實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測核桃根際土壤生防菌Bacillusamyloliquefaciens和Trametesversicolor的定殖

鄭磊, 張靜, 彭燕, 麻文建, 朱天輝*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,四川 雅安 625014)

摘要以鐵核桃根腐病為研究對象,運用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴增技術(shù),分別對鐵核桃根際土壤中解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和白腐菌(Trametes versicolor)2種生防菌及腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)病原菌的數(shù)量動態(tài)變化進行研究。結(jié)果表明:2種生防菌在接種后短期內(nèi)都能夠迅速生長繁殖,B. amyloliquefaciens相對含量在第20天達(dá)到峰值,20 d后呈下降趨勢,40 d后趨于穩(wěn)定,而T. versicolor在各時期的相對含量變化均較前者延遲10 d;60 d后,在施入B. amyloliquefaciens和T. versicolor的根際土壤中F. solani的相對含量極顯著降低;在生防菌的相對含量達(dá)到峰值時,B. amyloliquefaciens與其對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),T. versicolor則差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);定殖穩(wěn)定后,B. amyloliquefaciens與其對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),T. versicolor對照組與其相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),2種生防菌在鐵核桃根際土壤中均有很強的生防效果和定殖能力,生防效果為B. amyloliquefaciens>T. versicolor,定殖能力為B. amyloliquefaciens>T. versicolor。該研究為由腐皮鐮刀菌引起的病害實時監(jiān)測提供了重要參考,同時為2種生防菌在土壤中的定殖檢測提供了有力的技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng); 腐皮鐮刀菌; 解淀粉芽孢桿菌; 白腐菌

中圖分類號Q 936; S 763.1文獻標(biāo)志碼A

基金項目:國家自然科學(xué)基金(31260063;31260297)。

收稿日期(Received):2014-10-08;接受日期(Accepted):2015-02-03;網(wǎng)絡(luò)出版日期(Published online):2015-05-19

Detection of real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction for colonization ofBacillusamyloliquefaciensandTrametesversicolorinJuglanssigllataDode rhizosphere soil. Journal of ZhejiangUniversity(Agric. & LifeSci.)， 2015，41(3):277-284

Zheng Lei, Zhang Jing, Peng Yan, Ma Wenjian, Zhu Tianhui*(CollegeofForestry,SichuanAgriculturalUniversity,Ya’an625014,Sichuan,China)

SummaryJuglanssigllataDode, is widely planted in Liangshan Prefecture of southwest China for its nuts and wood. Liangshan Prefecture is a major traditional growing area ofJ.sigllataand has unique advantages for walnut industrial development because of its good soil, climate, and availability of water. Currently there are 2.7 million hectares of walnut, contributing important incomes for farmers. In April 2013, numerousJ.sigllatawere found to be infected with root rot in the Muli County of Liangshan Prefecture. Symptoms included dried leaves, dead branches, and even death. According to the cultural characteristics, the fungus was primarily identified asFusariumsolaniand it could cause the root rot on many industrial crops.Fusariumsolanicould be significantly antagonized byBacillusamyloliquefaciensandTrametesversicolor.

In order to control the plant diseases caused byF.solani,B.amyloliquefaciensandT.versicolorwere chosen for testing the efficiency of the colonization in rhizosphere soil ofJ.sigllata. With the development of real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) technology, more attention was paid on this issue. It was highly efficient, sensitive and specific technology and had been widely used in various fields of scientific research. For the research of the root rot ofJ.sigllata, the dynamic changes of two kinds of biocontrol strains and the pathogen in rhizosphere soil were studied through the method of real-time fluorescence quantitative PCR.

The results showed that biocontrol strains multiplied rapidly after inoculation, and the relative content ofB.amyloliquefaciensreached the peak at the 20th day. Then, the relative content ofB.amyloliquefacienswas declined, and kept stable after the 40th day. But the time when the relative content ofT.versicolorshowed the growth peak and stabilization at each stage was delayed for 10 d as compared withB.amyloliquefaciens. After 60 days, the relative contents ofF.solaniin rhizosphere soil inoculated withB.amyloliquefaciensandT.versicolorwere reduced significantly when the relative content of biocontrol strains reached the peak. The difference in the content ofB.amyloliquefacienswas significant between the treatment with or without inoculatingB.amyloliquefaciens, while more distinctions of the content ofT.versicolorbetween the treatment with or without inoculatingT.versicolor. When the colonization was stabilized, the content ofB.amyloliquefacienshad no significant difference compared with the control, while the content ofT.versicolorwas significant between the two treatments.

All above indicate that the biocontrol efficiency and the colonization ability ofB.amyloliquefaciensare superior thanT.versicolor. This study can provide real-time monitoring of diseases caused byF.solaniand support the detection of the colonization ofB.amyloliquefaciensandT.versicolorin rhizosphere soil.

Key wordsreal-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction;Fusariumsolani;Bacillusamyloliquefaciens;Trametesversicolor

腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)可引起油橄欖根腐病[1]、黃豆根腐病[2]、菜豆根腐病[3]、龍蒿根腐病[4]、藍(lán)莓根腐病[5]、甘薯根腐病[6]、蘆薈根腐病[7]、烏拉爾甘草根腐病[8]等,還可引起一些植物的果實腐爛,如甜辣椒果腐病[9]。筆者于2013年4月在四川省涼山州木里縣鐵核桃(JuglanssigllataDode)種植區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)由F.solani引起的大面積鐵核桃根腐病,受到病原菌侵染的植株出現(xiàn)葉片干枯、枝條死亡,甚至有些2～3年生植株死亡[10]。目前,對于根腐病的防治主要以輪作換茬法、抗病育種法以及運用最為普遍的藥劑防治法。由于我國土地資源緊缺,抗病品種的抗病能力維持時間不定且品種抗性與優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)也未統(tǒng)一,最為廣泛運用的藥劑防治產(chǎn)生環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留以及農(nóng)藥抗性等問題也十分令人擔(dān)憂,迄今為止還未找到有效地防治根腐病發(fā)生、發(fā)展的方法,因此,篩選有效的生防菌實用生物防治方法勢在必行。

生防菌株的根際定殖情況直接影響到防治根腐病發(fā)生、發(fā)展的效果。近年來,實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)得到長足發(fā)展[11-12],并且在定量檢測土壤微生物定殖研究領(lǐng)域得到廣泛運用。Hagn等[13]根據(jù)木霉核糖體內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacers,ITS)序列進行比對分析的結(jié)果,設(shè)計出了木霉特異性引物,以此建立了木霉的實時熒光定量PCR檢測體系,并利用該體系高效穩(wěn)定地檢測出土壤環(huán)境樣品的木霉含量。Klein等[14]利用實時熒光定量的方法研究鏈霉菌屬(Streptomycesspp.)，發(fā)現(xiàn)其對鐮刀屬真菌病害具有良好的抑制作用。本研究采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和白腐菌(Trametesversicolor)在核桃根際土壤中定殖的動態(tài)變化以及對病原菌F.solani的防治效果,同時也為其他土傳病害生防菌在土壤中的定殖檢測研究提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1菌株收集

T.versicolor于四川省廣元市鐵核桃苗圃土壤中分離純化得到;B.amyloliquefaciens于四川省廣元市鐵核桃苗圃的鐵核桃根內(nèi)分離純化得到;F.solani分離自四川省涼山州木里縣鐵核桃根內(nèi);其他供試菌株由本實驗室提供。

1.2菌液的制備

B.amyloliquefaciens菌懸液:將已活化的B.amyloliquefaciens接種于營養(yǎng)瓊脂(NA)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h,用無菌水沖洗得到B.amyloliquefaciens的菌苔液,然后接種3 mL菌苔液于已滅菌的裝有100 mL牛肉膏蛋白胨(LB)液體培養(yǎng)基的300-mL錐形瓶中,在25 ℃下140 r/min振蕩培養(yǎng)72 h,后將其制成含菌量為2×105CFU/mL的菌懸液,待用。

F.solani和T.versicolor孢子懸液:將已活化的F.solani和T.versicolor接種于PDA培養(yǎng)基上,25 ℃培養(yǎng)7 d,收集分生孢子,用無菌水稀釋成3×105CFU/mL的孢子懸液,待用。

1.3生防菌在核桃根際土壤中的定殖

供試所使用的健康、無病害、長勢相同的鐵核桃幼苗均購自四川省雅安園林花卉公司,盆栽于直徑40 cm塑料盆內(nèi),2周后統(tǒng)一采用根部刺傷法接種病原菌孢子懸液使其染病,選取感病指數(shù)相同的鐵核桃植株進行實驗。生防菌株(T.versicolor和B.amyloliquefaciens)對鐵核桃根際的侵染定殖采用灌根接種法[15]。分別取100 mL含菌量為3×105CFU/mL的B.amyloliquefaciens菌懸液和T.versicolor孢子懸液,在離土層3 cm處,從上到下,順根莖澆灌發(fā)病和未發(fā)病的健康鐵核桃植株根部,并以澆灌等量無菌水的感病植株為對照,每組處理10次重復(fù)。

1.4土壤取樣

參照Yu等[16]的方法進行鐵核桃根際土的取樣。分別于引入生防菌后1、10、20、30、40、50和60 d取樣。將不同處理的植株根從土壤中取出,用滅菌玻璃棒將大顆粒土壤去除,隨后用力抖落根部附著土,將土樣裝入無菌密封袋中,每次土樣約50 g,保存于4 ℃冰箱。

1.5DNA的提取和PCR擴增

1.5.1DNA的提取真菌的基因組DNA使用Biomiga公司生產(chǎn)的真菌DNA提取試劑盒(吸附柱型)提取。

細(xì)菌的基因組DNA提取使用Omega公司生產(chǎn)的細(xì)菌DNA提取試劑盒(吸附柱型)。

土壤總DNA的提取:將備用根際土按不同處理各自混勻,稱取1 g土壤,使用美國Mpbio公司生產(chǎn)的土壤DNA提取試劑盒(吸附柱型)進行土壤總DNA提取。

1.5.2PCR擴增和測序F.solani和T.versicolor的PCR擴增:選用ITS1/ITS4(TCCGTAGG TGAACCTGGGG/TCCTCCGCTTATTGATATG C)[13]為引物,進行PCR擴增。反應(yīng)體系:2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL(TaKaRa),引物(200 nmol/L)ITS1/ITS4 0.25 μL,模板DNA 1 μL,用ddH2O補足體積至25 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,53 ℃退火1 min,72 ℃延伸90 s,共進行30個循環(huán);72 ℃延伸5 min。使用離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TaKaRa)對PCR產(chǎn)物純化,并對PCR產(chǎn)物進行克隆測序。

B.amyloliquefaciensPCR擴增:選用細(xì)菌核糖體(16S)rDNA的通用引物27F/1492R(AGAGTTT GATCCTGGCTCAG/GGTTACCTTGTTACGACTT)進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系同上,PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸90 s,共進行30個循環(huán);72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物用PCR純化試劑盒(TaKaRa)純化、測序。

1.6實時熒光定量PCR

1.6.1引物設(shè)計根據(jù)1.5.2節(jié)的測序結(jié)果,用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計實時熒光定量PCR引物(表1),并用Oligo 7.0軟件進行評價。內(nèi)參選用Denman等[17]設(shè)計的總菌Generalbacteria特異性引物。引物由大連寶生物工程有限公司合成。

表1　引物設(shè)計信息

1.6.2特異性檢測及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以土壤總DNA為模板,利用表1所設(shè)計的特異性引物,進行總菌Generalbacteria、B.amyloliquefaciens、F.solani、T.versicolor的特異性擴增。PCR反應(yīng)體系:SYBR?PremixExTaqTMⅡ 7.5 μL,上、下游引物各0.6 μL,DNA模板1.2 μL,用ddH2O補足體積至15 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃,5 s,各引物特異退火溫度10 s,40個循環(huán);以0.5 ℃/10 s的速度從65 ℃緩慢遞增到95 ℃。所用實時熒光定量PCR系統(tǒng)為CFX96 System(Bio-Rad公司)。將PCR產(chǎn)物進行純化,連接至pUC18T載體上,轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌中,挑取轉(zhuǎn)化后平板上的白色單克隆提取質(zhì)粒DNA。測定質(zhì)粒DNA濃度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

用所設(shè)計的特異性引物F1/R1、F2/R2、F3/R3對供試菌株(表2)的基因組DNA進行常規(guī)PCR以及實時熒光定量PCR擴增,進行特異性檢測。

表2　供試菌株及各引物的特異性檢測

+:陽性;—:陰性.

+: Positive; —: Negative.

1.6.3定量PCR擴增以所提取的土壤總DNA為模板,采用表1所設(shè)計的熒光定量引物進行PCR擴增,實驗重復(fù)3次。反應(yīng)體系與條件同1.6.2節(jié)。

1.7定量數(shù)據(jù)分析

熒光定量PCR結(jié)果用Bio-Rad IQTM5軟件的比較CT法(2-ΔΔCT法)進行分析,并計算各目標(biāo)菌株在根際土壤中的相對含量,采用SPSS 17.0軟件進行顯著性分析。

2結(jié)果

2.1特異性檢測

用所設(shè)計的特異性引物F1/R1、F2/R2和F3/R3對供試菌株(表2)的基因組DNA進行常規(guī)PCR以及實時熒光定量PCR擴增,結(jié)果表明:B.amyloliquefaciens、F.solani和T.versicolor分別擴增出約160、110和190 bp的特異性條帶,其他供試菌株均無擴增產(chǎn)物(表2),這說明所設(shè)計引物具有較強的特異性,可用于實時熒光定量PCR檢測。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

F.solani、B.amyloliquefaciens和T.versicolor的實時熒光定量PCR擴增曲線均為一組典型的倒S型曲線,擴增曲線基線平整,指數(shù)區(qū)明顯且陡度大,平臺區(qū)能匯于一起,線性范圍較寬(圖1A,B,C)。各個標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性決定系數(shù)R2分別為0.996、0.999和0.998,具有較好的線性關(guān)系,擴增效率E分別為99.3%、95.1%和100.4%,在0.9～1.1之間,擴增效率理想;另外病原菌及生防菌的實時熒光定量PCR溶解曲線分別在60 ℃、61 ℃、61 ℃左右出現(xiàn)單一熔解峰,無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物,曲線平穩(wěn),峰尖且窄,這說明各濃度質(zhì)粒的熔解溫度均一,擴增產(chǎn)物特異性好,以此為基礎(chǔ)進行定量是可靠的。

內(nèi)參Generalbacteria的實時熒光定量PCR擴增曲線為一組典型的倒S曲線,擴增曲線基線平整,指數(shù)區(qū)明顯且陡度大,平臺區(qū)能匯于一起,線性范圍較寬(圖1D)。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性決定系數(shù)為0.999,具有較好的線性關(guān)系,擴增效率為92.0,在0.9～1.1之間,擴增效率理想。

圖1　F. solani (A)、B. amyloliquefaciens (B)、 T. versicolor (C)及內(nèi)參(D)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig.1　Standard curve chart of F. solani (A), B. amyloliquefaciens (B), T. versicolor (C) and General bacteria (D)

2.3生防菌對病原菌的影響及定殖

由圖2可知,施入B.amyloliquefaciens后,鐵核桃根際土壤中F.solani的相對含量隨著時間的推移而顯著降低(P<0.05);在10～30 d期間F.solani相對含量下降極為顯著(P<0.01),即抑制作用最為明顯；60 d后,F.solani的相對含量極顯著降低,而不施入生防菌的根際土壤中F.solani的相對含量趨于平衡。由圖3可知,將B.amyloliquefaciens的菌懸液施入感病植株與健康植株后,B.amyloliquefaciens在0～20 d繁殖迅速,20 d達(dá)到最高值,20 d 后呈下降趨勢,40 d后穩(wěn)定;在第10天和第20天處理組與對照組相比根際土壤中B.amyloliquefaciens的相對含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而其他時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在定殖穩(wěn)定后,B.amyloliquefaciens在感病與健康鐵核桃根際土中相對含量大致相同。說明在有F.solani的土壤環(huán)境對其定殖影響較小。

不同大、小寫字母分別表示在P<0.01和P<0.05水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義. 　　Different capital and lowercase letters above the line graph indicate statistically significant differences at the 0.01 and 0.05 probability levels, respectively． 圖2　B. amyloliquefaciens 對F. solani病原菌的影響 Fig.2　Effect of B. amyloliquefaciens on the amount of F. solani

*表示在P<0.05水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 　　Single asterisk (*) indicate statistically significant difference at the 0.05 probability level. 圖3　B. amyloliquefaciens的數(shù)量變化 Fig.3　Amount change of B. amyloliquefaciens

由圖4可知,施入T.versicolor后,土壤中F.solani的相對含量隨著時間的推移而顯著降低,在20～40 d期間T.versicolor相對含量變化極為明顯(P<0.01),即對病原菌抑制作用最為有效,在60 d后,F.solani的相對含量極顯著降低,而不施入T.versicolor的土壤中F.solani的相對含量維持在90～120之間,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。由圖5可知,在感病植株與健康植株的根際土壤中施入T.versicolor的孢子懸液,T.versicolor的相對含量在0～20 d迅速增長,并在第30天達(dá)到最高水平,30 d后呈下降趨勢,50 d后穩(wěn)定;在第20、40、50、60天,T.versicolor的相對含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),在第30天差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而其他時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在定殖穩(wěn)定后,T.versicolor的相對含量在感病植株與健康植株的根基土壤中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且在健康植株根際土壤中T.versicolor的相對含量是感病植株根際土壤中的2.6倍,這說明在有F.solani的土壤環(huán)境對T.versicolor的定殖有較大影響。

不同大、小寫字母分別表示在P<0.01和P<0.05水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義. 　　Different capital and lowercase letters above the line graph indicate statistically significant differences at the 0.01 and 0.05 probability levels, respectively． 圖4　T. versicolor對F. solani病原菌的影響 Fig.4　Effect of T. versicolor on the amount of F. solani

*,**分別表示在P<0.05和P<0.01水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 　　Single and double asterisks (*,**) indicate statistically significant differences at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively。 圖5　T. versicolor 的數(shù)量變化 Fig.5　Amount change of T. versicolor

由圖2～5可知,在施入B.amyloliquefaciens和T.versicolor60 d后,鐵核桃根際土壤中F.solani的相對含量極顯著降低,然而施入B.amyloliquefaciens比施入T.versicolor根際土壤中F.solani的相對含量降低幅度更大.由此可知:生防效果:B.amyloliquefaciens>T.versicolor;定殖穩(wěn)定后,B.amyloliquefaciens與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而T.versicolor施于健康植株的相對含量比施于感病植株的相對含量高,大致維持在2.6倍,定殖能力:B.amyloliquefaciens>T.versicolor。

3討論

在生防真菌中研究較多的有木霉屬真菌(Trichoderma)、叢枝菌根真菌(Arbuscularmycorrhize)、非致病鐮刀菌(F.oxysporum)、淡紫擬青霉[Paecilomyceslilacinus(Thorn.) Samson]等,其拮抗機制多種多樣,主要包括抗生、競爭、重寄生和溶菌,主要抗生機制是產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶和蛋白質(zhì)酶消解病原菌細(xì)胞壁,從而殺滅病原菌[18-20];而在生防細(xì)菌研究方面,目前發(fā)現(xiàn)有18個屬的細(xì)菌在植物土傳病害生物防治上有潛力,生防細(xì)菌的抑菌機制主要包括營養(yǎng)基質(zhì)的競爭、生態(tài)位的排斥、產(chǎn)生嗜鐵素和抗生素等,細(xì)菌在其生長環(huán)境中能分泌胞外活性物質(zhì),細(xì)菌素是其中的一大類,它具有很強的拮抗專化性。本文通過前期拮抗實驗發(fā)現(xiàn)B.amyloliquefaciens、T.versicolor都對腐皮鐮刀菌具有較為明顯的拮抗作用,是具有開發(fā)潛力的生防菌。所篩選出的B.amyloliquefaciens為核桃內(nèi)生菌,研究表明,該類菌通過非核糖體途徑合成熱穩(wěn)定性好、相對分子質(zhì)量小、含有D-氨基酸、耐受蛋白酶水解以及有機溶劑作用的脂肽類抗生素[21];該菌可通過產(chǎn)生低分子質(zhì)量抗生素以及抗菌蛋白或多肽等活性物質(zhì)而抑制植物病原菌,并且可作為根圍細(xì)菌促進植物生長[22],其產(chǎn)抗真菌物質(zhì)主要有解淀粉酶、伊枯草菌素、抗真菌蛋白、幾丁質(zhì)酶等。而T.versicolor這類真菌可分泌木質(zhì)素降解酶,其中包括木質(zhì)素過氧化物酶、漆酶等[23],主要用于造紙工業(yè),利用T.versicolor這類菌進行植物病害的生物防治研究較少。

土壤微生物的定量檢測技術(shù)主要有平板計數(shù)法和分子檢測法。平板計數(shù)法具有操作簡單、有效等優(yōu)點,是一種經(jīng)典的計數(shù)方法,但是該方法對沒有選擇性培養(yǎng)基或不能人工培養(yǎng)的微生物不能進行有效的研究,并且該技術(shù)的靈敏度較低,很難對土壤中微生物含量低于1×102CFU/g的樣品進行檢測。生防菌分子檢測法的研究主要集中在抗性標(biāo)記、外源基因標(biāo)記、免疫學(xué)標(biāo)記和發(fā)光標(biāo)記等方面,但這些技術(shù)在一定程度上都存在局限性[24]。實時熒光定量PCR技術(shù)可以根據(jù)基因水平上的差異特性,定量檢測土壤微生物生長繁殖狀況,相對于競爭定量PCR[25]和倍比稀釋法PCR[26]擁有操作更加簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點,現(xiàn)已經(jīng)廣泛運用到土壤微生物的檢測當(dāng)中。Cordier等[27]通過實時熒光定量PCR對深綠木霉T1進行檢測,并與傳統(tǒng)的平板稀釋法相比較,動態(tài)檢測結(jié)果表明實時熒光定量PCR技術(shù)具有更高的準(zhǔn)確性和靈敏度,可以作為有效的手段對土壤中微生物的含量進行研究。

本研究利用實時熒光定量PCR技術(shù)成功地對2種生防菌(T.versicolor和B.amyloliquefaciens)在鐵核桃根際土壤中的定殖情況及病原菌F.solani的數(shù)量消長動態(tài)進行了研究。生防菌T.versicolor和B.amyloliquefaciens在鐵核桃根際土壤中均有很強的定殖能力和很好的生防效果。施入生防菌后,鐵核桃根際病原菌F.solani數(shù)量得到明顯降低,在2個月后病原菌也維持在較低水平。本試驗表明,2種生防菌生防效果:B.amyloliquefaciens強于T.versicolor;在鐵核桃根際土壤中的定殖能力:B.amyloliquefaciens強于T.versicolor。造成此結(jié)果的原因可能是,生防菌的定殖能力往往受到土壤環(huán)境的影響,如土壤溫度、鹽濃度、滲透性、pH值等[28-29],并且由于生防菌菌種的不同,其生長所需條件也不相同。本研究用盆栽實驗為2種生防菌設(shè)定了相同的生存環(huán)境,并且B.amyloliquefaciens的生防作用可能主要以分泌拮抗物質(zhì)而發(fā)揮作用,更適合在特定的環(huán)境中生存;然而T.versicolor可能是以競爭為主來發(fā)揮作用,受環(huán)境影響更大。即實驗的環(huán)境條件可能會對本實驗結(jié)果有所影響。因此,我們將繼續(xù)對生防菌進行大田實驗,進一步監(jiān)測2種生防菌的定殖能力和鐵核桃根腐病的生防效果。

利用實時熒光定量PCR技術(shù)監(jiān)測重要生防菌是一種簡單、實用且靈敏度高的方法,相對于其他檢測方法如傳統(tǒng)的稀釋平板法和先進的抗性標(biāo)記、外源基因標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記系統(tǒng)等,更為省時省力,且具有高準(zhǔn)確性和高靈敏度。另外,本研究通過建立腐皮鐮刀菌的實時熒光定量檢測體系,可有效地實時監(jiān)測該病原菌的動態(tài)變化,對病害的早期診斷和防治具有重要意義。

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*通信作者(Corresponding author):陳麗梅,E-mail:chenlimeikm@126.com

第一作者聯(lián)系方式:楊志麗,E-mail:yangzhili668@126.com

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