李 斌 陳亞男, 齊占會(huì) 白艷艷 徐 東 馬元慶 張 娟李煥軍① 孫 珊 何 鑫 張昀昌

(1. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 煙臺(tái) 264006; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海201306; 3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510300; 4. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071)

隨著工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展, 砷及其化合物的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致微量砷在水體、空氣及土壤中均有發(fā)現(xiàn); 因其較高毒性而被美國(guó)環(huán)保局(USEPA)列為水源地優(yōu)先控制污染物(Rahman et al, 2012)。砷是一種較常見且持久性的污染物, 在水體中的停留時(shí)間可達(dá) 50年

(Klein, 1975), 在海洋環(huán)境中的復(fù)雜生物地球化學(xué)過程決定了其理化形態(tài)、生物利用度和毒性效應(yīng)等

(Smedley et al, 2002; Karadjova et al, 2008)。人類活動(dòng)所產(chǎn)生的砷隨河流或降水入海, 海水中無機(jī)砷主要以五價(jià)砷酸鹽As(V)形式存在(趙艷芳等, 2009), 因此,As(V)在生態(tài)系統(tǒng)中的生物富集、轉(zhuǎn)化及其毒理效應(yīng)成為研究熱點(diǎn)。

海洋微藻作為海洋態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者, 對(duì)于許多毒物比魚類、甲殼類更為敏感, 在水污染生物監(jiān)測(cè)中具有十分重要的作用(Ma et al, 2002; 梁英等,2009)。砷對(duì)藻類的毒性作用也開展了相關(guān)研究, 已開展的研究主要集中在綠藻、藍(lán)藻等對(duì)砷的生物富集和轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)抑制和代謝機(jī)理等(洪華生等, 1991;Karadjova et al, 2008; 龔艷等, 2011; 樊香絨等, 2013),而對(duì)硅藻的相關(guān)研究則極少。牟氏角毛藻(Chaetoceros mulleri)屬小型海洋浮游硅藻, 是我國(guó)沿海許多港灣的優(yōu)勢(shì)硅藻種群, 也是對(duì)蝦和貝類等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物天然的優(yōu)質(zhì)餌料; 其對(duì)環(huán)境變化的快速響應(yīng)能力, 是研究海洋環(huán)境變化的重要生物指標(biāo)(王艷等,2010)。本文以牟氏角毛藻為試驗(yàn)材料, 研究了無機(jī)砷As(V)對(duì)其磷酸鹽吸收、葉綠素 a含量、生長(zhǎng)速率及其抗氧化活性等的影響, 初步探討了 As(V)對(duì)海洋浮游硅藻營(yíng)養(yǎng)鹽吸收、生長(zhǎng)生理及毒性作用, 以期為闡明As(V)對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖安全的影響及其海洋硅藻的生物生態(tài)效應(yīng)提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與材料

牟氏角毛藻(Chaetoceros mulleri)藻種由山東省海洋資源與環(huán)境研究院藻類種質(zhì)庫提供。在實(shí)驗(yàn)室用f/2培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng), 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期藻細(xì)胞進(jìn)行暴露試驗(yàn)。海水取自煙臺(tái)開發(fā)區(qū)自然海井水, 經(jīng)沉淀、0.45μm 濾膜過濾和煮沸消毒, 冷卻后備用。f/2培養(yǎng)液按照文獻(xiàn)方法(陳明耀, 1995)配制。As(V)貯存液為砷酸根溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW08667) [(0.233±0.005)μmol/g Na3AsO4), 購自中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

1.2 方法與步驟

1.2.1 培養(yǎng)方法和試驗(yàn)設(shè)計(jì) 培養(yǎng)液采用f/2營(yíng)養(yǎng)鹽配方, 在指數(shù)生長(zhǎng)期接種。暴露試驗(yàn)中, As(V)添加濃度梯度按等比間隔設(shè)為 0、6.0、12.0、24.0、48.0和120.0μg/L(分別記為Ctr和V1—V5, 其實(shí)測(cè)濃度分別為 0、7.3、10.2、23.9、45.2 和 114.0μg/L)。培養(yǎng)溫度(19.7±0.8)°C, 光照強(qiáng)度 3000 lx, 光暗周期12:12。每組實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè) 3個(gè)平行樣。用于微藻培養(yǎng)的5 L三角瓶預(yù)先用1 moL/L的鹽酸浸泡24h, 消毒海水沖洗干凈后待用。

分別在0、2、3、5、7、14和21d取樣, 測(cè)定水中磷酸鹽含量、藻細(xì)胞密度和葉綠素a含量, 并在2d時(shí)取藻細(xì)胞測(cè)定其GSH含量與谷胱甘肽還原酶活性,用于分析As(V)暴露對(duì)牟氏角毛藻營(yíng)養(yǎng)鹽吸收能力、生長(zhǎng)速度、光合作用及其抗氧化活性的影響。

1.2.2 測(cè)定方法 用Lugol碘液固定微藻樣品, 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù); 磷酸鹽(PO4-P)、葉綠素a (chl-a)含量測(cè)定均參照《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》(GB17378-2007)方法進(jìn)行; 還原型谷胱甘肽(GSH)含量測(cè)定按張宗申等(2001)的方法進(jìn)行測(cè)定, 以DTNB顯色, 在412nm波長(zhǎng)下檢測(cè); 谷胱甘肽還原酶(GR)活性測(cè)定參照 Foyer和 Halliwell的方法(Foyer et al, 1976)。利用日立U-2900型紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光值。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均為 3次重復(fù)的平均值, 采用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、回歸分析和差異顯著性分析(One-way ANOVA,Tukey)。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)牟氏角毛藻培養(yǎng)水體中磷酸鹽含量的影響

由表1可知, 第3天時(shí)對(duì)照組水體中磷酸鹽含量比 2d時(shí)顯著降低(P＜0.01), 之后 1周內(nèi)變化不明顯(P＞0.01); 第 14天時(shí), 比 7d時(shí)明顯減小(P＜0.01), 但至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)降低不顯著(P＞0.01)。而V2和V5組磷酸鹽含量變化與對(duì)照相似, 且隨時(shí)間降低的趨勢(shì)更明顯, 在2d時(shí)均顯著低于其初始值。表明, 在與適當(dāng)濃度 As(V)共存條件下, 會(huì)促進(jìn)牟氏角毛藻對(duì)磷酸鹽的吸收速度。而V1、V3和V4三組均在實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)磷酸鹽含量升高的現(xiàn)象, 且隨著 As(V)暴露濃度的升高出現(xiàn)的時(shí)間越晚, 三組分別在2、14和21d時(shí)顯著升高。各組水體中磷酸鹽含量與時(shí)間均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系, V5組相關(guān)系數(shù)和回歸方程的斜率最高, 而V3組均最低。表明, 試驗(yàn)條件下適當(dāng)濃度As(V)暴露會(huì)促進(jìn)牟氏角毛藻對(duì)磷酸鹽的吸收速度, 而較低暴露濃度時(shí)則反之。

2.2 對(duì)牟氏角毛藻細(xì)胞密度的影響

由圖 1可知, 未進(jìn)行 As(V)暴露處理時(shí), 第 1周牟氏角毛藻密度增加緩慢, 之后的兩周則增長(zhǎng)較快,21d時(shí)達(dá)到最高值63×104ind./mL, 明顯高于試驗(yàn)初始值(P＜0.01)。而所有暴露處理組在2d或3d時(shí)即顯著高于各初始值(P＜0.05), 藻細(xì)胞密度在 3—5d時(shí)均有所降低, 且降低的程度具有隨著 As(V)暴露濃度升高而增加的趨勢(shì)。整個(gè)試驗(yàn)期間, V2組藻細(xì)胞密度均高于其它組, 且14d時(shí)為最大值71×104ind./mL, 明顯高于其它組(P＜0.05)。表明, As(V)暴露初期牟氏角毛藻細(xì)胞分裂加快, 但隨之出現(xiàn)較大波動(dòng), 長(zhǎng)期高濃度暴露對(duì)藻細(xì)胞繁殖具有一定的抑制作用。

2.3 對(duì)牟氏角毛藻細(xì)胞中葉綠素a含量的影響

As(V)暴露條件下牟氏角毛藻細(xì)胞葉綠素a含量隨時(shí)間的變化分析表明, 2d時(shí)各組均顯著降低, 且均顯著低于對(duì)照(圖 2), 其中 V4組降低最明顯, 由114.13μg/108cell降至 23.64μg/108cell; 3 d 時(shí)僅 V2、V4組較之前明顯升高(P＜0.01), 其它組變化均不大(P＞0.01); 與初始值相比, 5d時(shí)除對(duì)照變化不明顯外,V5組顯著升高(達(dá) 102.16μg/108cell), 而其它處理組卻仍明顯低于其初始值。之后, 對(duì)照呈逐漸降低趨勢(shì),而處理組中除 V1呈波動(dòng)性變化外, 其它各組均呈先降低后升高的趨勢(shì); 三個(gè)低濃度組在7 d時(shí)出現(xiàn)低值,而兩個(gè)高濃度組均在14 d時(shí)出現(xiàn)低值。21 d時(shí), 除V1組外各處理組均明顯高于對(duì)照(50.63μg/108cell),其中 V3組(87.22μg/108cell)最高, V5組次之(P＜0.01)。結(jié)果表明, 在As(V)暴露初期藻細(xì)胞葉綠素a合成明顯受到抑制, 而長(zhǎng)期暴露時(shí)藻細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生適應(yīng)性, 且適當(dāng)濃度的As(V)會(huì)促進(jìn)藻細(xì)胞葉綠素a合成。

表1 As(V)處理牟氏角毛藻培養(yǎng)水體中磷酸鹽含量(μg/L)變化及回歸分析Tab.1 Variation in PO4-P content (μg/L) in C. mulleri culture water after As(V) exposure and regression analysis

圖1 As(V)暴露條件下藻細(xì)胞密度的變化Fig.1 Effect of As(V) exposure on C. mulleri cell density

圖2 As(V)暴露條件下藻細(xì)胞葉綠素a含量的變化Fig.2 Effect of As(V) exposure on Chl-a content in C. mulleri

2.4 對(duì)牟氏角毛藻細(xì)胞GSH含量及谷胱甘肽還原酶活性的影響

圖3顯示, 在As(V)暴露48 h時(shí), 牟氏角毛藻細(xì)胞GSH含量分析結(jié)果發(fā)現(xiàn), 處理組GSH含量均明顯低于對(duì)照(3.23μg/108cell)(P＜0.01), 且隨著 As(V)暴露濃度的升高呈先升高后逐漸降低的趨勢(shì); 其中, V2組(1.91μg/108cell)為各處理組中的最高值(P＜0.01), V5組最低, 但與V4組差異不明顯。結(jié)果表明, As(V)暴露對(duì)藻細(xì)胞 GSH含量具有顯著的抑制作用; 但在低濃度范圍的 As(V)暴露對(duì) GSH含量的抑制作用隨著As(V)濃度的升高而減弱, 而暴露濃度超過一定限值時(shí)則反之。

As(V)暴露條件下, 藻細(xì)胞谷胱甘肽還原酶活性基本呈隨著As(V)濃度升高而降低的趨勢(shì)。其中, V1組谷胱甘肽還原酶活性(3.80U/106cell)最高, 明顯高于對(duì)照(2.47U/106cell), 但與V3差異不顯著; V5明顯低于對(duì)照, 僅為 2.01U/106cell, 其它兩個(gè)處理組與對(duì)照差異不明顯。較低濃度的As(V)暴露會(huì)誘導(dǎo)谷胱甘肽還原酶活性升高, 而 As(V)暴露濃度過高時(shí)則抑制了谷胱甘肽還原酶酶活性。

3 討論

3.1 As(V)脅迫對(duì)牟氏角毛藻培養(yǎng)水體中磷酸鹽含量的影響

砷與磷同處元素周期表的第 V主族, 因此砷酸鹽與磷酸鹽具有許多相似的化學(xué)性質(zhì)。As(V)與磷酸鹽在生物吸收過程中存在明顯競(jìng)爭(zhēng), 少磷條件下淡水浮游植物細(xì)胞合成更多的磷/iAsv轉(zhuǎn)運(yùn)體而增加對(duì)iAsv的吸收(Zhaoet al, 2009); As(V)與細(xì)胞的結(jié)合常數(shù)也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于無磷條件(龔艷等, 2009)。本研究表明,在長(zhǎng)期共存條件下, 適當(dāng)濃度 As(V)會(huì)促進(jìn)牟氏角毛藻對(duì)磷酸鹽的吸收速度, 而較低暴露濃度時(shí)則反之(表 1)。適當(dāng)濃度 As(V)可能促進(jìn)了磷/iAsv轉(zhuǎn)運(yùn)體合成而又尚未對(duì)磷酸鹽吸收形成明顯抑制, 從而增加表現(xiàn)為磷酸鹽的吸收速度升高。As(V)暴露條件下,不同供磷、氮及有機(jī)質(zhì)水平時(shí)牟氏角毛藻等海洋硅藻的營(yíng)養(yǎng)鹽吸收及砷富集動(dòng)力學(xué)有待進(jìn)一步研究, 海洋微藻細(xì)胞對(duì)的砷的轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)化的生化、分子機(jī)理研究也有待加強(qiáng)。

圖3 As(V)暴露條件下藻細(xì)胞GSH含量與谷胱甘肽還原酶活性的變化Fig.3 Effects of As(V) exposure on GSH content and glutathione reductase activity in C. mulleri

3.2 As(V)脅迫對(duì)牟氏角毛藻生長(zhǎng)、色素合成的影響及其機(jī)理研究

砷對(duì)微藻生長(zhǎng)率的影響因藻種不同而有差異,As(V)對(duì)三角褐指藻的毒性作用隨磷酸鹽濃度降低受到抑制, 而對(duì)叉邊金藻的毒性作用不受磷酸鹽濃度影響。本結(jié)果發(fā)現(xiàn), 所有處理組藻細(xì)胞密度在整個(gè)試驗(yàn)期間均呈波動(dòng)性增長(zhǎng)趨勢(shì), 第 3—5天時(shí)均有所降低, 之后又出現(xiàn)恢復(fù)生長(zhǎng)的現(xiàn)象(圖1)。這表明, 適當(dāng)濃度 As(V)會(huì)促進(jìn)牟氏角毛藻生長(zhǎng), 但高濃度、長(zhǎng)期暴露對(duì)藻細(xì)胞繁殖具有一定的抑制作用, 這與肖虹濱等(1995)和龔艷等(2009)的結(jié)果一致。而As(V)對(duì)不同微藻的毒性作用會(huì)因藻種、磷酸鹽含量不同而有所差異, 其機(jī)理仍需進(jìn)一步證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn), 在As(V)暴露初期牟氏角毛藻細(xì)胞葉綠素a含量顯著低于對(duì)照, 而長(zhǎng)期暴露時(shí)一定濃度的 As(V)會(huì)促進(jìn)藻細(xì)胞葉綠素a合成(圖2), 這與龔艷等(2011)的結(jié)果一致。無機(jī)砷對(duì)微囊藻葉綠素a含量的影響與砷形態(tài)有關(guān),As(Ⅲ)長(zhǎng)期暴露對(duì)微囊藻的光合作用有抑制效應(yīng)(龔艷等, 2011); 暴露于 As(Ⅲ) 48h時(shí), 銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)細(xì)胞中葉綠素a合成明顯受到抑制, 且受抑制程度比類胡蘿卜素更顯著(Wanget al, 2012)。因此, As(Ⅲ)暴露對(duì)牟氏角毛藻細(xì)胞色素合成及光合作用的影響及其機(jī)理研究有待開展。

3.3 As(V)脅迫對(duì)牟氏角毛藻細(xì)胞抗氧化活性的影響及其解毒機(jī)制

GSH及植物鰲合肽(PCs)類物質(zhì)在植物的解毒過程中具有重要作用(Esterbaueret al, 1978), 但其解毒效果隨著毒性物質(zhì)種類、暴露濃度、暴露時(shí)間等不同而發(fā)生變化(田丹等, 2010)。砷可以刺激大葉井口邊草中 GSH 的產(chǎn)生, 并通過絡(luò)合作用與砷形成As-GSH; 植物體內(nèi) As(V)向 As(Ⅲ)的轉(zhuǎn)化也可能與GSH類物質(zhì)有關(guān)(黃澤春等, 2003)。本研究發(fā)現(xiàn), As(V)暴露對(duì)牟氏角毛藻 GSH含量具有顯著的抑制作用;但在低濃度范圍的 As(V)暴露對(duì) GSH含量的抑制作用隨著 As(V)濃度的升高而減弱(圖 3右), 而高濃度的As(V)暴露可能會(huì)對(duì)牟氏角毛藻細(xì)胞造成氧化損傷,但損傷程度隨暴露時(shí)間的變化則有待進(jìn)一步證實(shí)。較低濃度的As(V)暴露會(huì)誘導(dǎo)谷胱甘肽還原酶活性升高(圖 3左), 但 As(V)暴露濃度過高時(shí)導(dǎo)致牟氏角毛藻細(xì)胞損傷, 而抑制了谷胱甘肽還原酶基因的表達(dá)或其酶分子活性, 其具體機(jī)理有待進(jìn)一步探究。綜上所述, 有關(guān)海洋浮游植物、大型藻類等的砷富集、轉(zhuǎn)化和解毒機(jī)制研究亟待加強(qiáng), 這對(duì)近海砷污染的生物生態(tài)效應(yīng)及其生物修復(fù)具有重要意義。

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