趙 優(yōu) 莊 平 張 濤 趙 峰

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 200090; 3. 唐山出入境檢驗(yàn)檢疫局 唐山 063000)

多鱗四指馬鲅(Eleutheronema rhadinum)與四指馬鲅(E. tridactylum)均隸屬于輻鰭魚綱(Actinopterygii)、鱸形目(Perciformes)、馬鲅科(Polynemoidea)、四指馬鲅屬(Eleutheronema)(莊平等, 2006)。由于多鱗四指馬鲅與四指馬鲅在形態(tài)上相似度高, 曾一度將多鱗四指馬鲅與四指馬鲅混淆, 直到 Motomura等(2002)對(duì)四指馬鲅屬魚類進(jìn)行重新劃分, 才將多鱗四指馬鲅從四指馬鲅種中劃分出來, 并確定四指馬鲅屬包括多鱗四指馬鲅、四指馬鲅、三趾四指馬鲅(Eleutheronema tridactylum)三個(gè)種。目前, 在我國常見為多鱗四指馬鲅與四指馬鲅, 主要分布在我國東海及南海海域。多鱗四指馬鲅及四指馬鲅均為大型經(jīng)濟(jì)魚類, 具有生長速度快、鹽度適應(yīng)范圍廣、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn), 是海水魚類中的名貴種, 具有較好養(yǎng)殖開發(fā)前景, 已被 FAO作為重點(diǎn)推廣的養(yǎng)殖魚類(Rainboth, 1996)。但由于對(duì)四指馬鲅屬魚類研究起步較晚, 僅在資源調(diào)查(蔣日進(jìn)等, 2008; 陳淵戈等,2011; 龔小玲等, 2011)、遺傳結(jié)構(gòu)(林少珍等, 2012;Horne et al, 2013; Sun et al, 2013; Wang et al, 2014)、生物學(xué)(黃桂云等, 2012; 常有民等, 2013)及人工繁育(毛連環(huán), 2009)等方面有相關(guān)報(bào)道, 特別是利用遺傳結(jié)構(gòu)開展資源鑒定方面的研究較為罕見, 目前僅靠個(gè)別形態(tài)特征進(jìn)行多鱗四指馬鲅和四指馬鲅魚類的物種鑒定, 給兩物種資源評(píng)估與人工養(yǎng)殖開發(fā)帶來一定困難。

形態(tài)學(xué)具有易操作、受樣品狀態(tài)影響小、結(jié)果直觀等優(yōu)勢, 已被許多研究者應(yīng)用于魚類群體及物種間差異分析的研究中。多變量形態(tài)度量學(xué)方法是基于框架位點(diǎn)而引入多元統(tǒng)計(jì)的一種分析方法, 是對(duì)魚類外部形態(tài)的連續(xù)性特征差異的分析, 可更加全面反應(yīng)種內(nèi)及種間差異(Booksteinet al, 1985)。簡化基因組測序技術(shù)是目前最高效的群體分析的手段之一,近年發(fā)展起來的方法主要有GBS、RAD-seq、SLAF-seq等。該技術(shù)通過選取合適的限制性內(nèi)切酶結(jié)合高通量群體測序構(gòu)建 SNP分子標(biāo)記, 性價(jià)比高、穩(wěn)定性好,可廣泛用于群體進(jìn)化分析、高密度遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位以及輔助基因組組裝連接染色體等領(lǐng)域(陳士強(qiáng)等, 2013)?；赟LAF-seq技術(shù)的SNP多態(tài)分子標(biāo)記以及 InDEL分子標(biāo)記的開發(fā), 通過測序掃描整個(gè)基因組中存在的單核苷酸多態(tài)性(SNP)、結(jié)構(gòu)變異(SV)等遺傳變異, 開展遺傳圖譜研究, 完善魚類育種和選擇技術(shù)。

針對(duì)多鱗四指馬鲅與四指馬鲅種質(zhì)鑒定研究較為缺乏的現(xiàn)狀, 本研究首次應(yīng)用框架形態(tài)學(xué)方法對(duì)多鱗四指馬鲅及四指馬鲅兩物種形態(tài)差異進(jìn)行比較,并利用簡化基因組測序技術(shù)(SLAF-Seq), 對(duì)我國兩種易混淆的四指馬鲅魚類進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記分析, 獲得大量的變異信息(SNPs、InDels), 為進(jìn)一步開展多鱗四指馬鲅及四指馬鲅物種資源評(píng)估與管理、人工選育和功能基因開發(fā)等提供基礎(chǔ)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)于2013年11—12月, 在湛江海域采集多鱗四指馬鲅與四指馬鲅樣本。所有樣本采用Motomura等(2002)形態(tài)鑒定方法進(jìn)行初步鑒定后,用于形態(tài)數(shù)據(jù)測量, 并取背部肌肉放置于 95%的酒精中, 低溫保存。觀察樣本數(shù)量和規(guī)格見表1。

表1 多鱗四指馬鲅與四指馬鲅群體觀測樣本數(shù)量和規(guī)格Tab.1 The number and size of samples of E. rhadinum and E. tridactylum populations

1.2 形態(tài)學(xué)分析

1.2.1 形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)測量與校正 測量數(shù)據(jù)分為傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)測量數(shù)據(jù)和框架形態(tài)數(shù)據(jù)兩部分。傳統(tǒng)形態(tài)數(shù)據(jù)包括全長(TL)、頭長(HL)、肛前體長(LBA)、叉長(FL)、體高(BH)、眼后頭長(PL); 并參照楊陽等(2013)的框架測量方法建立多鱗四指馬 鮁 框架定標(biāo)點(diǎn), 形態(tài)學(xué)測量參數(shù)用鋼尺和游標(biāo)卡尺測量, 精確至0.1mm, 框架數(shù)據(jù)測量圖見圖1。

1.2.2 形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)分析 為消除樣品個(gè)體規(guī)格差異對(duì)形態(tài)分析的影響, 采用Reist(1985)的方法對(duì)原始測量數(shù)據(jù)進(jìn)行校正, 校正公式為:e= exp[lnY–b(lnX–lnXL)]。其中e為校正值,Y為測量值,b為lnY與lnX的斜率,X為樣本體長,XL為所有樣本的平均體長。校正后可量性狀及框架性狀的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)運(yùn)用 SPSS(version 19.0)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

采用利用多變量方差分析方法對(duì)多鱗四指馬鲅群體及四指馬鲅群體的26個(gè)形態(tài)特征值進(jìn)行主成分分析(principal component analysis, PCA), 提取主成分,并對(duì)主成分中相關(guān)變量貢獻(xiàn)率進(jìn)行分析。

圖1 多鱗四指馬鲅與四指馬鲅的框架測量圖(楊陽等,2013)Fig.1 The framework measurement diagram of E. rhadinum andE. tridactylum

應(yīng)用逐步判別法對(duì)多鱗四指馬鲅及四指馬鲅群體進(jìn)行判別分析(discriminant analysis)。

判別準(zhǔn)確率的計(jì)算公式為:

判別準(zhǔn)確率P1=(O/M)×100%;

式中:O=該群體判別正確的尾數(shù),M=該群體實(shí)際尾數(shù),Ai=第i個(gè)群體中判別正確的尾數(shù),Bi=第i個(gè)群體中的實(shí)際尾數(shù),k=群體數(shù)。將校正數(shù)據(jù)在 SPSS 19.0軟件運(yùn)用逐步判別法進(jìn)行判別分析, 構(gòu)建2個(gè)群體的判別函數(shù)。

1.3 簡化基因組測序

采用蛋白酶 K和苯酚/氯仿法提取基因組 DNA(馬洪雨等, 2006), 以半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)(GC含量40.81%)作為參考基因組設(shè)計(jì)酶切方案。分別取多鱗四指馬鲅和四指馬鲅基因組DNA各500 ng,加 0.6 UMseI (NEB, Hitchin, Herts, UK)、T4 DNA 連接酶(NEB)、ATP (NEB)和MseI接頭(NEB)在 37℃下反應(yīng)15 h, 65℃退火1 h, 然后加限制性內(nèi)切酶HaeIII和BfaI在37℃下反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后用Quick Spin column (Qiagen)純化酶切產(chǎn)物。

以回收的酶切產(chǎn)物為模板進(jìn)行 PCR反應(yīng), 反應(yīng)體系 25μL, 包括模板 DNA 100ng、10×buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、5U的Taq DNA合成酶(NEB)0.3 μL、10 μmol/LMseI引物 2 μL、ddH2O 加至 25 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (Omega)純化后,加入MseI、T4 DNA連接酶、ATP及Solexa接頭, 37℃下反應(yīng)5 h。利用Quick Spin Column (Qiagen)純化產(chǎn)物, 2%瓊脂糖膠電泳, 并以其為模板, 在含Phusion Master Mix (NEB)和Solexa引物混合物中進(jìn)行 PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后用 Illumina GAIIx(Illumina, San Diego, CA, USA)測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩群體形態(tài)差異分析

2.1.1 可數(shù)性狀比較 從外部形態(tài)特征比較, 多鱗四指馬鲅無梨骨齒板, 胸鰭基部有黑色斑塊, 側(cè)線鱗83—97, 側(cè)線上鱗12—14, 側(cè)線下鱗15—17; 四指馬鲅有梨骨齒板, 胸鰭基部有黃色斑塊, 側(cè)線鱗71—79, 側(cè)線上鱗 9—12, 側(cè)線下鱗 13—15。兩群體可數(shù)性狀特征比較如表2所示。

表2 多鱗四指馬鲅與四指馬鲅群體形態(tài)特征比較Tab.2 The morphological comparison between E. rhadinum and E. tridactylum populations

2.1.2 主成分分析 對(duì)多鱗四指馬鲅群體與四指馬鲅群體的形態(tài)測量數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析, 共提取了 7個(gè)主成分, 累積貢獻(xiàn)率為 96.112%, 其中前三個(gè)主成分貢獻(xiàn)率分別為28.759%、21.467%、15.469%, 累計(jì)貢獻(xiàn)率 65.695%。在第一主成分中 D1-2、D1-4、D5-8、D6-8、D6-9、D7-9、D7-10、D7-11 的負(fù)荷絕對(duì)值較大, 主要反應(yīng)的是魚體頭部、后半部分體側(cè)及尾柄部特征; 第二主成分中頭長、叉長、肛前體長、眼后頭長、D9-11的負(fù)荷絕度值較大, 主要反應(yīng)的是魚體頭尾軸特征; 第三主成分中D3-4 、D3-5、D3-8、D4-8的負(fù)荷絕對(duì)值較大, 反應(yīng)的是魚體前半部體側(cè)的形態(tài)特征(詳見表3)。

圖 2為多鱗四指馬鲅與四指馬鲅群體形態(tài)分析前兩個(gè)主成分的散點(diǎn)圖, 從散點(diǎn)圖分析, 利用前兩個(gè)主成分可將多鱗四指馬鲅群體與四指馬鲅群體進(jìn)行劃分, 并且2個(gè)群體在主成分1坐標(biāo)軸上的差異比主成分2坐標(biāo)軸的差異顯著。

2.1.3 判別分析 本研究利用逐步判別方法, 對(duì)2個(gè)群體野形態(tài)比例性狀進(jìn)行判別分析。根據(jù)逐步判別法, 篩選變量, 從特征性狀中帥選出 PL、D9-11、D5-8、D6-8四個(gè)特征值進(jìn)行判別分析, 綜合判定準(zhǔn)確率即可達(dá)到 100%, 該判別函數(shù)對(duì)于兩物種的形態(tài)鑒定提供了重要參考。利用個(gè)形態(tài)特征值構(gòu)建了多鱗四指馬鲅群體與四指馬鲅群體的判別函數(shù), 其判別公式如下:

其中,X1—X4分別代表 PL、D9-11、D5-8、D6-8。將判別函數(shù)帶入多鱗四指馬鲅與四指馬鲅群體進(jìn)行檢驗(yàn), 綜合判定準(zhǔn)確率為100%(表4)。

2.2 兩群體遺傳位點(diǎn)差異分析

2.2.1 SLAF標(biāo)簽信息統(tǒng)計(jì) 利用多鱗四指馬鲅及四指馬鲅樣本總共開發(fā)出 SLAF標(biāo)簽數(shù)為 140973個(gè), 多鱗四指馬鲅樣品得到SLAF標(biāo)簽109005個(gè), 四指馬鲅樣本得到SLAF標(biāo)簽 93036個(gè)。其中, 多鱗四指馬鲅與四指馬鲅共有SLAF標(biāo)簽33428個(gè)。圖3顯示對(duì)兩份樣本得到的140973個(gè)SLAF標(biāo)簽進(jìn)行分型,最終得到 3種類型的 SLAF標(biāo)簽, 包括重復(fù)序列(Repeat) 9619個(gè)(6.82%), 多態(tài)性標(biāo)簽(Marker) 32216個(gè)(22.85%), 非多態(tài)標(biāo)簽(No Poly) 99138個(gè)(70.32%)。根據(jù)開發(fā)得到的32216個(gè)Marker, 利用GATK進(jìn)行基于2個(gè)樣品的群體內(nèi)部SNP以及INDEL檢測。多鱗四指馬鲅及四指馬鲅樣品之間共開發(fā)出 SNP 68992個(gè), InDel 12884個(gè)。

表3 2個(gè)群體形態(tài)變量主成分分析中的因子負(fù)荷矩陣的特征向量及累計(jì)貢獻(xiàn)率Tab.3 Eigenvectors and cumulative contribution rates of factor loadings in principal component analysis on morphological variation in two populations

2.2.2 SNP及InDel信息統(tǒng)計(jì) 表5所示利用簡化基因組測序技術(shù), 開發(fā)出多鱗四指馬鲅與四指馬鲅SNP 69207個(gè), 其中轉(zhuǎn)換類型中: C/T 22458個(gè)(32.45%), A/G類型 22173個(gè)(32.04%); 顛換類型中A/T 7900 (11.42%); A/C 6171 (8.92%); T/G 6040(8.73%); C/G 4465 (6.45%)。

多鱗四指馬鲅樣本和四指馬鲅樣本之間總共開發(fā)出 12884個(gè) InDel, 包含轉(zhuǎn)化類型 773個(gè)(6.00%),顛換類型8031個(gè)(62.33%), 樣品中雜合類型4080個(gè)(31.67%)。

3 討論

3.1 多鱗四指馬鲅與四指馬鲅形態(tài)學(xué)分析

圖 2 2個(gè)群體形態(tài)特征前兩個(gè)主成分分布圖Fig.2 The distribution of first 2 principal components in morphological indices of the two populations

表4 多鱗四指馬鲅與四指馬鲅群體判別分析結(jié)果Tab.4 The discrimination results between E. rhadinum and E.tridactylum populations

表5 2個(gè)群體間SNP類型統(tǒng)計(jì)Tab.5 The statistical results of SNP type between E. rhadinum and E. tridactylum populations

早在 19世紀(jì), 研究學(xué)者 Bleeker(1862)開始對(duì)多鱗四指馬鲅進(jìn)行分類鑒定, 將其鱗片大小、有無犁骨齒板等定義為區(qū)分四指馬鲅屬魚類的主要形態(tài)特征。Motomura等(2002)利用測定魚體可量性狀、可數(shù)性狀以及外部典型特征區(qū)分四指馬鲅屬多鱗四指馬鲅、四指馬鲅、三趾四指馬鲅三個(gè)物種。但傳統(tǒng)的魚類形態(tài)學(xué)研究參數(shù)主要遵循Hubbs等(1947)提出的在魚體頭尾軸及背腹軸水平及垂直方向的測定方法, 而框架測量法利用魚體的解剖學(xué)同源坐標(biāo)點(diǎn), 可有效反映魚體縱向、斜向和中間部分的許多信息(Ergudenet al,2005)。目前國內(nèi)外已廣泛開展了利用多變量形態(tài)學(xué)方法對(duì)魚類形態(tài)差異的比較研究, 如狼鱸(Dicentrarchus labrax) (Ergudenet al, 2005)、澳洲鮐(Scomber australasicus) (Tzeng, 2004)、鯔魚(Mugil cephalus) (劉建勇等, 2009)等, 均得到較好的判定效果。

從主成分分析結(jié)果來看, 多鱗四指馬鲅與四指馬鲅形態(tài)差異主要集中體現(xiàn)在魚體頭背部、尾柄部、頭尾軸及背腹軸的特征上。兩群體形態(tài)特征差異與棲息的水域環(huán)境及游泳運(yùn)動(dòng)相關(guān), 以適應(yīng)其生活環(huán)境及洄游、攝食等生活習(xí)性。其中背腹軸及頭尾軸差異影響了魚體的體型特征, 頭尾軸長、背腹軸短的魚類體形為紡錘型, 在水中游動(dòng)阻力小, 承受水壓能力強(qiáng),更適宜在水流湍急的環(huán)境中游動(dòng); 尾柄則起到平衡及前進(jìn)助推的作用; 而魚體頭背部形狀對(duì)其游泳速度可產(chǎn)生影響。目前已有研究資料報(bào)道, 多鱗四指馬鲅與四指馬鲅主要棲息在河口近岸(Motomuraet al,2002), 多鱗四指馬鲅具有生殖洄游習(xí)性, 幼魚在河口索餌育肥(陳淵戈等, 2011; 龔小玲等, 2011)。多鱗四指馬鲅與四指馬鲅具有紡錘型體形, 對(duì)兩種群適宜沿岸近海水流湍急的棲息環(huán)境及洄游習(xí)性具有重要意義。目前關(guān)于多鱗四指馬鲅及四指馬鲅背景資源缺乏, 后續(xù)可結(jié)合兩個(gè)物種資源調(diào)查數(shù)據(jù)對(duì)兩種群的棲息地、生活習(xí)性、攝食方式等開展進(jìn)一步的研究。

本研究利用 4個(gè)形態(tài)特征值建立了多鱗四指馬鲅與四指馬鲅判別函數(shù), 判別函數(shù)經(jīng)回代檢驗(yàn)綜合判別準(zhǔn)確率達(dá)到 100%, 相比傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定, 該方法更加全面反映多鱗四指馬鲅與四指馬鲅的形態(tài)差異。趙峰等(2011)利用4個(gè)形態(tài)參數(shù)將三種鯧魚100%予以區(qū)分; 王新安等(2008)利用多元分析方法建立七帶石斑魚不同地理群體的判別函數(shù), 綜合判定準(zhǔn)確率同樣達(dá)到了100%。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)及框架數(shù)據(jù)進(jìn)行多變量分析是一種理想的形態(tài)學(xué)鑒定方法。

3.2 兩群體遺傳位點(diǎn)差異分析

由于生物形態(tài)是物種多個(gè)性狀的集合, 是遺傳因子和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。因此分析及鑒定多鱗四指馬鲅與四指馬鲅種群差異, 應(yīng)在形態(tài)學(xué)判定的基礎(chǔ)上, 結(jié)合兩群體遺傳結(jié)構(gòu)差異, 進(jìn)一步進(jìn)行比較研究。目前開發(fā)SNP標(biāo)記的方法很多, 但大多技術(shù)繁瑣、成本高。SLAF-seq技術(shù)是基于生物信息學(xué)、高通量測序儀等的高度自動(dòng)化技術(shù), 獲得的海量序列信息可滿足任何密度的全基因組分布, 以實(shí)現(xiàn)候選功能區(qū)域的精細(xì)定位, 數(shù)字化信號(hào)和高覆蓋保證了獲得標(biāo)簽的準(zhǔn)確性, 高通量分子標(biāo)記開發(fā)成本低于常規(guī)分子標(biāo)記, 可以一次性獲得大量的特異 DNA序列, 為開發(fā)大量的特異分子標(biāo)記提供了序列基礎(chǔ)。據(jù)北京百邁客公司統(tǒng)計(jì), SLAF-seq技術(shù)開發(fā)分子標(biāo)記的平均成本不到 AFLP技術(shù)的 1/8, 而其效率卻高近 27倍, 與轉(zhuǎn)錄組技術(shù)相比在也可以較低成本獲得大量標(biāo)記?？梢? 利用 SLAF-seq技術(shù)開發(fā)四指馬鲅屬魚類特異分子標(biāo)記具有很高的重復(fù)性、特異性及實(shí)用性。目前, 國內(nèi)外尚無多鱗四指馬鲅與四指馬鲅遺傳差異相關(guān)報(bào)道, 本研究利用 SLAF-seq技術(shù)首次對(duì)四指馬鲅屬兩個(gè)重要經(jīng)濟(jì)物種進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)差異分析, 挖掘出兩近似種遺傳結(jié)構(gòu)上存在的大量差異位點(diǎn), 大大降低了試驗(yàn)成本, 由于方法原理差異, 本研究得出四指馬鲅屬兩種魚類的 SNP位點(diǎn)轉(zhuǎn)換的概率遠(yuǎn)大于顛換概率, 此結(jié)果與利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)開發(fā)鯉魚(Cyprinus carpio) (Li et al, 2015)SNP結(jié)果不同。本研究為后續(xù)開發(fā)多鱗四指馬鲅與四指馬鲅共顯性分子標(biāo)記, 在遺傳結(jié)構(gòu)上進(jìn)行物種鑒定提供有力的基礎(chǔ)研究參考, 也對(duì)開發(fā)四指馬鲅屬魚類相關(guān)功能基因、群體遺傳學(xué)、基因組作圖、物種間比較基因組學(xué)等研究具有重要意義。

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