馬丹,楊柏云

(南昌大學 生命科學學院,江西 南昌 330031)

白芨種子無菌萌發(fā)研究

馬丹,楊柏云

(南昌大學 生命科學學院,江西 南昌 330031)

摘要：為探討白芨(Bletilla striata (Thunb.) Teichb.f.)種子無菌萌發(fā)適宜條件,采用TTC法染色測定了種子活力,MS培養(yǎng)基添加不同生長劑以及蝸牛酶處理進行了白芨種子萌發(fā)實驗。結果表明:4 ℃低溫保存白芨種子可使其在較長時間種子活力在93.0%以上;在培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃,光照強度1 000 lx,光照時間12 h/d,以MS+0.03 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+0.5%活性炭為生長調節(jié)劑萌發(fā)培養(yǎng)基最為適宜,種子萌發(fā)率可達91.6%;采用水浴25 ℃ 處理40 min,酶濃度為3% 蝸牛酶處理后種子萌發(fā)率最高,萌發(fā)率為93.4%。

關鍵詞：白芨;無菌萌發(fā);種子活力;生長調節(jié)劑;蝸牛酶

收稿日期：2015-07-06

作者簡介：馬丹(1990—)，女，江西南昌人,南昌大學生命科學學院碩士研究生。

通訊作者：楊柏云(1963—),男,江西南昌人,碩士生導師,教授,主要從事園林植物生物技術的研究工作。

中圖分類號：S567.2

文獻標識碼：B

文章編號：編號：1674-9944(2015)09-0078-04

1引言

白芨(Bletillastriata(Thunb.) Teichb.f.)為蘭科(Orchidaceae)白芨屬(Bletilla)多年生草本植物[1],其塊莖為我國傳統(tǒng)中藥,具有收斂止血、消腫生肌等功效,常用于治療咳血吐血、瘡瘍腫毒等疾病[2]。白芨種子細小、種皮為單層細胞組成,胚不分化,無胚乳,在野生條件下很難萌發(fā)[3]。目前由于人工無節(jié)制采挖導致白芨野生資源緊缺,已被國家列為珍稀瀕危植物。白芨蒴果包含上萬粒種子,利用組織培養(yǎng)技術對白芨進行無菌萌發(fā),可以提高其萌發(fā)率,得到大量組培苗,是解決傳統(tǒng)分株繁殖效率低的重要手段。為進一步優(yōu)化白芨種子萌發(fā),本研究探討不同培養(yǎng)條件對白芨種子萌發(fā)的影響,為其組織培養(yǎng)快速繁殖提供理論依據。

2材料與方法

2.1　材料

實驗所用的白芨蒴果,由江西省植物資源重點實驗室提供。種齡約150 d,果實飽滿,無開裂,實驗材料帶回實驗室后存置于4 ℃的冰箱中儲藏,備用。

2.2　方法

2.2.1白芨蒴果消毒

將成熟的白芨蒴果刷洗干凈,自來水沖洗10 min~15 min后,用75%的乙醇浸泡7~8 min,再用0.1%的HgCl2浸泡滅菌8 min,在超凈工作臺上用無菌水反復沖洗干凈后,用無菌濾紙吸干水分,待用。

2.2.2不同貯藏時間對種子活力的影響

對剛采集的種子和4 ℃冰箱里保存有7 d、30 d、60 d的白芨蒴果經過消毒后,將白芨種子分別等量均勻的播撒在不同的培養(yǎng)皿內,編號A、B、C、D。加入適量的0.5% TTC溶液,以覆蓋種子為度,25 ℃黑暗條件下染色24 h,實驗重復3次。染色完成后,再用蒸餾水將種子沖洗3~5次,顯微鏡下觀察種子的染色情況。

2.2.3生長調節(jié)劑對白芨種子無菌萌發(fā)影響

以TDZ、NAA、6-BA為因素,將白芨種子均勻抖落散布培養(yǎng)基上(表1),隨即封口,做好標記。每瓶播種等量的種子,每組接種30瓶?；九囵B(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基+35 g/L蔗糖,固體培養(yǎng)基添加7 g/L瓊脂粉和0.5 g/L 活性炭,pH為5.6~5.8。同時,不添加NAA、6-BA和TDZ為對照組。先將培養(yǎng)基置于暗條件下培養(yǎng),種子萌發(fā)后再移至光照條件下,培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃,光照強度1 000 lx,光照時間12 h/d。每隔7d觀察各組染菌情況,記錄各種處理的萌發(fā)及生長情況(表1)。

表1　無菌萌發(fā)播種培養(yǎng)基

2.2.4蝸牛酶對白芨種子無菌萌發(fā)的影響

將蝸牛酶配成質量濃度1%、3%、6%的溶液,于0.45μm的微孔有機薄膜過濾除菌,以蝸牛酶濃度、水浴時間、水浴溫度設為3個因素,在3水平下進行正交實驗,每組播種30瓶,培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+35 g/L蔗糖,培養(yǎng)條件同1.2.3,每隔7 d檢查其污染情況,剔除染菌的培養(yǎng)瓶,記錄各種處理的萌發(fā)及生長情況。每隔10 d在超凈操作臺上隨機選取10瓶,計錄種子萌發(fā)率(表2)。

2.3　數(shù)據分析

用SPSS統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據進行分析。

表2　蝸牛酶對無菌種子萌發(fā)的影響

3結果與分析

3.1　不同貯藏時間對種子活力的影響

種子生活力是指種子發(fā)芽的潛在能力或種胚具有的生命力。白芨種子活力與被染的顏色的深度成正比。由圖1可知,7 d時白芨種子的胚染色呈深紅色,有強的活力;30 d時白芨種子的胚染色呈鮮紅色,有較強的活力;60 d時白芨種子的胚染色呈粉紅色,有活力。對種子活力圖極性顏色對比分析,種子活力隨著儲存天數(shù)的增加,種子活力在不斷降低,但白芨種子活力均在93.0%以上。7 d、30 d、60 d種子活力分別是是95.2%、94.3%、93.5%。由此可知,在本研究中,貯藏在4 ℃的冰箱里使用的白芨種子均有較強的活性。

圖1　白芨種子TTC染色圖

3.2　生長調節(jié)劑對白芨種子無菌萌發(fā)的影響

由表3可知,白芨種子培養(yǎng)50 d后,TDZ、NAA和6-BA三種生長調節(jié)劑均明顯地提高了白芨種子的萌發(fā)率。不同濃度激素處理的白芨種子萌發(fā)啟動快慢影響不大,相差最多10 d。NAA、TDZ和6-BA三種生長調節(jié)劑對白芨的萌發(fā)具有促進的作用5、6、8、3號培養(yǎng)基萌發(fā)率提高了69.3%、57%、49.9%、47.3%,促進效果最佳的是MS+0.03 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA。

表3　生長調節(jié)劑對白芨種子無菌萌發(fā)的影響

2.3　蝸牛酶對白芨種子無菌萌發(fā)的影響

種子初始萌發(fā)時間是反應種子萌發(fā)快慢的指標。由表4和5可知:相同培養(yǎng)條件下,蝸牛酶對白芨種子萌發(fā)影響有顯著差異。蝸牛酶在上述處理條件下均可提高白芨種子萌發(fā)率,而且能促進種子萌發(fā)時間縮短,生長整齊,為白芨組織快速繁殖提供原球莖,最適處理方法為:25 ℃,40 min,酶濃度3%。

表4　蝸牛酶對白芨無菌種子萌發(fā)的影響

表5　蝸牛酶處理及對照組下正交實驗觀察結果

4結語

種子活力是進行種子萌發(fā)試驗能否進行成功的關鍵因素。白芨自從采集后隨著貯藏時間延長,白芨種子的活力指數(shù)的線條呈逐漸下降的走勢,種子活力隨著貯藏時間的延長而緩慢降低。短時間內低溫保存均可使白芨種子保持較高活性,適宜播種。

生長調節(jié)劑促進蘭科種子萌發(fā)的研究早有研究也已被證明,生長調節(jié)劑對白芨種子萌發(fā)的影響的研究也有差別,這是由于使用外源植物激素可以打破種子休眠,在一定的激素濃度下可促進白芨種子的萌發(fā)率。而基本培養(yǎng)基中的活性炭的加入,主要起到吸附釋放出來的有害物質和凈化白芨生長微環(huán)境的作用,并且碳粉可以抑制萌發(fā)過程的褐化,可提高種子萌發(fā)率,降低污染率。

白芨種子的胚,貯藏營養(yǎng)物質很少,胚乳極度缺乏大量的碳水化合物、蛋白質和脂肪等營養(yǎng)物質。加之,

蘭科植物種子普遍存在種皮厚密、透性差或種皮存在抑制物等有關[4]。本試驗選擇蝸牛酶的原因是蝸牛酶通過酶解白芨種子的細胞壁,提高白芨種子萌發(fā)率。

采用4 ℃低溫保存白芨種子可使其在較長時間種子活力在93.0%以上;在培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃,光照強度1 000 lx,光照時間12 h/d下,考慮以MS+0.03 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+0.5%活性炭為生長調節(jié)劑萌發(fā)培養(yǎng)基最為適宜,種子萌發(fā)率可達91.6%,或采用水浴25 ℃,水浴時間為40 min,濃度為3% 蝸牛酶處理后種子萌發(fā)率最高,萌發(fā)率為93.4%。

參考文獻：

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:化學工業(yè)出版社,2009.

[2] 張燕,黎斌,李思鋒.不同培養(yǎng)基上白芨的種子萌發(fā)與幼苗形態(tài)發(fā)生[J].西北植物學報,2009(8):1584~1589.

[3] 葉靜,鄭曉君,管常東,等.白芨的無菌萌發(fā)與組織培養(yǎng)[J].云南大學學報:自然科學版,2010,32(1):422~425.

[4] 張建霞,付志惠,李洪林,等.白芨胚發(fā)育與種子萌發(fā)的關系[J].亞熱帶植物科學,2006,34(4):32~35.