司開學 夏長革 王朝陽 張迪駿 何 珊 周 君 張紅燕韓姣姣 崔晨茜 董麗莎 蘇秀榕①

(1. 寧波大學海洋學院 寧波 315211; 2. 吉林省長春市新立城水庫管理局 長春 130119)

放線菌是一類具有分枝狀菌絲體的革蘭陽性菌,是生理活性物質尤其是天然藥物的重要來源(劉睿等, 2006; 林親雄等, 2006; 王海雁等, 2010)。過去的幾十年里抗生素及藥物篩選一直來源于土壤微生物,其數(shù)量及抑菌活性已達到瓶頸。而海洋微生物在極端環(huán)境下, 可能會通過調(diào)整其次生代謝途徑產(chǎn)生具有抑菌作用的生物活性物質。如放線菌產(chǎn)生鹵化酶催化的生物活性物質能顯著提高其抑菌活性。當今臨床和農(nóng)業(yè)上使用的抗生素 75%由放線菌產(chǎn)生(Bérdy, 2005)。由于陸地放線菌已經(jīng)被長期研究和篩選, 近十多年來, 日本、美國、德國、英國等一些國家和國內(nèi)的研究機構及制藥廠逐步把研究方向轉向海洋放線菌。它廣泛分布于淺灘、近岸、海洋動植物體內(nèi)、深海沉積物、海水以及結核礦區(qū)、海底冷泉區(qū)等。隨著海洋經(jīng)濟的推進, 陸源污染物包括工業(yè)廢水、城鎮(zhèn)生活污水、農(nóng)藥和化肥等, 主要通過河川徑流入海和沿岸的排污口直排入海, 大氣污染還可以通過氣體干濕沉降進入海洋。85%以上的海洋污染物都來自于陸源污染, 其成分很復雜, 主要為重金屬、難降解有機物和微生物代謝物等, 這也使陸源排污口變成了一個獨特的生態(tài)圈, 這里生存的大量微生物也就非常具有研究價值。因此, 研究陸源排污口的放線菌多樣性意義重大。本文利用454測序技術研究陸源排污口的放線菌的時空分布, 以期為進一步開發(fā)利用放線菌、預防和治療放線菌引起的病害奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取寧波沿海2個重點陸源排污口和8個一般排污口作為采樣點(表1)。其中S4、S6、S8和S9為綜合排污口, S1、S3、S5、S7和S10為工業(yè)排污口, S2為市政排污口(陳麗萍等, 2013)。

分別于2011年3月、5月、8月、10月在排污口處與排污口50m處采集水樣5L, 用0.2μm微濾膜過濾后提取DNA(王中華等, 2014)。

表1 寧波沿海10個陸源排污口相關信息Tab.1 Information of ten land-based sewage outlets in Ningbo

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取約2 L的海水, 以0.22μm的微孔濾膜富集微生物, 利用試劑盒提取基因組DNA(美國Omega生物技術公司)(Wanget al, 2014a, b)。

1.2.2 PCR擴增 根據(jù)細菌16S rRNA的保守序列,利用Primer Premier 5.0設計擴增引物: 16S F (5′-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3′)和16S R (5′-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG-3′)。

20μL 擴增反應體系: 10×buffer 2μL, 2 μL MgCl2,2 μL dNTP, 上游引物和下游引物各 25μL, 0.2 μL Taq DNA聚合酶和1 μL DNA模版。PCR擴增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR擴增條件: 94°C預變性4 min, 94°C變性30 s,退火溫度從65°C到55°C, 退火30s, 20個循環(huán); 72°C延伸30 s, 94°C變性30 s, 55°C退火30 s, 72°C延伸30 s,35個循環(huán); 最終72°C延伸10 min(劉兵等, 2009)。

1.2.3 測序與分析 將純化后的 PCR產(chǎn)物進行454焦磷酸測序(Margulieset al, 2005), 結果用羅氏軟件2.5.3進行信號處理分析。根據(jù)放線菌在文庫中出現(xiàn)的頻次數(shù)量, 進一步用R For Window 2.15.2、SPSS等進行統(tǒng)計分析。

2 結果與討論

2.1 排污口放線菌種類

利用 454高通量測序技術, 從寧波沿海10個陸源排污口20個站點4個檢測月份80個海水樣品, 共成功鑒定出了放線菌目5158個, 酸微菌目481個, 紅蝽桿菌目232個, 雙棲桿菌目62個, Euzebiales 9個,紅色桿菌目 9個, 土壤紅桿菌目 8個。也鑒定出 39個科, 83個屬和84個種, 有些種是首次發(fā)現(xiàn)。

2.2 排污口放線菌的整體分布

由圖 1可知, 象山石浦水產(chǎn)加工園區(qū)排污口(S4)、北侖三山排污口(S6)和寧海顏公河入海排污口(S9)排污口放線菌門檢測頻次較高, 分別為 1480、1243和1275次, S9站點50m處檢測到放線菌門頻次高達831次; 象山石浦水產(chǎn)加工園區(qū)排污口(S3)、象山墻頭綜合排污口(S5)、寧海西店崔家綜合排污口(S7)、奉化市下陳排污口(S8)和余姚黃家埠排污口(S10)放線菌門被檢頻次分別為 522、846、601、536和404次; 象山爵溪西塘排污口(S1)和象山水桶岙垃圾場滲透液排污口(S2站)點檢測頻次較低, 分別為326次和137次, 其中S2站點排污口處取樣檢測結果顯示被測頻次僅為3次, 說明放線菌在該條件下生長受到了一定的抑制作用, 不適合其繁殖生長。總體上看, 距排污口50m以外處檢出頻次要高于排污口處。

2.3 不同季節(jié)放線菌的分布特點

圖1 不同月份不同站點放線菌總體分布Fig.1 The distribution of Actinomycetales in different sewage outlets and months

從圖2可知, 3月份檢出頻次為1212/ 16.44%, 5月份檢出頻次為 3197/ 43.37%, 8月份檢出頻次為1631/ 22.13%, 10月份檢出頻次為1330/ 18.04%。從各月份排污口放線菌門頻次變化情況來看, 5月份放線菌被檢頻次最高, 8月份次之, 是放線菌門繁殖最佳的季節(jié); 而3月份和10月份檢出頻次最低, 故推測放線菌的繁殖數(shù)量與季節(jié)的變化存在一定的相關性。Allgaier等(2006)在調(diào)查德國東北部四大湖泊中放線菌多樣性和數(shù)量的動態(tài)變化時, 發(fā)現(xiàn)放線菌數(shù)量呈現(xiàn)出有規(guī)律的季節(jié)性變化, 春季和秋季兩個季節(jié)達到最大值; Gl?ckner等(2000)在研究 Gossenkollesee湖泊的放線菌分布時也得出相近的結論:Gossenkollesee湖泊中放線菌數(shù)量在4月份和8月份達到頂峰, 這與本研究得出的推論極為相近。然而,也有研究認為冬季是放線菌數(shù)量達到最大值的季節(jié)(Burkert et al, 2003), 這是由于地理位置的差異和氣候的不同造成的。寧波2011年3月份平均氣溫為15°C,5月份、8月份和10月份平均氣溫分別為26°C、34°C和23°C。5月份和8月份放線菌較多, 該氣溫是大多數(shù)放線菌生長的最佳氣溫。尹洪祥(1981)在研究培養(yǎng)溫度對某些微生物的生長與培養(yǎng)特性的影響時發(fā)現(xiàn),大多數(shù)放線菌, 原放線菌, 分支桿菌等非嗜熱性菌株的最適生長溫度為 24—37°C(占 98%—100%), 溫度升高, 菌株的存活率將逐漸降低。這是由于溫度升高會引起微生物呼吸指數(shù)的上升, 加速有機碳的礦化,增加了它的有效性, 使微生物活性增強, 生長加快(Hu et al, 1999)。5月份S4和S9放線菌數(shù)量較多, 而其它8個站點放線菌數(shù)量較少; 8月份S4、S5、S6和S8放線菌數(shù)量較多, 而S1、S2、S3等6個站點菌數(shù)量較少, 表明影響放線菌生長的因素除了溫度以外還有其它因素(Zhang et al, 2004)。

圖2 10個排污口處與距排污口50m處四個月份檢出放線菌頻次情況Fig.2 The distribution of Actinomycetales at 0 and 50 m away from sewage outlets in the four sampling months

2.4 放線菌不同站點的分布特點

從圖3可知, 綜合排污口(S4, S6, S8和S9)放線菌被檢測頻次最高, 為4534次, 工業(yè)排污口(S1, S3,S5, S7和S10)檢測到放線菌的頻次次之, 為2699次;S2為市政排污口, 放線菌被檢測頻次最低, 僅為137次。排污口類型的不同, 放線菌數(shù)量呈現(xiàn)出較為顯著的差異。綜合排污口與市政排污口的放線菌數(shù)量差異最為顯著, 故推測放線菌被檢頻次與排污口類型有關。

放線菌大部分屬于異養(yǎng)型細菌(Methé et al,1998)。從變化趨勢來看, 3月份到10月份大部分排污口放線菌數(shù)量呈現(xiàn)出先增長后下降的變化, 尤其是綜合排污口表現(xiàn)的更為明顯。這表明放線菌的生長環(huán)境由適中逐漸轉向惡劣, 分析其原因很可能由于3月份工廠大量開工, 排放出大量無機氮, 活性磷酸鹽等污染物, 加之氣溫回升, 為放線菌的生長提供了良好條件。5月份到8月份氣溫大幅升高, 工廠運行較少,排放廢棄物較少, 放線菌營養(yǎng)物質來源受限制, 生長受到抑制。S8、S9屬于水產(chǎn)品養(yǎng)殖區(qū), 5月份是這兩個站點放線菌暴發(fā)期, 而 4月份到6月份屬于魚類疾病高發(fā)期, 需注意由放線菌所引起的疾病(Gauthier et al, 2009), 建議相關企業(yè)做好疾病防范措施。S7與S10的放線菌數(shù)量呈現(xiàn)出的變化與其它站點相反, 主要是由于水體磷和氨氮的含量超標, 導致水體富營養(yǎng)化, 藻類瘋狂生長, 水中溶氧量下降, 加之高濃度的氨氮對微生物的生長有一定的抑制作用(趙慶良等,1998), 從而導致放線菌的數(shù)量呈現(xiàn)先下降后增長的變化。S2是市政排污口, 排出的主要是象山垃圾場滲透液。這些排污口含有較多的有機物, 氨氮及鉻、鎳、鋁和錳等含量較高(魏云梅等, 2007)。從3月份到10月份, 放線菌數(shù)量呈現(xiàn)先下降后升高的變化。這主要是由于隨著溫度的升高, 氨氮化合物氧化分解加快、耗氧量增加(胡蝶等, 2011), 這使得放線菌的數(shù)量大量下降。8月份后, 隨著溫度的下降, 氨氮物質氧化分解速率降低, 耗氧量減少, 放線菌的繁殖量增加。

圖3 不同類型排污口放線菌的分布情況Fig.3 The distribution of Actinomycetales in different types of sewage outlets

2.5 5個工業(yè)排污口放線菌的分布特點

陸源排污口污染物入海是造成我國近岸海域環(huán)境污染和生態(tài)損害的主要原因(Swartz et al, 1985)。S1、S3、S5、S7、S10是寧波市5個工業(yè)排污口。工業(yè)廢棄物(主要含有無機氮, 有機磷, 甚至重金屬等污染物)通過陸源排污口排入大海, 對近岸海域生態(tài)環(huán)境造成嚴重影響。3月、5月、8月和10月四個月份, 對S1、S3、S5、S7和S10工業(yè)排污口放線菌種類檢測出16種、17種、21種、38種和24種放線菌。

圖4 工業(yè)排污口放線菌分布情況的文氏圖Fig.4 The Venn diagram of distribution of Actinomycetales in the industrial sewage outlets

表2 5個工業(yè)排污口檢測出的共同放線菌種類Tab.2 The common Actinomycetales species in five industrial sewage outlets

圖4顯示, S1與S3、S5、S7、S10有6、9、8和9種共同菌; S3與S5、S7和S10分別檢測出共同菌為5、10、8種; S5與 S7和S10檢出共同菌分別為13和12種; S7和S10的共同菌為15種。S7與S10檢出共同菌種類最多, 推測其適合放線菌生長的營養(yǎng)成分最為接近; 相對于S3和S7站點, S1與S5和S10測出共同菌較多, 推測成分更為接近; 同樣可以分析出S3與S7污水成分相近, S5與S7污水的成分相近。結合表2可知, 5個工業(yè)排污口的共同菌為: 藤黃微球菌(Micrococcus luteus), 厭鹽假諾卡氏菌(Pseudonocardia halophobica), Microbacterium aurum,Candidatus Aquiluna rubra。C. Aquiluna rubra廣泛分布于淡水, 部分能在海水中檢測到, 屬于異養(yǎng)需氧型細菌, 分布于營養(yǎng)豐富的水域(Hahn, 2009; Jung et al,2010), 是寧波陸源排污口優(yōu)勢菌; 在 10個排污口檢出總頻次為 1367/18.67%, 在 S1檢出頻次為164/2.24%, 在 S3、S5、S7和 S10檢出頻次分別為15/0.21%、38/0.52%、30/0.41%和 48/0.66%, 表明相對于 S3、S5、S7和 S10來說, S1的環(huán)境更適合 C.Aquiluna. rubra的生長。產(chǎn)氣柯林斯菌(Collinsella aerofaciens)是人體腸道中數(shù)量最高, 也是腸道微生物致病率最高的的厭氧革蘭氏陽性菌, 主要在糞源污染物中分離得到(Kageyama et al, 2000)。S1和S7兩個站點檢出26/0.36%產(chǎn)氣柯林斯菌(C. aerofaciens),推測S1和S7附近有糞源污染物。5個工業(yè)排污口中,S7獨自檢出了短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve), 長雙歧桿菌(B. longum), 兩岐雙岐桿菌(B. bifidum)。雙歧桿菌屬于嚴格厭氧微生物, 存在于人體腸道中, 其中短雙歧桿菌只存在于嬰兒腸道中, 這進一步證明了S7存在人類糞源污染物。皺孢鏈霉菌(Streptomyces scabrisporus)和硫藤黃鏈霉菌(S. thioluteus)隸屬于放線菌門, 放線菌綱, 放線菌目, 鏈霉菌科, 鏈霉菌屬,在S5處獨自檢出。該排污口評價近岸海域綜合環(huán)境質量為差, 生物質量類別為第二類海洋生物, 其主要污染物為鉛, 石油烴等, 生物質量綜合等級為嚴重污染。有研究表明, 鏈霉菌屬有促進對石油烴的降解作用(劉海軍等, 2014)。放線菌在含重金屬的環(huán)境中生存表現(xiàn)了一定的優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)初期的放線菌對鎘的耐受性很強, 高濃度的鎘可能刺激了放線菌的大量繁殖(陳文清, 2009), 而鏈霉菌是其中的優(yōu)勢菌群(Amoroso et al, 1998)。這是因為放線菌可以通過改變重金屬的價態(tài)來影響金屬的生態(tài)毒性, 它產(chǎn)生的具有絮凝活性的代謝物, 分泌到細胞外能使水中的膠體懸浮物互相凝聚沉淀, 從而達到去除重金屬離子的目的(Nies, 1999)。

3 結論

利用 454高通量測序平臺, 從寧波10個陸源排污口20個取樣站點4個月份, 鑒定出了放線菌的83個屬, 84個種。Candidatus Aquiluna rubra在5個工業(yè)排污口廣泛分布和大量繁殖, S1和S7有難培養(yǎng)的厭氧產(chǎn)氣柯林斯菌(Collinsella aerofaciens)的檢出, 尤其是 S7還檢出了雙歧桿菌。對此, 相關企業(yè)應及時排查人類糞源污染物源頭。S5處獨自檢出皺孢鏈霉菌(Streptomyces scabrisporus)和硫藤黃鏈霉菌(S.thioluteus), 反映了石油降解物和重金屬帶來的環(huán)境壓力, 應加強監(jiān)測和防治。

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