jìn)行綜述。

1 細(xì)胞膜完整性檢測(cè)

1.1 臺(tái)盼藍(lán)染色

臺(tái)盼藍(lán)染色是組織和細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的死細(xì)胞鑒定方法之一。胞膜結(jié)構(gòu)完整的正?；罴?xì)胞能夠排斥臺(tái)盼藍(lán)，因此臺(tái)盼藍(lán)不能夠進(jìn)入胞內(nèi)，而死亡細(xì)胞或細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色。通常認(rèn)為，細(xì)胞膜完整性喪失，即可認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)死亡。臺(tái)盼藍(lán)與中性紅作用相反。

臺(tái)盼藍(lán)染色操作簡便，可快速區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，費(fèi)用低廉。隨著流式細(xì)胞儀的發(fā)展，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)化變得簡便而準(zhǔn)確。

Hwang等[2]應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)了脂肪細(xì)胞活性在不同冷藏條件下的變化，發(fā)現(xiàn)該方法由于計(jì)數(shù)時(shí)焦平面的選擇、顆粒識(shí)別的準(zhǔn)確性等，易高估細(xì)胞活性。臺(tái)盼藍(lán)染色顯示的活細(xì)胞，會(huì)在熒光顯微下呈現(xiàn)為死細(xì)胞。所以臺(tái)盼藍(lán)染色應(yīng)和其他檢測(cè)方法同時(shí)應(yīng)用，以提高準(zhǔn)確性。

1.2 熒光染色法

熒光染料在吸收紫外線或可見光后，能把短波長的光轉(zhuǎn)變?yōu)殚L波的可見光而反射出來，呈閃亮的鮮艷色彩。熒光染色法是利用熒光染料的這種性質(zhì)來檢測(cè)細(xì)胞的活性。熒光染料主要分為不能滲透活細(xì)胞胞膜的PI（Propidium iodide）、EB（Ethidium bromide）、7-AAD，和能滲透活細(xì)胞胞膜的AO（Acridine Orange）等。熒光染色法能與另一種熒光染料或其他染料同時(shí)使用，如AO-EB雙染法等，可同時(shí)染色凋亡細(xì)胞和活性細(xì)胞，使分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果更簡便而準(zhǔn)確。同時(shí)，由于靈敏度高，操作方便，被廣泛應(yīng)用于熒光免疫、熒光探針、細(xì)胞染色等。但與其他基于熒光染料標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)一樣，需要使用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀。

1.2.1 FDA/PI

Son等[3]為了檢驗(yàn)離心對(duì)脂肪細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞活性的影響，采用FDA-PI染色法。FDA是能通過細(xì)胞膜的細(xì)胞酶底物，進(jìn)入活細(xì)胞后，從無免疫熒光的FDA，被細(xì)胞酶轉(zhuǎn)換成綠色免疫熒光的“Fluorescin”，它是細(xì)胞活性的指標(biāo)。它穿過死細(xì)胞膜的無序區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋，從而產(chǎn)生紅色熒光。但Boyd等[4]認(rèn)為，F(xiàn)DA/PI法影響因素過多，很難掌握，難以避免操作過程中的主觀因素。因此，該方法的檢測(cè)結(jié)果并不準(zhǔn)確。

1.2.2 Calcein-AM和碘化丙啶（PI)免疫熒光試驗(yàn)

Calcein-AM和碘化丙啶（PI）溶液，分別可對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯親脂性很高，可透過細(xì)胞膜，通過活細(xì)胞內(nèi)的酯酶作用，能脫去AM基，產(chǎn)生的Calcein（鈣黃綠素），能發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。因此，Calcein-AM僅對(duì)活細(xì)胞染色。另外，作為核染色染料的PI不能穿過活細(xì)胞的細(xì)胞膜。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時(shí)觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞；用545 nm激發(fā)，則僅可觀察到死細(xì)胞。

與同類試劑比較，Calcein細(xì)胞毒性較低，不會(huì)抑制任何細(xì)胞的正常生理功能或動(dòng)態(tài)變化[5]。Tai等[6]通過比較Calcein-AM/PI和Cr51檢測(cè)細(xì)胞毒性結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)的Cr 51-釋放法所得結(jié)果相一致，因此認(rèn)為使用Calcein活性檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是十分可信的。但Calcein-AM的ester部位遇到水分會(huì)分解，使用后要在-20℃下密閉冷凍保存，并且PI有致癌可能，對(duì)操作者有一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。

1.2.3 Perilipin免疫熒光染色

Perilipin是脂肪細(xì)胞脂滴表面富含有的蛋白，不僅在成熟脂肪細(xì)胞分化的前體脂肪細(xì)胞內(nèi)起作用，在脂肪細(xì)胞內(nèi)對(duì)甘油三酯的存儲(chǔ)和分解也具有重要的調(diào)控作用。Perilipin保護(hù)脂肪組織，減少水解，可影響脂肪細(xì)胞的活性及分化[7]。這種方法針對(duì)脂滴表面蛋白進(jìn)行免疫熒光，對(duì)脂肪細(xì)胞活性檢測(cè)具有特異性。通過免疫熒光染色，可間接反映出細(xì)胞數(shù)量，脂滴周圍蛋白被染色，呈綠色的細(xì)胞為活細(xì)胞，未染色的為死細(xì)胞。Perilipin免疫熒光染色法是近年來檢測(cè)脂肪細(xì)胞活性的首選方法之一，具有特異性，操作簡便，可區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，準(zhǔn)確性高，可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果可數(shù)據(jù)化，簡便而準(zhǔn)確[8]。

2 亞細(xì)胞器功能檢測(cè)

2.1 MTT法、XTT法、CCK-8法

MTT法檢測(cè)原理：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶，能使外源性MTT還原為不溶水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在540 nm或720 nm波長處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

MTT法使用方便，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑，檢測(cè)快速、靈敏度高、可重復(fù)性高、對(duì)細(xì)胞毒性小，并且價(jià)格低廉，成為細(xì)胞活性檢測(cè)最常用的方法。但是，因?yàn)镸TT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測(cè)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性有一定的影響，而且溶解甲瓚的有機(jī)溶劑對(duì)操作者具有危害行。為了解決該問題，XTT、CCK-8等水溶性的四氮唑鹽類被應(yīng)用于此類研究。

XTT的化學(xué)名為2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細(xì)胞還原成水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物。當(dāng)XTT與電子耦合劑（例如PMS）聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，其所產(chǎn)生的水溶性的甲臜產(chǎn)物的吸光度與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。

CCK-8試劑中含有WST-8，化學(xué)名為2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450 nm波長處測(cè)定其光吸收值，可間接反應(yīng)活細(xì)胞數(shù)量，其熒光原理與XTT、MTT相同。

XTT和MTT法使用方便、檢測(cè)快速、靈敏度高，XTT重復(fù)性優(yōu)于MTT，但是XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。與MTT法相比，CCK-8和XTT法的費(fèi)用較高，并且由于是貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，在讀吸光值時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)板底部附著的細(xì)胞可能會(huì)對(duì)數(shù)值有一定的影響，因此在加入CCK-8的3～4 h后，將上清液重新吸取到另一干凈的酶標(biāo)板中進(jìn)行讀值，可提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

2.2 alamarBlue一步熒光測(cè)定法

alamarBlue為活細(xì)胞代謝指示劑，易溶于水，進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)線粒體酶促還原，產(chǎn)生熒光及顏色變化，可用于定量。此試劑的主要成分是一種氧化還原指示劑，在氧化狀態(tài)下呈現(xiàn)紫藍(lán)色，無熒光性；而在還原狀態(tài)下，呈粉紅或紅色熒光，其吸收峰為530～560 nm，散射峰為590 nm。

alamarblue特異性低，但靈敏度高，重復(fù)性好，結(jié)果差異小，使用方便，無需預(yù)先標(biāo)記靶細(xì)胞及離心、洗滌步驟，適用于大批量樣品的高準(zhǔn)確性自動(dòng)測(cè)定。染料濃度不影響細(xì)胞正常代謝及基因表達(dá)，可在無菌條件下測(cè)定后繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增細(xì)胞，有利于對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的連續(xù)監(jiān)測(cè)及深入研究。另外，還可測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖或化學(xué)物質(zhì)的細(xì)胞毒性及細(xì)胞凋亡。含胎牛血清及酚紅的培養(yǎng)液也不干擾測(cè)定結(jié)果。但由于alamarBlue分解產(chǎn)物偏紅，不能用粉紅色培養(yǎng)基，并且培養(yǎng)時(shí)間也較長，試劑成本較高[9]。

2.3 JC-1

線粒體膜電位是檢測(cè)細(xì)胞活性的關(guān)鍵因素之一。線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性指標(biāo)。JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位（Mitochondrial membrane potential）的理想熒光親脂性陽離子探針。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物（J-aggregates），可產(chǎn)生紅色熒光（590 nm）；膜電位低于120 mV時(shí)，JC-1為單體，發(fā)出綠光（540 nm）。常用紅、綠熒光的相對(duì)比例來衡量線粒體去極化的比例。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變，可輕易檢測(cè)到細(xì)胞膜電位的下降；同時(shí)，也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變，作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)。該方法靈敏度高，重復(fù)性好，實(shí)際觀察時(shí)以常規(guī)觀察紅色熒光和綠色熒光的設(shè)置即可。Debnath等[10]采用JC-1來檢驗(yàn)chitosan水凝膠里培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞的增殖分化潛力和活性。

2.4 溴-脫氧尿嘧啶摻入法（BrdU incorporation assay）

5′-溴-脫氧尿嘧啶（5′-bromo-deoxyuridine，BrdU）與胸腺嘧啶結(jié)構(gòu)相似，其特點(diǎn)是胸腺嘧啶Ⅲ期嘧啶環(huán)與5位C連結(jié)的甲基被Br代替，在DNA合成過程中能與胸腺嘧啶一樣摻入其中，固定通透后，通過檢測(cè)BrdU標(biāo)記的細(xì)胞能定性、定量地反應(yīng)細(xì)胞的增殖狀態(tài)。Liang等[11]報(bào)道，進(jìn)行增殖能力試驗(yàn)時(shí)，由于BrdU可從大量活的但不增殖（如在G0期）的細(xì)胞中選擇性地測(cè)定增殖細(xì)胞，因此靈敏度比只能測(cè)活細(xì)胞總數(shù)增加的MTT法高，但如果是測(cè)活性，用MTT法更合適。有些藥物會(huì)抑制DNA合成，而使BrdU檢測(cè)增殖能力產(chǎn)生增殖細(xì)胞數(shù)減少和DNA抑制的雙重影響，從而產(chǎn)生部分假陽性。

3 細(xì)胞酶檢測(cè)

3.1 乳酸脫氫酶（LDH）釋放法

LDH正常時(shí)不能通過細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，可釋放到細(xì)胞外，使培養(yǎng)基內(nèi)乳酸脫氫酶濃度增高。因此，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性與細(xì)胞死亡數(shù)目成正比，用比色法測(cè)定并與靶細(xì)胞對(duì)照孔LDH活性比較，可計(jì)算效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率，也可以計(jì)算細(xì)胞生存率。本法操作簡便快捷、靈敏度高，敏感性、客觀性、實(shí)際成本及測(cè)定速度都高于化學(xué)染色法和MTT法，并且自然釋放率低[12]。但是，培養(yǎng)基、pH值、溫度及底物顯色劑和終止劑等，都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，實(shí)際操作很難掌握[13]。

3.2 甘油-3-磷酸脫氫酶的同工酶檢測(cè)（GAPDH）

利用合成的兒茶酚胺（異丙腎上腺素）可激活β-腎上腺素受體。這一過程可激活腺苷酸環(huán)化酶，將ATP轉(zhuǎn)換為cAMP。之后，cAMP通過激素敏感性脂肪酶，激活三酸甘油酯的水解過程，脂解作用可通過測(cè)定吸收峰在570 nm處的比色產(chǎn)物而確定，該吸收量與所含的甘油量成正比。Ferguson等[14]應(yīng)用此法，檢測(cè)通過LipiVage system取得的自體脂肪標(biāo)本的細(xì)胞內(nèi)酶活性。雖然這是一種具有脂肪特異性的檢測(cè)法，但從受損細(xì)胞分離出來的細(xì)胞外G3PDH也能被檢測(cè)到，進(jìn)而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 細(xì)胞凋亡標(biāo)記物檢測(cè)

4.1 FITC Annexin V

在死細(xì)胞里，細(xì)胞膜phospholi822pid phosphatidylserine（PS）是從內(nèi)側(cè)細(xì)胞質(zhì)到外側(cè)細(xì)胞質(zhì)分離出來的。Annexin V是Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與PS密切相關(guān)，能和細(xì)胞膜PS結(jié)合；包含F(xiàn)ITC的Annexin V能和熒光素結(jié)合。FITC Annexin V和PS密切相關(guān)，能和熒光素結(jié)合，從而可以把有利證據(jù)提供給流式細(xì)胞檢測(cè)分析。比如，活細(xì)胞對(duì)FITC Annexin V和PI均陰性，晚期凋亡細(xì)胞對(duì)FITC Annexin V和PI均陽性。Charles-de-Sá L等[15]應(yīng)用此法，檢測(cè)抽脂時(shí)負(fù)壓大小、儀器種類、噴嘴直徑對(duì)脂肪細(xì)胞活性的影響，但其結(jié)果無明顯差異。正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜是完整的。Propidium iodide（PI）在凋亡晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞中能夠透過細(xì)胞膜與細(xì)胞核結(jié)合呈現(xiàn)紅色，因此將Annexin V與PI聯(lián)合使用，可以同時(shí)檢測(cè)活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。此法靈敏度高、重復(fù)性好、使用方便，但只適用于實(shí)驗(yàn)，不適用于臨床檢測(cè)。細(xì)胞類型、細(xì)胞膜上PS的密度、發(fā)生凋亡時(shí)PS翻轉(zhuǎn)的比例、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法、所用試劑、誘導(dǎo)凋亡的時(shí)間等，都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，難以掌握并實(shí)際運(yùn)用。

綜上所述，多種檢測(cè)技術(shù)的相繼出現(xiàn)，彌補(bǔ)了舊方法的缺點(diǎn)，提高了檢測(cè)結(jié)果。但準(zhǔn)確度、靈敏度、費(fèi)用或技術(shù)難度等，還是存在種種問題。相信隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)和相關(guān)學(xué)科的不斷進(jìn)步，將會(huì)有更經(jīng)濟(jì)、有效的檢測(cè)方法出現(xiàn)，從而解決上述問題。

[1]Illouz YG.The fat cell graft:a new technique to fill depressions [J].Plast Reconstr Surg,1986,78(1):122-123.

[2]Hwang SM,Lee JS,Kim HD,et al.Comparison of the viability of cryopreserved fat tissue in accordance with the thawing temperature [J].Arch Plast Surg,2015,42(2):143-149.

[3]Son D,Choi T,Yeo H,et al.The effect of centrifugation condition on mature adipocytes and adipose stem cell viability[J].Ann Plast Surg,2014,72(5):589-593.

[4]Boyd V,Cholewa OM,Papas KK.Limitations in the use of fluorescein diacetate/propidium iodide(FDA/PI)and cell permeable nucleic acid stains for viability measurements of isolated islets of langerhans[J].Curr Trends Biotechnol Pharm,2008,2(2):66-84.

[5]Kilroy G,Burk DH,Floyd ZE.High efficiency lipid-based siRNA transfection of adipocytes in suspension[J].PLoS One,2009,4(9): e6940.

[6]Tai YT,Dillon M,Song W,et al.Anti-CS1 humanized monoclonal antibody HuLuc63 inhibits myeloma cell adhesion and induces antibody-dependent cellular cytotoxicity in the bone marrow milieu[J].Blood,2008,112(4):1329-1337.

[7]徐沖,何金汗,徐國恒.脂滴包被蛋白(perilipin)調(diào)控脂肪分解[J].生理科學(xué)進(jìn)展,2006,37(3):221-224.

[8]Kato H,Mineda K,Eto H,et al.Degeneration,regeneration,and cicatrization after fat grafting:dynamic total tissue remodeling during the first 3 months[J].Plast Reconstr Surg,2014,133(3): 303e-313e.

[9]盛大平,徐元宏.AlamarBlue在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué)(臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)),2005,26(6):367-368.

[10]Debnath T,Ghosh S,Potlapuvu US,et al.Proliferation and differentiation potential of human adipose-derived stem cells grown on chitosan hydrogel[J].PLoS One,2015,10(3):e0120803.

[11]Liang WC,Wang Y,Wan DC,et al.Characterization of miR-210 in 3T3-L1 adipogenesis[J].J Cell Biochem,2013,114(12):2699-2707.

[12]張蕾,李秋芳,張士新.LDH釋放法檢測(cè)腫瘤患者PBMC和CIK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2008,23(6):27-29.

[13]盧虹,吳興中.酸性酸酶法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2001,24(2):84-86.

[14]Ferguson RE,Cui X,Fink BF,et al.The viability of autologous fat grafts harvested with the LipiVage system:a comparative study[J].Ann Plast Surg,2008,60(5):594-597.

[15]Charles-de-Sá L,Gontijo de Amorim NF,Dantas D,et al.Influence of negative pressure on the viability of adipocytes and mesenchymal stem cell,considering the device method used to harvest fat tissue[J].Aesthet Surg J,2015,35(3):334-344.

Research Progress of Lipocyte Viability Assay

BAE Jinhong,LI Qingfeng.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China. Corresponding author:LI Qingfeng(E-mail:dr.liqingfeng@yahoo.com).

Lipocyte viability;Assay;Specificity

R622

B

1673－0364（2016）06－0388－03

2016年7月15日；

2016年8月25日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.06.017

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

李青峰（E-mail：dr.liqingfeng@yahoo.com）。

【Summary】Lipocyte viability assay is the standard for judgment of lipocyte's viability in vitro.It not only involves normal cell viability assay but also includes lipocyte-specific assessment.In this article,the principle,advantages,disadvantages and related applications of lipocyte viability assay were reviewed.