隋建樞， 王化陸， 辛智海， 王 偉， 陳天青， 何慶才

（1.貴州省旱糧研究所， 貴陽(yáng)550006； 2.貴州大學(xué)生命科學(xué)院， 貴陽(yáng)550025；3.貴州省植保研究所， 貴陽(yáng)550006）

小麥葉銹?。↙eaf rust）是由小麥葉銹菌（Puccinia tirticina）引起的真菌病害，在我國(guó)各地均有發(fā)生，以西南及長(zhǎng)江流域的部分地區(qū)如貴州、江西等地發(fā)生較重，嚴(yán)重時(shí)可造成5%～15%甚至更大的產(chǎn)量損失［1］。近年來，華北、西北及東北各地小麥葉銹病也日趨嚴(yán)重。由于育種家的忽視，使得小麥抗葉銹病品種很少，因此部分地區(qū)的葉銹病有加重趨勢(shì)［2］。貴州氣候溫暖濕潤(rùn)，常年相對(duì)濕度在70%以上，并且隨著田間栽培環(huán)境的改變、全球性氣候變暖，使得小麥葉銹病呈逐年增加的趨勢(shì)，成為影響小麥穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的主要病害之一。選育和利用抗病品種是控制小麥葉銹病最經(jīng)濟(jì)、有效、且對(duì)環(huán)境安全的重要措施。

截止2010年，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)近100個(gè)抗葉銹病基因，其中72個(gè)被正式命名，67個(gè)被定位，39個(gè)抗病基因被標(biāo)記［3］。而我國(guó)小麥主要抗葉銹病基因有：Lr 1、Lr 3、Lr 3 bg、Lr 10、Lr 13、Lr 14 a、Lr 16、Lr 23、Lr 26、Lr 34和Lr 35，其次還有Lr 9、Lr 11、Lr 12、Lr1 9、Lr2 4和Lr3 8等［4］。通過抗葉 銹 性 表 現(xiàn) 與 分子標(biāo)記型的比較發(fā)現(xiàn)，用分子標(biāo)記對(duì)小麥基因組DNA所含抗葉銹基因的鑒定準(zhǔn)確率很高，準(zhǔn)確快速，是輔助選擇與準(zhǔn)確鑒定抗病基因的有效方法。魏新燕等［5］用與抗葉銹基因Lr35連鎖的STS和SCAR 2個(gè)標(biāo)記在F1、F2代植株中標(biāo)記進(jìn)行了分析，檢測(cè)出8個(gè)小麥品種含有Lr 35基因。

本研究利用Lr 26、Lr 34和Lr 38 3種抗葉銹病的特異性分子標(biāo)記，對(duì)122份小麥品種（系）的進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，以明確這些品種（系）的抗葉銹性，從而填補(bǔ)一些抗葉銹病品種（系）信息的空白，為西南地區(qū)小麥品種合理的推廣種植提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為貴州小麥抗葉銹育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的122份小麥材料均為貴州省旱糧研究所多年收集的育種材料（表2），其中包括本單位自育材料以及通過與全國(guó)各育種單位交流學(xué)習(xí)所得材料。

1.2 引物合成

根據(jù)已報(bào)道的標(biāo)記序列［6－8］（表1），由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 DNA的提取

待所有植株長(zhǎng)到5葉左右時(shí)，用2%CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）提取液提取基因組DNA，具體步驟參照徐如宏等［9］方法，并經(jīng)過改進(jìn)。取約0.2g葉片，放入2.0mL的Eppendorf管中經(jīng)過液氮冷凍后，用研磨棒快速研磨至細(xì)粉末，再加入1 000μL左右65℃預(yù) 熱 提 取 緩 沖 液 （CTAB 2%，Tris－HCl 100 mmol／L，NaCl 1.4mol／L，EDTA 20mmol／L，PVP 1%，β－巰基乙醇1%，pH＝8.0），充分混勻，65℃水浴40min，其間輕輕顛倒2～3次；取出冷卻至室溫，加等體積氯仿－異戊醇（24∶1）輕輕顛倒混勻10min，10 000 r／min離心10min；取出上清液加2倍體積的預(yù)冷（－20℃）無水乙醇沉淀DNA，其DNA用70%乙醇洗2～3次，干燥，用50μL去離子水溶解后保存在－20℃冰箱中備用。用NanoDrop 2 000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，用滅菌ddH2O將終濃度調(diào)至50ng／μL，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增檢測(cè)

反應(yīng)體系10μL，其中含有1×buffer（10mmol／L Tris－HCl，50μmol／L KCl），2.0mmol／L MgCl2，0.2 mmol／L dNTP，上下游引物各0.2μmol／L，50ng模板DNA，0.5UDNA Taq聚合酶。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性50s，54～65℃（退火溫度因引物而異）退火50s，72℃延伸1min，36個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lr 26STS標(biāo)記的特異性檢測(cè)

用引物IB－267對(duì)供試小麥材料進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果見圖1、表2。擴(kuò)增結(jié)果表明，122個(gè)小麥材料中有33個(gè)品種（系）：黔麥17（L 2）、矮豐66（L 14）、連麥2號(hào) （L 1 5）、駐0 2 6 3－5 4 1（L 2 4）、興 育9 8 2（L 3 0）、4TH.STEMRRSN 6095（L 35）、西農(nóng)538（L 45）、新麥06008（L 47）、貴紫1號(hào)（L 53）、安2011－2（L 54）、衡5229（L 57）、RWG10Q0159（L 59）、徐麥9169（L 61）、鄭麥0943（L 64）、云麥49（L 77）、徐農(nóng)0189（L 81）、中梁31（L 83）、中梁30（L 84）、滇麥1號(hào)（L 89）、鄭麥07 H 508（L 96）、洛麥34（L 98）、周麥26（L 99）、周麥27（L 100）、周麥28（L 101）、周麥30（L 102）、周麥32（L 103）、石 H 083－366（L 106）、石 B 11－4098－2（L 107）、濟(jì)麥31（L 108）、石矮2號(hào)（L 113）、中麥69（L 116）、中麥12（L 117）、中麥4044（L 118），可擴(kuò)增出1條210bp的Lr26特異性DNA條帶，與報(bào)道片段大小相同，而其它材料中未檢測(cè)到該條帶，初步判斷，這32個(gè)小麥品種（系）中含有Lr 26基因。

表1 用于抗葉銹基因鑒定的分子標(biāo)記

圖1 部分供試小麥材料Lr 26標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果

表2 供試122個(gè)小麥品種（系）的抗葉銹病分子檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表1

圖2 部分供試小麥材料Lr 34STS標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果

圖3 部分供試小麥材料Lr 38SCAR標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果

2.2 Lr 34STS標(biāo)記的特異性檢測(cè)

用引物csLV 34對(duì)供試小麥材料進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果見圖2、表2。在122份供試材料中能擴(kuò)增出150 bp特異性條帶的只有3個(gè)：矮豐66（L 14），興育982（L 30），Q 0159（L 59），因此，可以初步斷定這3個(gè)品種（系）中含有Lr 34基因。

2.3 Lr 38SCAR標(biāo)記的特異性檢測(cè)

用引物Y 38SCAR 982對(duì)供試小麥材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖3、表2。如圖3所示，擴(kuò)增得到一條片段大小約為982bp的特異性條帶，與報(bào)道片段大小相符。檢測(cè)到該特異性條帶的品種（系）有：黔麥17（L 2）、貴農(nóng) 21（L 8）、矮豐 66（L 14）、連麥 2 號(hào)（L 15）、駐0263－541（L 24）、興育982（L 30）、4TH.STEMRRSN 6095（L 35）、石06－6136（L 39）、西農(nóng)538（L 45）、新麥06008（L 47）、貴紫1號(hào)（L 53）、安2011－2（L 54）、衡 5229（L 57）、Q 0159（L 59）、徐 麥 9169（L 61）、鄭麥0943（L 64）、蘭天 26（L 69）、云麥 49（L 77）、徐農(nóng)0189（L 81）、中梁 31（L 83）、中梁 30（L 84）、滇麥1號(hào)（L 89）、綿12Z63（L 91）、鄭麥07H 508（L 96）、洛麥34（L 98）、周麥26（L 99）、周麥27（L 100）、周麥28（L 101）、周麥30（L 102）、周麥32（L 103）、石 H 083－366（L 106）、石 B 11－4098－2（L 107）、濟(jì)麥31（L 108）、石矮2號(hào)（L 113）、中作硬桿（L 114）、中 H 4058（L 115）、中麥69（L 116），共37個(gè)品種可能含有Lr 38基因。

3 討論與結(jié)論

本研究初步明確了122個(gè)小麥品種（系）中，3種抗葉銹病基因情況，供試的122份小麥材料中，檢測(cè)到含有抗葉銹病基因的品種（系）有37個(gè)，其中含有Lr 26的有33個(gè)，含有Lr 34的有3個(gè)，含有Lr 38的有37個(gè)；同時(shí)含有Lr 26和Lr 38的有30個(gè)，同時(shí)含有Lr 26、Lr 34和Lr 38的有3個(gè)。

含有Lr 26的1B／1R品種在20世紀(jì)60年代末至70年代初作為育種材料引進(jìn)，是垂直抗病性基因，到20世紀(jì)80年代具有該血緣的品種逐漸成為我國(guó)小麥的主體品種［10］，但是隨后新致病小種的出現(xiàn)使得其含有的抗葉銹基因Lr 26失效，導(dǎo)致其后代品種抗性水品下降甚至喪失。該抗性基因單獨(dú)存在時(shí)已經(jīng)基本失效，但與其它基因組合運(yùn)用，仍具有一定的抗病價(jià)值。Lr 34是目前我國(guó)小麥中最重要的抗葉銹病基因之一［4］，是一個(gè)典型的慢銹基因，有研究表明，Lr 34在我國(guó)農(nóng)家品種中出現(xiàn)的頻率很高［11］，而在本研究的供試小麥材料中檢測(cè)到該基因的頻率很低，說明該抗病基因沒有被很好的運(yùn)用。Lr 34單獨(dú)應(yīng)用時(shí)仍有一定程度發(fā)病［12］，但與其它抗病基因同時(shí)運(yùn)用時(shí)，可明顯提高其它抗病基因的有效性。Lr 38是一個(gè)抗性很強(qiáng)的抗葉銹基因，具有全生育期抗病性，目前我國(guó)對(duì)其有毒力的致病類型很少，具有較高的利用價(jià)值。

利用分子標(biāo)記可以快速檢測(cè)出供試材料中所含的抗葉銹病基因類型，在小麥抗病育種方面，可利用分子輔助選擇的優(yōu)勢(shì)，克服常規(guī)雜交育種抗病基因的單一化，聚合多個(gè)抗葉銹基因，從而大大提高小麥品種抗病的廣譜性和持久性。

［1］Komer J A.Genetics of resistance to wheat leaf rust［J］.Annual Review of Phytopathol，1996，34：435－455.

［2］陳利鋒，徐敬友.農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)［M］.中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2007：146－147.

［3］McIntosh R A，Dubcovsky V，Roger W J，et al.Catalogue of gene symbols for wheat：2010supplement［J／OL］.http：／／www.shigen.nig.ac.jp／wheat／komugi／genes／macgene／supplement 2010.pdf，2011－04－19.

［4］袁軍海，陳萬權(quán).中國(guó)小麥抗葉銹病基因的有效性評(píng)價(jià)［J］.麥類作物學(xué)報(bào)，2011，31（05）：994－1 000.

［5］魏新燕，楊文香，劉大群，等.150個(gè)小麥品種（系）抗葉銹基因Lr 35分子檢測(cè)［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（12）：1 951－1 954.

［6］Mago R，Spielmeyer W，Lawrence J，et al.Identification and mapping of molecular markers linked to rust resistance genes located on chromosome 1RS of rye using wheat－rye translocation lines［J］.Theoretical and Applied Genetics，2002，104（8）：1 317－1 324.

［7］Lagudah E，Mc Fadden H，Singh R，et al.Molecular genetic characterization of the Lr 34／Yr 18slow rusting resistance gene region in wheat［J］.Theoretical and Applied Genetics，2006，114（1）：21－30.

［8］Yan H－F，Yang W－X，Chu D，et al.A new marker tagged to the leaf rust resistance gene Lr 38［J］.Scientia Agricultura Sinica，2008，41（11）：3 604－3 609.

［9］徐如宏，任明見，思彬彬，等.貴農(nóng)001中抗白粉病基因的RAPD標(biāo)記研究［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2005，24（4）：283－286.

［10］郝晨陽(yáng)，王蘭芬，張學(xué)勇，等.我國(guó)育成小麥品種的遺傳多樣性演變［J］.中國(guó)科學(xué)（C輯），2005，35（5）：408－415.

［11］楊文雄，楊芳萍，梁丹，等.中國(guó)小麥育成品種和農(nóng)家品種中慢銹基因Lr34／Yr8的分子檢測(cè)［J］.作物學(xué)報(bào)，2008，34（7）：1 109－1 113.

［12］陳萬權(quán)，秦慶明.國(guó)際上已知小麥抗葉銹病基因在中國(guó)的可利用性研究［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35（7）：794－801.