陳 蕾 李超倫① 趙增霞 劉夢壇

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049;3. 海洋國家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071; 4. 山東膠州灣海洋生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測研究站 青島 266071)

中肋骨條藻和三角褐指藻是廣泛分布于近岸海域, 并在諸多海域有赤潮記錄的硅藻(霍文毅等, 2001;林鳳翱等, 2008; 許翠婭等, 2010; 梁瑜, 2010), 兩者均是植食性動物的常見餌料(李捷等, 2005, 2007; 李超倫等, 2007), 其元素組成對植食性動物具有重要的影響。目前, 關(guān)于 N/P比失衡對兩種硅藻影響的研究大多集中在不同N/P比條件下浮游植物生長狀況以及脂肪酸等某些化合物組成變化的方面(李荷芳等, 2000;廖啟斌等, 2000; 蔣冰飛等, 2007; 張玉君, 2010), 少見關(guān)于微藻元素組成變化的報道(李鐵等, 2000)。實(shí)驗(yàn)同時測定培養(yǎng)液營養(yǎng)鹽變化的研究更為少見。因此,本文以這兩種硅藻為實(shí)驗(yàn)對象, 分析了培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液營養(yǎng)鹽含量的變化, 探究了其在 N/P比失衡培養(yǎng)條件下的元素(C、N、P)組成變化, 以期為N/P比失衡對微藻元素組成及其影響的研究提供基礎(chǔ)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 藻種預(yù)培養(yǎng)

三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum (PT)和中肋骨條藻 Skeletonema costatum (SC), 在溫度為 20°C±0.5°C, 光暗比(L/D)為12h︰12h, 光照為4000 lx條件下用f/2培養(yǎng)液培養(yǎng)至指數(shù)生長期備用。培養(yǎng)所用海水為取自青島匯泉灣附近的自然海水, 經(jīng)孔徑為0.20μm的混合纖維濾膜過濾, 煮沸滅菌, 室溫冷卻后備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將微藻在正常(自然海水按照f/2培養(yǎng)基要求, 添加各培養(yǎng)液; 定義為對照組, 簡稱為C組)、高N/P(自然海水按照f/2培養(yǎng)基要求, 添加除PO43–-P之外的各培養(yǎng)液; N/P＞16, 定義為高 N/P組, 簡稱 P組)和低N/P(自然海水按照f/2培養(yǎng)基要求, 添加除NO3–-N之外的各培養(yǎng)液; N/P＜16, 定義為低N/P組, 簡稱N組)三種條件下進(jìn)行培養(yǎng)。接種濃度均為3μgC/mL。

每處理組設(shè)置3個重復(fù)。在上述三種條件下, 培養(yǎng) 5天(微藻處于正常生長平臺期), 搖勻后, 取部分藻液, 抽濾到GF/F玻璃纖維膜(馬弗爐450°C灼燒5h,酸洗后烘干)上收集藻細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)至15天(不添加營養(yǎng)鹽, 微藻部分死亡), 同樣方法收集藻細(xì)胞。樣品經(jīng)–50°C冷凍干燥48h后保存, 用以測定微藻細(xì)胞的C、N和P含量。同時, 濾出的水樣于–20°C保存, 用以測定培養(yǎng)液中各營養(yǎng)鹽的含量。

碳氮元素的測定使用元素分析儀(德國 elementar公司, EL), 樣品經(jīng)稱重和錫舟包覆后進(jìn)樣分析。另將用于測定磷元素含量的樣品稱重, 置于 100mL燒杯中, 加入硝酸高氯酸于電熱板加熱消解, 后定容至25mL, 在 ICP等離子發(fā)射光譜儀(Thermo Fisher Scientific)上對磷元素含量進(jìn)行分析測定。營養(yǎng)鹽含量(NO3–-N、NH4+-N、NO2–-N 和 PO43–-P)的測定使用全自動海水營養(yǎng)鹽分析儀(QuAAtro, Bran+Luebbe GmbH Co.)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用極差, 以計算微藻在三種培養(yǎng)條件下, 元素化學(xué)計量比的變異程度。計算公式為: 極差=最大值–最小值。

采用SPSS16.0對各處理組間進(jìn)行差異性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 N/P比失衡條件下微藻培養(yǎng)液營養(yǎng)鹽含量的變化

三角褐指藻的可溶性總氮(DIN, NO3–-N、NH4+-N和NO2–-N的總稱)在對照組中, 隨時間的變化趨勢(0天＞5天＞15天)與中肋骨條藻的變化趨勢(0天＞5天＞15天)一致; 高N/P組和低N/P組也表現(xiàn)出了相同的一致性(圖1a)。但DIN隨時間的變化趨勢在三處理組間表現(xiàn)出了差異性。對照組的 DIN濃度隨時間逐漸降低; 培養(yǎng)5天到15天, 高N/P組和低N/P組的DIN濃度變化較小。高N/P組因DIP的缺少影響到了微藻對DIN的吸收。

（1）系統(tǒng)為存儲應(yīng)用程序中的所有數(shù)據(jù)訪問提供實(shí)時審核。我們使用電子數(shù)據(jù)文件作為數(shù)據(jù)單元，對數(shù)據(jù)對象的所有操作進(jìn)行審計，并使用區(qū)塊鏈進(jìn)行記錄。通過這種方式，可以收集和監(jiān)測控制所有電子數(shù)據(jù)訪問情況。

三種培養(yǎng)條件下, 兩種硅藻的可溶性磷(DIP, 文中指 PO43–-P)隨時間的變化趨勢均表現(xiàn)出了一致性(圖1b)。培養(yǎng)5天與15天, 對照組的DIP濃度相近;而高N/P組和低N/P組的DIP濃度隨時間逐漸降低。與DIN不同的是, 低N/P組DIN的缺少對DIP的吸收影響較小。

三角褐指藻和中肋骨條藻培養(yǎng)液的 DIN/DIP值在對照組的變化趨勢均為 0天＜15天＜5天。高 N/P組表現(xiàn)出了與對照組不同的變化趨勢, 由于DIP值在15天時持續(xù)的降低, 使得DIN/DIP值在15天時高于5天時。而低N/P組由于DIN15天時較5天時沒有較大的變動, 使得 DIN/DIP15天時并不比 5天時降低,反而升高。

2.2 N/P比失衡對兩種硅藻C、N、P化學(xué)計量比的影響

2.2.1 N/P比失衡對兩種硅藻C/P值的影響 研究發(fā)現(xiàn)(圖2a)N/P比失衡的培養(yǎng)條件(對照組、高N/P組和低 N/P組)影響了兩種硅藻的 C/P值; 且不同硅藻經(jīng)過不同時間的培養(yǎng)后, 其C/P值的變動幅度(3處理組C/P值的極差表示)也不同。

圖1 N/P比失衡條件下, 微藻培養(yǎng)液營養(yǎng)鹽含量(μmol/L)的變化Fig.1 In the changes in the nutrient content of the culture under N/P ratio imbalance conditions

三角褐指藻在三種培養(yǎng)條件下, 培養(yǎng)5天的C/P值變化趨勢為 P 組(704.994)＞C 組(139.030)＞N 組(53.543), 三者間存在極顯著差異(P＜0.01); 三者的極差為651.451。培養(yǎng)15天后, 趨勢為P組(1118.625)＞C組(226.698)＞N 組(76.259), 三者間存在極顯著差異(P＜0.01); 極差為 1042.366。高 N/P培養(yǎng)條件使三角褐指藻的 C/P值顯著增加; 隨培養(yǎng)時間的增長, 其C/P值變動幅度增大。

中肋骨條藻的三個處理組的 C/P值變化趨勢略有不同。其培養(yǎng) 5天的 C/P值變化趨勢為 P組(193.578)＞N 組(83.520)＞C 組(58.869), 三者間存在極顯著差異(P＜0.01); 極差為134.709。培養(yǎng)15天后, 趨勢為 P 組(195.348)＞N 組(123.701)＞C 組(105.257), 三者間存在極顯著差異(P＜0.01); 極差為 90.091。中肋骨條藻的C/P值在高N/P培養(yǎng)條件下顯著增加; C/P值變動幅度隨時間的增長具有減少的趨勢, 且表現(xiàn)出了比三角褐指藻更強(qiáng)的穩(wěn)定性。

2.2.2 N/P比失衡對兩種硅藻 C/N值的影響 圖2b顯示, 三角褐指藻在培養(yǎng)5天后, C/N值的變化趨勢為N組(8.437)＞P組(8.180)＞C組(4.844), 三者間存在極顯著差異(P＜0.01), 三者極差為 3.598。培養(yǎng) 15天后, 變化趨勢為 P組(12.127)＞N 組(9.208)＞C 組(6.219), 三者間存在極顯著差異(P＜0.01); 極差為5.908。

中肋骨條藻在培養(yǎng)5天后, 該值變化趨勢為N組(5.768)＞P組(5.260)＞C 組(4.719), 三者間存在極顯著差異(P＜0.01); 極差為 1.048。培養(yǎng) 15天后趨勢為 N組(9.219)＞C 組(6.274)＞P組(4.918), 三者間存在極顯著差異(P＜0.01); 極差為4.301。

兩種硅藻在低N/P培養(yǎng)條件下, C/N值均顯著增加; 該值變動幅度隨時間的增長都表現(xiàn)出增大的趨勢, 但中肋骨條藻的C/N值表現(xiàn)出更強(qiáng)的穩(wěn)定性。

2.2.3 N/P比失衡對兩種硅藻N/P值的影響 培養(yǎng)5天后的三角褐指藻, 其N/P值變化趨勢為: 趨勢為P組(85.216)＞C 組(28.669)＞N 組(6.384), 三者間存在極顯著差異(P＜0.01); 極差為78.832(圖2c)。培養(yǎng)15天后, 趨勢為 P 組(92.860)＞C 組(36.118)＞N 組(8.343),三者間存在極顯著差異(P＜0.01); 極差為84.518。

中肋骨條藻培養(yǎng) 5天后, 變化趨勢為 P組(36.840)＞N 組(14.228)＞C 組(12.463), 三者間存在極顯著差異(P＜0.01); 極差為24.378。培養(yǎng)15天后, 趨勢為P組(40.096)＞C組(16.791)＞N組(13.256), 三者間存在極顯著差異(P＜0.01); 極差為26.841。

各種 N/P比失衡培養(yǎng)條件中, 均以高 N/P組的N/P值最高。兩種硅藻的N/P值變動幅度隨時間的增長都表現(xiàn)出增大的趨勢, 但中肋骨條藻的N/P值表現(xiàn)出更強(qiáng)的穩(wěn)定性。

2.3 N/P比失衡對兩種硅藻元素含量的影響

結(jié)果顯示(圖 3)同種硅藻在N/P比失衡的培養(yǎng)條件下, P含量的變化幅度均大于N含量, P含量表現(xiàn)出了更強(qiáng)的不穩(wěn)定性。

圖2 三角褐指藻P. tricornutum (PT)和中肋骨條藻S.costatum (SC)在三種條件下(對照組、高N/P組和低N/P組)培養(yǎng)5天和15天, 藻體的C/P值(a)、C/N值(b)、N/P值(c)Fig.2 Changes in algae body chemical composition of P.tricornutum (PT) and S. costatum (SC) after 5 and 15 d cultures in three groups (the control, high N/P, and low N/P)a: C/P ratio; b: C/N ratio; c: N/P ratio

培養(yǎng)5天后, 三角褐指藻的P含量最高組(低N/P組, 0.471%)是最低組(高N/P組, 0.047%)的10.0倍。而N含量最高組(對照組, 2.770%)僅是最低組(低N/P組, 1.363%)的2.0倍。同樣, 三角褐指藻經(jīng)15天培養(yǎng)后, P含量最高組(低N/P組, 0.328%)是最低組(高N/P組, 0.029%)的 11.4倍。而 N含量的最高組(對照組,1.800%)僅是最低組(高N/P組, 1.203%)的1.5倍?？傊? 三角褐指藻在相同培養(yǎng)條件下, P含量的不穩(wěn)定性比N含量高。

中肋骨條藻經(jīng)培養(yǎng)5天后, P含量最高組(低N/P組, 0.540%)是最低組(高N/P組, 0.164%)的3.3倍。而N含量的最高組(對照組, 2.853%)僅是最低組(低N/P組, 2.607%)的1.1倍。培養(yǎng)15天后, P含量最高組(對照組, 0.282%)是最低組(高N/P組, 0.105%)的2.7倍。而N含量最高組(對照組, 2.140%)僅是最低組(低N/P組, 1.563%)的1.4倍。中肋骨條藻的P含量在N/P比失衡的培養(yǎng)條件下, 也表現(xiàn)出了更強(qiáng)的不穩(wěn)定性。

圖3 三角褐指藻P. tricornutum (PT)和中肋骨條藻S.costatum (SC)在三種條件下(對照組、高N/P組和低N/P組)培養(yǎng)5天和15天, 藻體的C含量(a)、N含量(b)和P含量(c)Fig.3 Changes in algae body chemical composition of P.tricornutum (PT) and S. costatum (SC) after 5 d and 15 d cultures in three groups (the control, high N/P, and low N/P)a: C content; b: N content; c: P content

3 討論

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看, N/P比失衡(對照組、高N/P組和低 N/P組)的培養(yǎng)條件影響了兩種硅藻的 C/P、C/N和N/P值。高N/P比條件下, C/P值較對照組大幅度增加; 低N/P比條件下, C/N值較對照組大幅度增加。這與相關(guān)研究的結(jié)果一致。例如, Jensen等(2004)發(fā)現(xiàn)N/P比失衡(對照組、高N/P組和低N/P組)條件下, 斜生柵藻(Scenedesmus obliquus, 綠藻)藻細(xì)胞的元素組成(C/P、C/N和N/P值)也存在差異, 其中C/P值在高N/P組條件(626.00±23.70)下最高, C/N值在低N/P組條件(21.85±1.06)下最高, N/P值在高N/P組條件(50.79±2.24)下最高, 這與本實(shí)驗(yàn)兩種硅藻在 N/P比失衡條件下培養(yǎng) 5天的元素組成結(jié)果趨勢保持一致, 但變動幅度略有差異, 這應(yīng)該是不同實(shí)驗(yàn)藻種所造成的。Schoo等(2010)研究發(fā)現(xiàn)對照組和高N/P組培養(yǎng)條件下, 隱藻(Rhodomonas salina, 隱芽植物)的C/P值存在顯著差異(P＜0.05), 同樣, 高N/P組的值大于對照組。李鐵等(2000)使用的方法是測定過濾前后藻液的氮磷總量, 差減間接得出藻體中的氮磷含量,發(fā)現(xiàn)中肋骨條藻(Skeletonema costatum)和新月菱形藻(Nitzsehia closteztuma)的P含量在不同培養(yǎng)條件下的變動幅度要大于N含量, 這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。近半個世紀(jì)以來, 近岸部分海域營養(yǎng)鹽結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生改變(胡明輝等, 1989; Sundareshwar et al, 2003;Dyhrman et al, 2006), 偏離Redfield比。根據(jù)N/P比失衡對不同微藻元素組成影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 可以推知 N/P比失衡海區(qū)的浮游植物的元素組成可能已經(jīng)發(fā)生改變。同時, 微藻元素組成的改變影響其自身營養(yǎng)物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、脂肪酸等)的含量(Brown et al,1997; 張玉君, 2010; Lai et al, 2011; Koch et al, 2012),使得植食者的食物品質(zhì)下降, 對不同植食者的生長產(chǎn)生不同程度的影響(Urabe et al, 2003; Urabe et al,2009; Schoo et al, 2013)。在未來幾十年, 這可能會使海洋生物群落發(fā)生緩慢演替, 進(jìn)而對整個生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響(陳蕾等, 2014)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示中肋骨條藻的元素組成(C/P、C/N和N/P值)在對照組、高N/P組和低N/P組培養(yǎng)條件下的變動幅度均小于三角褐指藻, 即N/P比失衡對中肋骨條藻的影響較三角褐指藻要小。因此, 從元素組成方面來看, 海區(qū)以中肋骨條藻為餌料的植食者受到 N/P比失衡的影響要小于以三角褐指藻為餌料的植食者。目前海區(qū)浮游植物元素組成的研究尚少,后續(xù)的相關(guān)研究需要進(jìn)行大量工作, 以積累海區(qū)的基礎(chǔ)資料(陳蕾等, 2014)。另外, 結(jié)果顯示中肋骨條藻在高 N/P組條件下培養(yǎng) 5天和 15天后的元素組成(C/P、C/N和N/P值)均無顯著差異, 而在對照組條件下培養(yǎng)的元素組成(C/P、C/N和N/P值)均存在顯著差異。可推測中肋骨條藻在磷不足海區(qū)死亡后對海水營養(yǎng)結(jié)構(gòu)的調(diào)整作用下降, 同時對有機(jī)碎屑的元素組成造成了干擾。

本研究發(fā)現(xiàn), 同種硅藻的P含量較N含量表現(xiàn)出了更強(qiáng)的不穩(wěn)定性; 高N/P組的DIN含量因培養(yǎng)液中PO43–-P的不足受到影響, 而低N/P組的DIP含量并沒有受到DIN不足的影響。由此, 可以認(rèn)為微藻生長對P的限制作用更敏感。孫育平等(2011)認(rèn)為高N/P組對生物量的影響比低N/P組更為敏感, 從另一方面證實(shí)了上述結(jié)論。一般認(rèn)為, P匯集的主要單位是RNA(Sterner et al, 2002), 海洋物種N庫中蛋白質(zhì)含量最高, 其次為氨基酸(Ventura, 2006)。而蛋白質(zhì)多組成有機(jī)體的固有結(jié)構(gòu), 這可能是 N含量表現(xiàn)出更強(qiáng)穩(wěn)定性的原因。同時, 由于RNA控制著蛋白質(zhì)合成,因此P也在一定程度上影響了有機(jī)體對N的吸收。另外, 培養(yǎng)15天各實(shí)驗(yàn)組DIN和DIP的消耗速率均低于相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)5天的消耗速率, 這說明部分微藻細(xì)胞的死亡裂解釋放出營養(yǎng)鹽, 補(bǔ)充了培養(yǎng)液營養(yǎng)鹽的消耗。

4 結(jié)語

綜上所述, 在N/P比失衡的條件下, 兩種硅藻的C、N、P含量以及 C/P、C/N、N/P值均發(fā)生變化。這些元素組成的變化勢必會沿食物鏈向上傳遞(Boersma et al, 2008), 進(jìn)而對生態(tài)系統(tǒng)的生源要素循環(huán)產(chǎn)生影響, 甚至?xí)绊懙秸麄€生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能(陳蕾等, 2014)。同時, 研究發(fā)現(xiàn)N/P比失衡培養(yǎng)條件下, 培養(yǎng)液DIN濃度和DIP濃度產(chǎn)生不同程度的變化。浮游植物在海區(qū)的生物量較大, 尤其赤潮海域,其對營養(yǎng)鹽的消耗將加劇或者緩和營養(yǎng)限制, 對水體營養(yǎng)鹽結(jié)構(gòu)產(chǎn)生巨大影響。因此, 在當(dāng)前近海富營養(yǎng)化日趨嚴(yán)重情況下, 既需要關(guān)注水體氮、磷等失衡對浮游植物群落演替的影響, 同時也要關(guān)注浮游植物本身生源要素的改變及其沿食物網(wǎng)的級聯(lián)效應(yīng),為深入了解富營養(yǎng)化影響下海洋生態(tài)系統(tǒng)的演變規(guī)律與趨勢提供一個新的視角。

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