薛 蕊 安 皓 劉清華 肖志忠 王彥豐 李 軍①

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所 中國科學(xué)院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京100049; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266237)

魚類染色體及其核型研究是魚類細(xì)胞遺傳學(xué)的重要組成部分之一, 對研究魚類變異、分類、系統(tǒng)演化、性別決定、雜交育種以及對環(huán)境污染的監(jiān)測等方面具有重要意義(樓允東, 1997)。我國在 20世紀(jì) 70年代才開始對魚類染色體核型進(jìn)行較為詳盡的研究,80年代后期隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展, 海水魚類核型相關(guān)研究領(lǐng)域才得到重視(趙金良, 2000)。

斑石鯛(Oplegnathus punctatus), 俗稱斑鯛、花金鼓、黑金鼓等, 隸屬鱸形目(Perciformes), 石鯛科(Oplegnathidae), 石鯛屬(Oplegnathus), 主要分布于朝鮮、日本、中國臺灣以及南海、東海、黃海等海域(孟慶聞等, 1995)。斑石鯛體態(tài)優(yōu)美, 肉質(zhì)細(xì)膩, 素有“刺身絕品”之稱, 具有很高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。對斑石鯛的報(bào)道目前主要集中在早期發(fā)育(Park et al,2015)、成魚養(yǎng)殖(The Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, 2015)、雜交育種(Kwun et al, 2010)、以及疾病和免疫(Yanagida et al, 2008; Dong et al, 2010; Shuang et al,2013)等方面, 有關(guān)斑石鯛細(xì)胞遺傳學(xué)方面的研究目前尚未見報(bào)道。本文對斑石鯛雌、雄魚染色體核型以及核仁組織者進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究, 旨在為進(jìn)一步開展斑石鯛遺傳育種等工作奠定基礎(chǔ), 并為鱸形目魚類細(xì)胞遺傳學(xué)研究提供更多資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用斑石鯛取自煙臺市明波水產(chǎn)有限公司,為 15月齡幼魚, 共計(jì) 9尾實(shí)驗(yàn)魚, 體重為 246.2—398.6g, 體長為 22.8—24.6cm。解剖實(shí)驗(yàn)魚性腺制作石蠟切片并染色, 根據(jù)顯微觀察結(jié)果判定雌雄。

1.2 染色體標(biāo)本的制備

采用林義浩(林義浩, 1982)的方法并稍作修改:在室溫下按 8—10μg/g的劑量于實(shí)驗(yàn)魚胸鰭基部注射PHA(Solarbio, 北京), 20h后于胸鰭基部注射秋水仙堿(Solarbio, 北京)劑量為 2.5—5μg/g。過 4h用丁香油水門汀麻醉并斷尾放血 30min, 之后解剖取頭腎, 0.8%生理鹽水沖洗后用鑷子反復(fù)撕拉使其細(xì)胞游離, 350目尼龍篩絹過濾收集獲得細(xì)胞懸液, 在4°C下于 0.075 mol/L KCl溶液中低滲處理 30min,經(jīng)1000r/m離心10min后去上清, 經(jīng)1次預(yù)固定處理后, 用卡諾氏固定液(甲醇 : 冰醋酸 = 3 : 1, V : V)在–20°C下進(jìn)行3次固定處理, 每次30min, 之后采用冷片法滴片并空氣干燥過夜。過夜干燥后的染色體玻片用10% Giemsa染液染色40min, 蒸餾水沖洗后自然干燥。

1.3 核型分析

雌、雄魚各選取50個(gè)染色體中期分裂相進(jìn)行染色體計(jì)數(shù), 并選出 10個(gè)數(shù)目完整且分散良好的中期分裂相, 用 Nikon-ES-100及Nikon-DS-Fi1顯微拍照系統(tǒng)拍照、放大和測量, 統(tǒng)計(jì)染色體實(shí)際長度、相對長度以及臂比等數(shù)據(jù), 利用Photoshop CS3截取核型圖, 染色體的類型按照 Levan等(1964)的標(biāo)準(zhǔn)確定。染色體實(shí)際長度根據(jù)與拍照時(shí)的標(biāo)志物長度比對獲得, 染色體相對長度計(jì)算公式為: 染色體相對長度=(單條染色體實(shí)際長度/染色體組實(shí)際長度總和)×100%, 染色體臂比是指單條染色體長臂與短臂之比。

1.4 染色體Ag-NORs及帶型分析

采用Howell等(1980)的快速銀染法制片, 向每個(gè)樣片上滴加2滴2%的明膠溶液和4滴50%的AgNO3溶液, 蓋上蓋玻片后放到 65°C的水浴鍋鍋蓋上1—2min, 待整張片子呈棕褐色時(shí)去掉蓋玻片并迅速用流水沖洗, 自然干燥后鏡檢。

顯微鏡觀察并記錄 100個(gè)間期細(xì)胞的 Ag-NORs個(gè)數(shù), 選取 10個(gè)染色體數(shù)目完整且分散良好的中期分裂相, 用Nikon-ES-100及 Nikon-DS-Fi1顯微拍照系統(tǒng)拍照、放大和測量, 確定 Ag-NORs個(gè)數(shù)、位置及大小, 并用Photoshop CS3經(jīng)剪貼、重排等操作獲取Ag-NORs帶型圖, 并利用Excel 2007繪制模式圖。

2 結(jié)果

2.1 斑石鯛核型分析

我們首先通過石蠟切片的方法對實(shí)驗(yàn)魚的性別進(jìn)行了鑒定, 在9尾斑石鯛中雄魚4尾, 雌魚5尾。對分散良好的斑石鯛雌、雄魚中期分裂相觀察顯示,雄性斑石鯛具有一條體型巨大的特異的中部著絲粒染色體(圖 1a), 可視為雄性斑石鯛的異形性染色體,而雌性斑石鯛不具有這種異形染色體(圖1b), 雌、雄魚均未發(fā)現(xiàn)次縊痕和隨體的存在。

圖1 斑石鯛雄魚(上)和雌魚(下)染色體中期分裂相及其核型Fig.1 The metaphase chromosomes and karyotype of O. punctatus圖a中箭頭所指為斑石鯛雄魚異形染色體

挑選斑石鯛雌、雄魚各50個(gè)分散良好的中期分裂相進(jìn)行計(jì)數(shù), 統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表 1。雄性斑石鯛中期分裂相染色體眾數(shù)為47, 占所觀察分裂相的66%, 核型為2n=47, 1m+2sm+44t, NF=50; 雌性斑石鯛染色體眾數(shù)為 48, 比例占到 68%, 核型為 2n=48, 2sm+46t,NF=50。

表1 斑石鯛雌、雄魚染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.1 Chromosome number of both sexes in O. punctatus

2.2 斑石鯛染色體相對長度分析

對選取的雌、雄魚各10個(gè)分散良好、數(shù)目完整的分裂相進(jìn)行拍照、放大和測量, 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。雄性斑石鯛具有 1條巨大的異形染色體、1對亞中部著絲粒染色體以及 22對端部著絲粒染色體; 雌性斑石鯛具有1對亞中部著絲粒染色體和23對端部著絲粒染色體。雄性斑石鯛染色體實(shí)際長度最長為(2.55±0.21)μm, 最短為(0.56±0.08)μm; 而雌性斑石鯛染 色 體 實(shí) 際 長 度 范 圍 在 (0.59±0.09)μm 與 (1.75±0.11)μm 之間。雄性斑石鯛異形染色體相對長度為(10.33±0.86), 最小染色體的相對長度是(2.28±0.30),異形染色體相對長度達(dá)到其它染色體的 2—5倍, 只有1條, 沒有其它染色體與之配對; 雌性斑石鯛染色體相對長度最大為(6.87±0.42), 最小為(2.30±0.37)。

2.3 斑石鯛Ag-NORs帶型分析

顯微觀察100個(gè)斑石鯛雌、雄魚中期分裂相, 發(fā)現(xiàn)其中具有Ag-NORs位點(diǎn)的占73%。Ag-NORs位點(diǎn)的數(shù)目在不同分裂相中呈現(xiàn)多態(tài)性, 為 1—2個(gè), 其中具有 2個(gè) Ag-NORs的分裂相比例高達(dá) 72.6%, 其Ag-NORs皆位于1對sm染色體短臂端部, 呈短棒狀;在具有1個(gè)Ag-NORs的分裂相中, Ag-NORs皆位于其中一條sm染色體短臂上(見表3)。

表2 斑石鯛中期染色體實(shí)際長度與相對長度Tab.2 Actual length and relative length of metaphase chromosome in O. punctatus

斑石鯛間期細(xì)胞核中銀染核仁的數(shù)目同樣呈現(xiàn)多態(tài)性, 其數(shù)目為1—3個(gè), 其中含有2個(gè)核仁的間期細(xì)胞核出現(xiàn)頻率最高, 為60%, 含有1個(gè)和3個(gè)核仁的細(xì)胞核比例分別為27%和13%, 并且核仁的大小與數(shù)目呈反比(見圖2和表3)。

因此確定斑石鯛 Ag-NORs數(shù)目為 2 , 位于 1對 sm 染色體短臂上, 為端部 Ag-NORs, 斑石鯛Ag-NORs分裂相及其核型見圖3, 測量計(jì)算銀染部位長度并繪制模式圖見圖4。

圖2 斑石鯛間期細(xì)胞核Ag-NORsFig.2 The Ag-NORs in nucleus of O. punctatus

表3 斑石鯛Ag-NORs情況統(tǒng)計(jì)Tab.3 Summary of Ag-NORs in O. punctatus

圖3 斑石鯛雄魚(上)和雌魚(下)Ag-NORs分裂相及其核型Fig.3 The Ag-NORs metaphase chromosomes and karyotype of O. punctatus箭頭所指為Ag-NORs位置

圖4 斑石鯛雄魚(左)和雌魚(右)Ag-NORs模式圖Fig.4 Schema of Ag-NORs in O. punctatus

3 討論

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì), 截至 2006 年, 我國已進(jìn)行核型研究的海水魚類僅有 77 種, 其中以鱸形目魚類研究最多(卓孝磊等, 2007)。在已進(jìn)行研究的鱸形目魚類中, 絕大多數(shù)魚類的染色體數(shù)目為 2n=48, 且不同種鱸形目魚類的核型公式呈現(xiàn)多樣性, 中部、端部、亞中部以及亞端部著絲粒染色體皆有出現(xiàn), 但極少有雌、雄魚核型相異以及異形性染色體的報(bào)道。本研究的斑石鯛是鱸形目石鯛科石鯛屬的一種魚類, 雌、雄魚核型相異, 其核型公式為雄性 2n=47,1m+2sm+44t, NF=50; 雌性 2n=48, 2sm+46t, NF=50,且雄魚具有一條巨大的中部著絲粒異形性染色體,屬于雄性配子異形, 可能是性染色體Y。

本研究中斑石鯛除異形性染色體外, 雌、雄魚染色體的相對長度分別在 (2.30±0.37) — (6.87±0.42)和(2.28±0.30) — (6.64±0.62)之間, 染色體相對長度明顯偏小, 這是因?yàn)轸~類在脊椎動(dòng)物分類系統(tǒng)中處于較低位態(tài), 所以染色體數(shù)目多且小(卓孝磊等, 2007)。小島吉雄(1979)在研究染色體時(shí)對真骨魚類進(jìn)行了劃分, 提出了3個(gè)演化類群分別為低位類、中位類和高位類, 同時(shí)李樹深(1981)認(rèn)為, 在特定的分類階元中,根據(jù)染色體臂數(shù)以及端部著絲粒染色體個(gè)數(shù)的多寡,可以將其分為原始類群、較特化類群以及特化類群。本研究中斑石鯛雌魚染色體數(shù)目為 2n=48, 大多數(shù)是端部著絲粒染色體, 染色體臂數(shù)少, 因此在不考慮斑石鯛雄性異形染色體的情況下, 可認(rèn)為其在魚類演化系統(tǒng)中屬于高位類, 是較特化類群。此外, 一般認(rèn)為鱸形目魚類中原始類群的核型為2n=48t, NF=48(徐冬冬等, 2012), 其它特化類群的核型是通過羅伯遜易位及其它染色體結(jié)構(gòu)重排方式形成的(趙金良, 2000)。本研究中斑石鯛雌、雄魚2n=48保持不變, 而NF=50,即染色體臂數(shù)比原始類群有所增加, 因此推測是通過除羅伯遜易位之外的染色體重排方式形成的(卓孝磊等, 2007)。本研究中斑石鯛雌、雄魚染色體個(gè)數(shù)與其同屬近緣種條石鯛(Oplegnathus fasciatus)一致, 但條石鯛中含有一對中部著絲粒染色體(徐冬冬等,2012), 而在斑石鯛相對應(yīng)的是一對亞中部著絲粒染色體, 這種細(xì)微差別有可能來源于實(shí)驗(yàn)手段差異或者顯微測量造成的誤差, 但更大的可能性是來源于這兩個(gè)近緣物種在進(jìn)化時(shí)間以及染色體結(jié)構(gòu)重排程度等方面的差異。

在已考察核型的魚類中, 具有異形性染色體的種類不足 10%(常重杰等, 2002), 但其性別決定類型卻非常復(fù)雜, 幾乎囊括了已知脊椎動(dòng)物的所有類型(Graves et al, 2010), 包括 XX/XY型、ZW/ZZ型、Z0/ZZ型、XX/X0型、X1X1X2X2/X1X2Y型以及常染色體決定型等6個(gè)類別, 其中以XX/XY型和ZW/ZZ型最為常見, 而X1X1X2X2/X1X2Y型僅在魚類中有報(bào)道(Graves et al, 2010)。目前我國國內(nèi)已報(bào)道的具有異形性染色體的海水魚類僅有5種, 分 別是斑尾復(fù) 鰕 虎魚(Synechogobius ommaturus) (王金星等, 1994)、斑頭魚(Agrammus agrammus) (鄭家聲等, 1997)、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis) (周麗青等, 2005)、條石鯛(Oplegnathus fasciatus) (徐冬冬等, 2012; Xu et al,2013)以及尖吻(Rhynchopelates oxyrhynchus) (舒琥等, 2013)。國外學(xué)者則對魚類性別染色體研究得更為深入, Kitano等(2009)發(fā)現(xiàn)日本海三刺魚(Gasterosteus aculeatus)群體的雌魚2n=42, 雄魚2n=41且具有一條巨大的異形性染色體, 常染色體和性染色體基因的熒光原位雜交顯示異形性染色體Y來源于X1X2的融合, 其染色體的性別決定類型為X1X1X2X2/X1X2Y型,認(rèn)為這種區(qū)別于太平洋群體的性別決定機(jī)制有可能與 150—200萬年前日本海地區(qū)地質(zhì)變化造成的地理隔離有關(guān)。此外, 本研究中報(bào)道的斑石鯛雌、雄魚核型與近緣物種條石鯛(徐冬冬等, 2012; Xu et al, 2013)的報(bào)道類似, 后者已通過 C-帶以及重復(fù)序列的熒光原位雜交試驗(yàn)證實(shí)Y染色體來源于X1X2的早期融合,確定其性別的染色體決定類型為 X1X1X2X2/X1X2Y型。本研究中斑石鯛雄性具有異形性染色體且染色體數(shù)目比雌性少一條, 基本符合X1X1X2X2/X1X2Y型特征, 因此可以初步推測其性別的染色體決定類型為X1X1X2X2/X1X2Y型, 但仍需要通過進(jìn)一步的細(xì)胞遺傳學(xué)手段來予以證實(shí)。

Ag-NORs是魚類較為成熟的顯帶技術(shù)之一, 其數(shù)目、形態(tài)以及分布情況是親緣關(guān)系和染色體進(jìn)化的指標(biāo)(卓孝磊等, 2007)。本研究發(fā)現(xiàn)斑石鯛雌、雄魚具有單對Ag-NORs, 符合脊椎動(dòng)物Ag-NORs的原始特征(Schmid, 1978)。另外, 斑石鯛雌、雄魚的單對Ag-NORs分別位于第1對和第2對亞中部著絲粒染色體的短臂末端, 呈短棒狀, 在其它鱸形目魚類的報(bào)道中, Ag-NORs位于近著絲?；蚨肆^(qū)域: Rocha等(2008)報(bào)道了6種笛鯛科魚類(Perciformes, Lutjanidae)的Ag-NORs, 其中5個(gè)物種的單對Ag-NORs位于1對長臂近著絲粒位置處, 而另一物種具有 2對Ag-NORs, 其中之一與上述位置一致, 另外1對則位于1對染色體的端粒位置處; Neto等(2011)報(bào)道了鱸形目石鱸科(Perciformes, Haemulidae)2種魚類的細(xì)胞遺傳學(xué)分析結(jié)果, 二者皆具有單對 Ag-NORs, 分別位于 1對染色體的近著絲粒區(qū)次縊痕處。Ag-NORs通常分布于染色體的次縊痕和隨體區(qū)域, 許多報(bào)道體現(xiàn)了次縊痕和核仁組織者的對應(yīng)關(guān)系(Neto et al,2011; 范瑞等, 2014)但是在本研究中 Ag-NORs位置并未發(fā)現(xiàn)次縊痕或隨體的存在, 楊坤等(2013)在對麥穗魚(Pseudorasbora parva)的研究中也有此類報(bào)道,后者推測其染色體上次縊痕的結(jié)構(gòu)可能已然存在,只是還沒進(jìn)化到從細(xì)胞學(xué)上可辨別的程度。此外, 本研究發(fā)現(xiàn)斑石鯛Ag-NORs有時(shí)只出現(xiàn)在同源染色體的一條上, 許多學(xué)者有類似報(bào)道(Caputo et al, 2001;范瑞等, 2014), 認(rèn)為這是染色體的活性異形現(xiàn)象, 其實(shí)質(zhì)是同源染色體上 rRNA基因轉(zhuǎn)錄活性存在差異(范瑞等, 2014)。

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