羅 璇 于仁成 王曉杰 周名江

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點實驗室 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049;3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實驗室 青島 266071; 4. 上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室 上海 201306)

織紋螺(Nassarius spp.)是一類海洋腹足類動物,腐食性, 廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)的潮間帶及海底(Britton et al, 1994a, b)。我國沿海部分地區(qū)的居民素有食用織紋螺的習(xí)慣, 因食用織紋螺導(dǎo)致的食物中毒事件近年來多次發(fā)生。1991—2003年期間, 江蘇省連云港市發(fā)生了 10起食用織紋螺導(dǎo)致的中毒事件, 其中 40人中毒, 8人死亡(林祥田等,2005)。從1979年到2000年, 浙江省舟山市發(fā)生類似中毒事件42起, 導(dǎo)致307人中毒, 其中16人死亡。1985年至2000年期間, 浙江省寧波市有59人因食用有毒織紋螺中毒, 其中18人死亡(水黎明等, 2001; 秦品章等, 2003)。1989至2010年期間, 福建省寧德市共發(fā)生類似中毒事件22起, 導(dǎo)致79人中毒, 其中10人死亡(郭勝利, 2012)。另外, 海南、廣東及臺灣地區(qū)也多次發(fā)生食用織紋螺導(dǎo)致的食物中毒事件(Hwang et al, 1995, 2002; Hwang et al, 2005)。對此, 我國衛(wèi)生部門采取了多種相關(guān)措施, 并在中毒事件高發(fā)期限制水產(chǎn)品市場上的織紋螺交易, 一定程度上減少了中毒事件的發(fā)生。但是, 由于對織紋螺的毒性消長規(guī)律及毒素組成情況仍缺乏清楚的認(rèn)識。2012年 7月浙江省溫州市再次發(fā)生中毒事件, 引起了公眾的廣泛關(guān)注(林學(xué)堯等, 2015)。

以往研究發(fā)現(xiàn), 采集自福建省的織紋螺毒性消長具有明顯的季節(jié)性和地域性特征(羅璇等, 2008), 河豚毒素及其衍生物(tetrodotoxins, TTXs)是織紋螺中主要的致毒成分(Hwang et al, 2002; Hwang et al, 2005; Shui et al, 2003; 于仁成等, 2007)。但是, 也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)織紋螺(Nassarius papillosus)中同時存在河豚毒素和麻痹性貝毒毒素(paralytic shellfish toxins, PSTs)(Hwang et al, 1995; 徐景野等, 2010)。TTX是一種鈉離子通道阻斷劑, 廣泛存在于陸地和海洋生物體內(nèi)。在法螺、細(xì)紋玉螺、蛙螺、日本油螺、骨螺、榧螺和織紋螺等腹足類軟體動物體內(nèi), 經(jīng)常檢測到 TTX(Narita et al,1981; Noguchi et al, 1981, 1984; Yasumoto et al, 1981;Jeon et al, 1984; Hwang et al, 1990, 1991a, b c; Hwang et al, 2003)。TTX存在一系列結(jié)構(gòu)相似的同系物, 如4-epiTTX、6-epiTTX、11-deoxyTTX、4,9-anhydroTTX、11-norTTX-(S)-ol、5,6,11-trideoxyTTX、11-oxoTTX 等,其毒性存在較大差異(Lai et al, 2003)。在帶有TTX的有毒生物中, 由于毒素來源不同, 毒素同系物間轉(zhuǎn)化情況也有差別(Yotsu-Yamashita et al, 1999), 毒素組成往往有明顯差異。運用LC-MS等分析技術(shù), 可以對織紋螺中的毒素成分進行定性定量檢測, 進而比較不同地域織紋螺中的毒素組成。

在本研究中, 我們選取了中國沿海多個發(fā)生過食用織紋螺中毒事件的地區(qū), 采集織紋螺樣品, 并運用LC-MS方法對樣品中的TTX及其同系物進行了分析, 以研究不同地域織紋螺的毒素組成, 探討毒素組成與其毒性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

自 2006—2007年間, 選取江蘇省連云港市和鹽城市、浙江省舟山市和寧波市, 以及福建省寧德市和莆田市, 在沿海地區(qū)潮間帶和潮下帶設(shè)立采樣點, 定期采集織紋螺樣品(采樣地如圖 1所示), 所有樣品均采自 4—8月織紋螺種群數(shù)量較高的季節(jié), 其余月份由于織紋螺種群數(shù)量急劇下降, 無法滿足采樣需求。采集到的樣品被迅速冷凍處理, 盡快運送到實驗室,于-20°C下保存。選取各地采集的半褶織紋螺樣品(N.semiplicatus)進行毒性測試和毒素分析。

1.2 毒性測試

圖1 中國沿海織紋螺樣品采樣點設(shè)置圖Fig.1 Sampling locations for nassariids

半褶織紋螺樣品的毒性測試采用小鼠生物法,過程參照美國分析化學(xué)家協(xié)會(Association of Analytical Communities, AOAC)公布的針對 PSP的毒性測試方法(Williams, 1984)。這種方法對PSP毒素和TTX毒素的毒性測試都很有效。解剖取出完整的織紋螺軟體組織, 勻漿, 稱取5g勻漿后組織, 加入5mL HCl溶液(0.1mol/L)進行提取, 用組織高速分散器打碎, 以1.0mol/L HCl調(diào)整其pH值至2.0—4.0。將混合物放到沸水浴中加熱 10min, 取出冷卻至室溫后, 再次以1.0mol/L HCl調(diào)整其pH值至2.0—4.0, 并將提取體系的最終體積定容到 10mL, 在 6000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min, 取上清液對實驗小鼠(昆明系小鼠, 購買自青島市藥品檢驗所)進行腹腔注射, 觀察小鼠的反應(yīng)并記錄下死亡時間和體重。樣品的毒性水平依照Hwang等建立的劑量-死亡時間關(guān)系進行計算, 以小鼠單位(mouse unit, MU)表示, 1MU代表能夠在30min內(nèi)殺死 1只體重為 20g雄性小鼠的毒素量(Hwang et al,1991)。用于生物毒性測試法的化學(xué)試劑均為分析純級別以上。

1.3 毒素分析

半褶織紋螺樣品的毒素分析采用 LC-MS方法,系參照李愛峰等和于仁成等所用的方法(李愛峰等,2007; 于仁成等, 2007), 并略有改動。用于LC-MS分析的化學(xué)試劑均為色譜純, 實驗用水為經(jīng) Millipore純水系統(tǒng)凈化的超純水(Millipore, 美國)。TTX標(biāo)準(zhǔn)品購買自美國Calbiochem公司。

取2g勻漿后的織紋螺組織, 加入4mL酸化甲醇水(甲醇︰水=80︰20, 含 0.1%乙酸), 在冰浴中用組織分散器處理 5min后靜置, 進行毒素提取, 在 20°C下 6000r/min離心 15min, 取上清液。向離心后剩余殘渣中再加入4mL酸化甲醇水重復(fù)提取1次。合并提取液, 在45°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。以4mL 0.05mol/L乙酸分多次溶解殘余物, 并定容至5mL。前后加入等體積二氯甲烷進行二次脫脂后, 將含有毒素的水相吸出, 用孔徑為 3000Da的超濾離心管(Millipore,Bedford, MA, USA)在12000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min,濾出液用于LC-MS/MS分析TTX及其同系物。

對數(shù)量相對較多的采集自的江蘇連云港和浙江舟山兩地的織紋螺樣品進行了組織分離, 將其分為肌肉、消化腺及其它組織三部分, 并分別提取毒素和分析, 以了解毒素在織紋螺不同解剖學(xué)組織中的含量與分布情況。

樣品分析所用的 LC-MS系統(tǒng)為 Varian 2100 L(Varian公司, 美國)型高效液相色譜儀串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀, 采用電噴霧離子化源。毒素的分離采用親水性相互作用色譜柱 SeQuant ZIC-HILIC (150×2.1mm, 5μm), 購自瑞典SeQuant AB公司。流動相A為超純水, 流動相 B為 90%乙腈, 兩者中均含有5mmol/L甲酸銨和5mmol/L甲酸。洗脫采用了梯度洗脫, 洗脫液的初始比例為A:B=30:70, 前7min內(nèi)流動相A的比例逐漸增加至50%, 在第8分鐘回復(fù)至初始比例, 并保持 12min。流速為 0.2mL/min, 進樣量3—10μL(根據(jù)樣品小鼠測試毒性結(jié)果大小而定)。

檢測模式采用多反應(yīng)檢測方式(Multiple reaction monitoring, MRM), 分別檢測 trideoxy TTX(272.30/162.10), anhydro TTX (302.30/162.10), deoxy TTX (304.30/162.10), TTX及其同分異構(gòu)體4-epi TTX(320.30/162.10), oxo TTX (336.30/162.10)。通過流動注射(FIA)方式, 以0.25μg/mL的TTX標(biāo)準(zhǔn)品溶液(流速 0.2mL/min)對質(zhì)譜檢測器進行調(diào)諧后, 設(shè)定參數(shù)為: 質(zhì)譜進液針(needle)電壓 5400V, 電流為 31μA;干燥氣溫度為150°C, 氣壓為19psi; 電噴霧離子化源氮氣壓為57psi; 毛細(xì)管掃描電壓為79V; 電離室溫度為 50°C; 保護電壓 600V; 陽離子模式檢測器電壓為1750V; 離子導(dǎo)向電壓(Q0), 一級(Q1)和二級(Q3)電壓分別為-4.9V、-0.8V和-0.2V; 碰撞能-36.5V。

將TTX毒素標(biāo)準(zhǔn)品用0.05mol/L乙酸溶液稀釋,得到 0.002、0.01、0.05、0.25、1.00、2.5、5.0 和 10μg/mL不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn), 用于繪制方法標(biāo)準(zhǔn)曲線。

織紋螺樣品中TTX含量依照TTX的標(biāo)準(zhǔn)品濃度計算。由于缺少TTX同系物的標(biāo)準(zhǔn)品, 對TTX同系物的定量分析參照TTX標(biāo)準(zhǔn)品的濃度進行計算。

2 實驗結(jié)果

2.1 織紋螺樣品毒性狀況

根據(jù)小鼠生物法測試結(jié)果, 采用 Hwang提出的小鼠死亡時間與樣品毒性關(guān)系表(Hwang et al, 1991)進行分析, 表明采自各地的織紋螺樣品毒性范圍在2—664MU/g 組織(濕重)之間。1MU 大約相當(dāng)于0.22μg TTX。在所有采樣點中, 來自江蘇省連云港的織紋螺毒性最高, 均在100MU/g組織(濕重)以上, 最高達到 664MU/g組織(濕重), 相當(dāng)于每 100g組織中含有14.6mg TTX毒素。根據(jù)織紋螺軟組織的平均濕重計算, 所采集的高毒性織紋螺個體中含有約58.4μg TTX。采集自其它五個地區(qū)的織紋螺毒性相對較低, 在2—6MU/g 組織之間(表1)。

2.2 TTX的LC-MS分析方法

實驗采用了親水性相互作用色譜法對 TTX毒素及其同系物進行分離, 結(jié)果顯示, 親水性相互作用色譜柱 (ZIC-HILIC)對TTX有很好的保留效果, TTX保留時間為9.84min(圖2a), 在測定的TTX毒素濃度范圍內(nèi)(25—400ng/mL), 信號與毒素濃度之間有良好的線性響應(yīng), R2=0.9968(圖 3)。同時, 由于串聯(lián)質(zhì)譜對雜質(zhì)信號優(yōu)異的去除能力, 該方法對 TTX的檢出限較低, 信噪比等于 3(Signal/Noice=3)時為 0.01pg。同一濃度的 TTX標(biāo)準(zhǔn)溶液(150ng/mL)分析結(jié)果的變異系數(shù)小于 7%(n=3), 說明該方法具有較高的精密度(見表 2)。

2.3 中國沿海不同地域織紋螺樣品的毒素組成與含量

運用上述 LC-MS方法, 從有毒織紋螺樣品中檢測到了TTX及trideoxyTTX, 4-epiTTX和anhydroTTX等毒素同系物(圖2b)。毒素分析結(jié)果顯示, 在采集自中國沿海不同地域的織紋螺樣品中, 毒素成分基本一致, 但 TTX和 trideoxyTTX所占的比例有所不同(圖4—圖6)。采集自江蘇省鹽城市、浙江省寧波市, 福建省莆田市和寧德市的織紋螺樣品中, TTX是主要的毒素成分, 其次是trideoxyTTX, 4-epiTTX和anhydroTTX含量最低(圖 4A—C, 圖 5A—B, 圖 6)。而在采集自江蘇省連云港市和浙江省舟山市的織紋螺樣品中,trideoxyTTX的含量最高, 遠(yuǎn)高于TTX和其它同系物(圖 4D—F, 圖 5C—D)。對比織紋螺樣品的毒性測試和TTX毒素含量(圖7)可以看出, 織紋螺的毒性主要由其高毒性成分TTX決定(R2=0.839), 而與其體內(nèi)各種毒素的總量關(guān)系不大。

表1 中國沿海不同地區(qū)采集的織紋螺樣品毒性狀況Tab.1 Toxicity of nassariid samples from different locations along the coast of China

圖2 應(yīng)用LC-MS/MS方法分析TTX毒素標(biāo)準(zhǔn)品和織紋螺樣品(采集自江蘇連云港贛榆)的色譜圖Fig.2 LC-MS/MS chromatograms of the TTX (tetrodotoxin)standard and a nassariid sample collected from Lianyungang

圖3 用LC-MS分析TTX的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.3 Calibration curve for TTX using LC-MS method

表2 應(yīng)用LC-MS方法分析TTX標(biāo)準(zhǔn)毒素的精密度Tab.2 Reproducibility in TTX analysis using LC-MS method

2.4 毒素在織紋螺中的解剖學(xué)分布

圖4 采集自江蘇省不同地區(qū)的半褶織紋螺樣品毒素組成Fig.4 The toxin profiles of N. semiplicatus collected from two locations of Jiangsu Province

圖5 采集自浙江省不同地區(qū)的半褶織紋螺樣品毒素組成Fig.5 The toxin profiles of N. semiplicatus collected from two locations of Zhejiang Province

對采集自江蘇省連云港市和浙江省舟山市的半褶織紋螺樣品進行了組織分離、毒素提取和分析。如圖8所示, 除2007年8月6日采集的織紋螺樣品外,其余兩個采集自江蘇連云港的樣品中肌肉組織的毒素總量最高, 其次是消化腺組織, 而其它組織中的毒素總量最低。各組織中主要的毒素成分均是trideoxyTTX, 其次是 TTX和其它毒素成分。而采集自浙江舟山的兩個織紋螺中, 均是肌肉組織中的毒素總量最高, 其次是消化腺組織與其它組織。肌肉組織和其它組織中的主要毒素成分是 trideoxyTTX,TTX次之; 消化腺組織中trideoxyTTX和 TTX的含量相當(dāng), 均為主要毒素成分(圖9)。

圖6 采集自福建省不同地區(qū)的半褶織紋螺樣品毒素組成Fig.6 Comparison of toxin profiles of N. semiplicatus collected from two locations of Fujian Province

圖7 半褶織紋螺毒性與其TTX含量之間的關(guān)系Fig.7 The relationship between the toxicity of N. semiplicatus and TTX content

圖8 江蘇連云港采集半褶織紋螺體內(nèi)河豚毒素的解剖學(xué)分布(a: 2007-5-21; b: 2007-6-6; c: 2007-8-6)Fig.8 Anatomical distribution of toxins in N. semiplicatus collected from Lianyungang, Jiangsu Province

3 討論

圖9 浙江舟山采集半褶織紋螺體內(nèi)河豚毒素的解剖學(xué)分布(a: 2006-7-7; b: 2006-8-28)Fig.9 Anatomical distribution of toxins in N. semiplicatus collected from Zhoushan, Zhejiang Province

TTX是一種非蛋白類神經(jīng)性毒素, 可導(dǎo)致食物中毒。TTX最早在河豚魚中檢測到, 隨著研究的深入,在多種陸地和海洋生物體內(nèi)檢測到 TTX及其同系物(Yasumoto et al, 1986), 如河豚魚(Mahmud et al,1999)、蛙類(Mebs et al, 1995)、腹足類軟體動物(Hwang et al, 1992a, b)、紐蟲(Asakawa et al, 2000,2003)、蠑螈(Yotsu-Yamashita et al, 2007a)、章魚(Yotsu-Yamashita et al, 2007b)、蟹(Ho et al, 2006)及海星(Lin et al, 2001)等。因食用含TTX的腹足類軟體動物而導(dǎo)致的中毒事件首先在日本報道(Narita et al,1981)。之后, 多種織紋螺(如Zeuxius scalaris和Natica clathrata等)在臺灣引發(fā)食物中毒事件(Hwang et al,1995)。自1977年開始, 我國浙江省發(fā)生了40多起織紋螺導(dǎo)致的中毒事件(水黎明等, 2001)。在肇事織紋螺中, 大部分樣品只含有 TTX及其衍生物(主要是anhydroTTX)。但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn), 在部分玉螺科和織紋螺科的軟體動物中, 除 TTX外, 還存在麻痹性貝類毒素(Hwang et al, 1994, 1995; 徐景野等, 2010)。

本研究從中國沿海三省六個地區(qū)采集了15份織紋螺樣品。經(jīng)毒性測試, 大部分樣品毒性在 2—6 MU/g組織(濕重)之間, 而采自江蘇省連云港的樣品毒性較高, 均在100 MU/g組織(濕重)以上, 遠(yuǎn)高于其它地區(qū)的樣品, 毒性最高可達664 MU/g組織(濕重)。根據(jù) Tani提出的 TTX對于人類的口服致死劑量為10000 MU的標(biāo)準(zhǔn)(Tani, 1945), 食用數(shù)粒高毒性織紋螺樣品就足以導(dǎo)致中毒。因此, 建議江蘇省連云港贛榆當(dāng)?shù)氐乃a(chǎn)品安全監(jiān)督部門對當(dāng)?shù)乜椉y螺的毒性進行長期監(jiān)測, 禁止居民食用, 以避免食物中毒事件。

本研究采用了親水性相互作用色譜分離河豚毒素及其衍生物, 通過三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜在多反應(yīng)檢測模式下分析織紋螺中的 TTX及其同系物。2001年, Shoji等(2001)首先應(yīng)用 LC-MS方法分析了河豚魚體內(nèi)的 TTX, 后來的研究發(fā)現(xiàn)親水性相互作用色譜對于TTX及其同系物的分析很有優(yōu)勢(Nakagawa et al, 2006)。本研究的結(jié)果同樣表明親水性相互作用色譜與串聯(lián)質(zhì)譜的結(jié)合非常適合織紋螺中的 TTX及其同系物的檢測, 是一種高效、快速的毒素分析方法。

通過毒素提取、超濾處理及LC-MS/MS分析, 在半褶織紋螺中均檢測到了 TTX及 trideoxyTTX,4-epiTTX和anhydroTTX等毒素同系物。受到毒素標(biāo)準(zhǔn)品限制, 在分析時使用TTX標(biāo)準(zhǔn)品對TTX的衍生物進行了定量計算, 與其實際含量可能存在一定偏差,但不會影響不同樣品間毒素組成的比較。通過對江蘇省連云港市和浙江省舟山市的織紋螺樣品毒素組成情況進行 4—5個月的連續(xù)監(jiān)測, 發(fā)現(xiàn)同一地區(qū)織紋螺毒素組成和毒素成分間相對比例非常穩(wěn)定, 說明季節(jié)性因素對織紋螺毒素組成無明顯影響(Luo et al,2012)。而對比各地采集的織紋螺樣品可以看出, 樣品中河豚毒素組成基本一致, 僅TTX和trideoxyTTX所占的比例有所不同。這一差異是否與各地海域環(huán)境條件有關(guān), 仍有待于進一步研究。在檢測到的 TTX及其同系物中, TTX的毒性最強, 通過腹腔注射對小鼠的半致死劑量 LD50約為 8μg/kg, 而其余幾種毒素成分的毒性遠(yuǎn)低于TTX(Lai et al, 2003)。通過對比織紋螺毒性與 TTX含量之間的關(guān)系, 發(fā)現(xiàn)兩者呈明顯的正相關(guān)性, 說明高毒性毒素成分 TTX對織紋螺毒性的貢獻較大。

從江蘇連云港和浙江舟山兩地半褶織紋螺不同組織中的毒素組成來看(圖 8—9), 毒性相對較低的trideoxyTTX在肌肉組織、消化腺組織和其它組織中是主要的毒素成分, 而毒性較大的 TTX含量次之,4-epi-TTX和 anhydroTTX的含量最少。大部分樣品中, 毒素總量最高的是肌肉組織, 其次是消化腺組織,其它組織中毒素總量最低, 但主要致毒成分 TTX含量最高值出現(xiàn)在肌肉或消化腺組織中。李愛峰等(2008)對 2004年導(dǎo)致福建仙游地區(qū)中毒事件的紅帶織紋螺(N. succinctus)進行研究, 也發(fā)現(xiàn)其不同組織中trideoxyTTX相對比例最高, 且高毒性毒素成分主要分布在內(nèi)臟組織中。這種不同毒素成分在織紋螺不同組織的分布差異, 可能與其代謝過程有關(guān), 具體機制還有待于進一步探討。

4 結(jié)論

本研究通過應(yīng)用液-質(zhì)聯(lián)用分析方法和小鼠生物毒性測試法, 對采自我國沿海不同地區(qū)的 15份半褶織紋螺樣品進行了毒性和毒素分析。結(jié)果表明, 所采集的半褶織紋螺樣品毒性范圍為 2—664MU/g濕重,存在較大地域性差異, 其中江蘇省連云港地區(qū)的半褶織紋螺樣品毒性遠(yuǎn)高于其它地區(qū)。各地半褶織紋螺樣品中的毒素成分基本一致, 均檢測出 TTX及trideoxyTTX、4-epiTTX和anhydroTTX等衍生物, 但各種毒素成分所占的比例存在差異。江蘇連云港和浙江舟山的織紋螺樣品中, TrideoxyTTX是主要的毒素成分; 而江蘇鹽城、浙江寧波及福建寧德、莆田的織紋螺樣品中, TTX的含量最高。江蘇連云港和浙江舟山的大部分織紋螺樣品中不同組織間毒素含量存在差異, 肌肉組織的毒素含量最高, 其次是消化腺組織,其余組織中的毒素含量最低, 高毒性成分 TTX的最高值主要出現(xiàn)在肌肉組織或消化腺組織中。

致謝 衷心感謝江蘇省連云港衛(wèi)生監(jiān)督所, 鹽城射陽疾病預(yù)防控制中心以及福建省莆田市政府在織紋螺樣品采集中的幫助, 中國科學(xué)院海洋研究所海洋標(biāo)本館張素萍研究員在織紋螺種類鑒定中給予的指導(dǎo), 以及浙江省舟山海洋生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站的母清林工程師在毒素分析過程中給予的幫助, 謹(jǐn)致謝忱。

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