腎形腎狀線蟲個體間rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的變異

鄧艷鳳, 徐紅兵, 田忠玲, 鄭經(jīng)武*

(浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院生物技術(shù)研究所,杭州310058)

摘要利用DNA序列分析技術(shù)對我國浙江、福建和重慶3個地區(qū)的腎形腎狀線蟲(Rotylenchulus reniformis,RN)種內(nèi)群體及群體內(nèi)個體間核糖體RNA 基因(rDNA)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)序列進行PCR擴增及序列變異分析。結(jié)果顯示不同的群體間均獲得2種PCR產(chǎn)物,標記為變異類型Ⅰ(RN_VAR1)和變異類型Ⅱ(RN_VAR2)。基于每個群體內(nèi)2條雌蟲分別挑取各變異類型的5個克隆測序,共得到60個克隆序列。經(jīng)序列比對分析,發(fā)現(xiàn)腎形腎狀線蟲rDNA基因2種類型的ITS區(qū)變異很大,其中變異類型Ⅰ序列長度為705～712 bp,鳥嘌呤和胞嘧啶(guanine and cytosine content,GC)含量為45.1%～46.7%;變異類型Ⅱ序列長度為854～860 bp,GC含量為48.4%～50.0%。2種類型的ITS相似度(包括5.8S RNA基因)僅為62.1%～65.6%,而各rDNA變異類型內(nèi)部各個克隆序列也存在差異,變異類型Ⅰ內(nèi)個體間相似度為89.9%～100%;變異類型Ⅱ內(nèi)個體間相似度為91.4%～99.8%。系統(tǒng)進化分析表明2種變異序列明顯分成2支,同時通過ITS序列分析無法將3個地方群體區(qū)分開來。經(jīng)實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)檢測發(fā)現(xiàn)RN_VAR1含量稍大于RN_VAR2,分別占保守18S基因的rDNA重復單位含量的56%和40%。同時,還發(fā)現(xiàn)腎形腎狀線蟲的2種rDNA-ITS變異類型與已報道的2種18S RNA基因變異類型相對應(yīng),表明腎形腎狀線蟲存在2種rDNA變異類型。

關(guān)鍵詞腎形腎狀線蟲; rDNA; 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū); 序列變異

中圖分類號Q 933文獻標志碼A

基金項目:農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(2011030007);浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項目(2011C22028);浙江省“8812”計劃專項(2011C12020-3)。

收稿日期(Received):2014-11-04;接受日期(Accepted):2014-12-19;網(wǎng)絡(luò)出版日期(Published online):2015-05-19

Interindividual variability of internal transcribed spacer region of ribosomal DNA inRotylenchulusreniformis。JournalofZhejiangUniversity(Agric. &LifeSci.), 2015,41(3):252-260

DengYanfeng,XuHongbing,TianZhongling,ZhengJingwu* (Institute of Biotechnology, College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

SummaryRibosomalRNAgene(rDNA)isconservativeanditiscomposedofnumerouscopiesoftandemlyrepeatedtranscriptionunitswithinthegenomethathasbeenrecognizedasanattractivemarkerforphylogeneticstudies.Itconsistsofthe18S, 5.8S,and28Sgenesaswellasinternaltranscribedspacer(ITS)regionandexternaltranscribedspacer(ETS)region.Asmembersofasequencefamily,themultiplecopiesoftherDNAdonotevolveindependently.Theytendtoevolveinaconcertedfashion,whichmeansthatinaspeciestherepeatsevolvetogether.Previousstudyshowsthattherearetwomajorvariantsinthe18SrRNAgeneofthesingleRotylenchulus reniformis.

ThevariationwithinITSregionofrRNAgeneamongR. reniformispopulationsfromZhejiang,FujianandChongqingofChinawasreported.Twobandsof18S-ITSsequencewithlengthsof1 250bpand1 400bp(include≈480bp18SrDNAsequence,thewholeITSsequenceand≈50bp28SrDNAsequence)wereamplifiedfromeachnematodeofthreepopulationsofR. reniformis,whichnamedasvariant1 (RN_VAR1)andvariant2 (RN_VAR2),respectively.Theamountofvariationwasassessedbysequencingfiveclonesfromeachvariantfromsixfemalereniformnematodesofthreepopulations,withatotalof60sequences.Thesesequencesweredistinguished,basedonmultiplesequencealignment(MSN),thepercentidentityandguanineandcytosinecontent(GC)contentoftheITSandclusteringinphylogenetictrees.ThelengthandGCcontentofITSregionwerecharacterizedbyRN_VAR1 (705-712bp, 45.1%-46.7%)andRN_VAR2 (854-860bp, 48.4%-50.0%),respectively.ThepercentidentitybetweenRN_VAR1andRN_VAR2wasrelativelylowwhichonlyrangedbetween62.1%and65.6%.ThepercentidentitybetweenallclonesinRN_VAR1was89.9%-100%,andthatinRN_VAR2was91.4%-99.8%.Phylogenetictreeanalysesbasedonneighbor-joiningmethodshowedthatbothRNvariantscouldbedistinguishedfromothernematodesbyITSsequencealignment,whileitwashardfordifferentiationofR. reniformisintrapopulation.Thequantitativereal-timepolymerasechainreaction(qPCR)experimentsshowedthatRN_VAR1madeup56%ofrDNAunitswithrelativelywell-conservesin18SRNAgene,whereasRN_VAR2was40%.ThetwoITSvariants,RN_VAR1andRN_VAR2,wereconsistenttothereportedtwo18SRNAgenevariants,respectively.

TheresultsconfirmthattherearetworDNAvarianttypesinreniformnematode.Thisvariationmaybeasaresultofancestralinterspecifichybridizationorgenerecombinationbetweensisterchromatids,leadingtothecoevolutionoftherDNAsequencesonthesechromosomes.

KeywordsRotylenchulus reniformis;rDNA;internaltranscribedspacerregion;sequencevariation

腎形腎狀線蟲是一種根部半內(nèi)寄生性線蟲,通常發(fā)生在熱帶、亞熱帶及一些溫暖潮濕的地區(qū),寄主范圍達300種植物,是棉花、甘薯、鳳梨和許多蔬菜的重要病原線蟲[1]。據(jù)統(tǒng)計,美國平均每年因腎形腎狀線蟲造成的損失約為1.3億美元[2]。我國對腎形腎狀線蟲的研究較少,目前陸續(xù)在廣東、上海、湖北、海南、重慶、四川、廣西、福建、山東等地發(fā)現(xiàn)有腎形腎狀線蟲的分布,寄主涉及常見蔬菜、熱帶果樹及農(nóng)作物,危害較大[3]。

核糖體DNA(ribosomalDNA,rDNA)是編碼核糖體RNA的基因,它通常以多拷貝的串聯(lián)重復形式存在于染色體DNA的1個位點或多個位點上[4]。由于rDNA總體上進化速度較慢,存在有較多的保守區(qū),同時不同區(qū)域序列有著不同的進化水平,因此被廣泛應(yīng)用于不同等級線蟲的分類鑒定[5-7]。然而,許多研究發(fā)現(xiàn)一些生物類群個體rDNA重復序列之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internaltranscribedspacer,ITS)存在明顯變異[8-13],也有一些報道稱18S和28SrRNA基因也存在變異[14-15]。目前對植物寄生線蟲rDNA的研究主要集中在種間分子診斷技術(shù)的應(yīng)用和種內(nèi)群體間遺傳變異情況分析。Nyaku等[16]2013年首次報道了腎形腎狀線蟲個體18SrDNA序列存在2種變異類型,這對以rDNA-ITS為基礎(chǔ)的線蟲分子診斷技術(shù)提出了挑戰(zhàn)。因此,明確生物群體內(nèi)及個體間rDNA序列變異水平,對準確地解釋由rDNA基因序列所提供的信息有重要的理論意義。本研究首次明確了中國3個腎形腎狀線蟲群體之間和個體內(nèi)rDNA中ITS序列變異狀況,豐富了腎形腎狀線蟲rDNA序列信息,并為腎形腎狀線蟲進化分析研究提供了重要的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗材料

供試腎形腎狀線蟲、南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incongnita)、大豆孢囊線蟲(Heterodera glycines)、小麥禾谷孢囊線蟲(Heterodera avenae)和松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)均為筆者所在實驗室多年純培養(yǎng)和繁殖的線蟲群體。其中腎形腎狀線蟲分別來自浙江杭州(ZJ)、福建福州(FJ)和重慶(CQ)。腎形腎狀線蟲培養(yǎng)寄主為大豆,培養(yǎng)條件:26 ℃,光照16h,濕度60%,光照100%。

1.2DNA的提取

單條線蟲DNA提取:在滅菌的0.5-mLEppendorf管中加入10μLddH2O和8 μL 10×PCR(不含Mg2+)緩沖液,加入單條腎形腎狀線蟲雌蟲,搗碎并加入2μL蛋白酶K溶液(600μg/mL),于-70 ℃過夜,轉(zhuǎn)入PCR儀,在65 ℃下溫育1h，接著95 ℃ 10min，最后在轉(zhuǎn)速為12 000r/min條件下離心1min,取其上清液即可用于PCR擴增。

全基因組提取:根據(jù)Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]操作步驟進行。提取后的基因組DNA(genomicDNA,gDNA)溶于100μLddH2O中,測光密度D(λ),于-20 ℃保存。

1.3PCR擴增與序列測定

引物V1[17]位于18SrDNA3′端距ITS1大約190bp處,Z1(本實驗室設(shè)計)位于28SrDNA5′端距ITS2約50bp處,引物序列見表1。

表1用于PCR和實時熒光定量PCR的特異性引物

Table1SpecificprimersforPCRandquantitativereal-timepolymerasechainreaction(qPCR)

引物名稱Oligoname引物序列Primersequences(5'→3')方向DirectionV1TTGATTACGTCCCTGC-CCTTT正向Forward18SMFTAACGAGCGAGACTCTGGCC正向ForwardZ1TCCTCCGCTTACTGATATG反向ReverseRV1FCGACATACAAACATG-CACTG正向ForwardRV1RGCATTTGGCTACCTTA-AGAG反向ReverseRV2FATGCAGATGGCGAACT-CATCC正向ForwardRV2RGAAGCAAGACAAGGGC-CCTAC反向ReverseR18SFTGTCTGCCTTATCAACTTTC正向ForwardR18SRTTTCTCGTCACTACCTCCTC反向Reverse

分別用V1和Z1擴增腎形腎狀線蟲、南方根結(jié)線蟲、大豆孢囊線蟲、小麥禾谷孢囊線蟲和松材線蟲等5種線蟲ITS區(qū),用來區(qū)分不同線蟲ITS區(qū)片段大小。

根據(jù)腎形腎狀線蟲18S rDNA保守區(qū)域設(shè)計引物18SMF,與Z1一起可以擴增得到包含480 bp左右18S rDNA序列、整個ITS區(qū)序列和部分28S rDNA序列的18S-ITS序列。所有引物均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。每個群體取2條雌蟲進行18S-ITS克隆,編號分別為CQ6,CQ8,FJ2,FJ9,ZJ2,ZJ4,從各樣本克隆結(jié)果中選取5個長片段克隆和5個短片段克隆送上海生工測序。

PCR反應(yīng)體系：10×PCR(含Mg2+)緩沖液2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、引物1 μL、5 U/μLrTaq酶0.2 μL(Takara公司),用ddH2O補足體積至25 μL。PCR擴增程序:94 ℃預變性2 min,94 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,68 ℃延伸1 min,20個循環(huán),最后68 ℃延伸7 min。

1.4實時熒光定量PCR分析

通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)反應(yīng)來鑒定2種類型ITS序列在基因組中的含量。根據(jù)2種ITS序列分別設(shè)計特異性引物RV1F/RV1R和RV2F/RV2R,同時設(shè)計18S上的引物R18SF/R18SR,用于總rDNA含量定量,引物見表1。

反應(yīng)體系：SYBR?PremixExTaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)(Takara公司)混合液10 μL、引物0.8 μL、用ROX染料作參比(50×)0.4 μL、模板2 μL,用ddH2O補足體積至20 μL。PCR反應(yīng)程序在熒光定量PCR儀(Applied Biosystems 7300 Fast Real Time PCR System)上進行,預擴增95 ℃,10 s;然后95 ℃,5 s,60 ℃,31 s,40個循環(huán);PCR擴增結(jié)束后立即進行熔解曲線分析,以驗證擴增的特異性。熔解曲線的程序為95 ℃,15 s;60 ℃,1 min;95 ℃,15 s。

標準品用含有目的序列的重組質(zhì)粒制作,用微量紫外可見分光光度計測光密度D(260 nm)和D(280 nm),并根據(jù)摩爾定律,計算質(zhì)粒中的DNA拷貝數(shù)。然后以標準DNA 10倍梯度稀釋成5個梯度,以其作為模板進行熒光定量PCR。

檢測樣品為福建腎形腎狀線蟲全基因組稀釋的DNA,每個反應(yīng)重復3次,CT值標準誤差小于0.5,且qPCR反應(yīng)熔解曲線重合率較好時,才認為該反應(yīng)具有代表性。

1.5數(shù)據(jù)分析

所有獲得的18S-ITS序列均用DNAStar軟件進行拼接并剪輯成18S rDNA和ITS 2個部分。首先用MEGA 4.0[18]軟件將得到的部分18S rDNA序列與已發(fā)表的腎形腎狀線蟲18S變異序列進行比對,分成變異類型Ⅰ(RN_VAR1)和變異類型Ⅱ(RN_VAR2);然后用MEGA 4.0和GenDoc[19]對2種ITS變異類型進行序列比對,用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建分子系統(tǒng)進化樹?？赡艿那逗象w檢測通過Bellerophon(http://comp-bio.anu.edu.au/bellerophon/bellerophon.pl)完成,其中默認設(shè)置為200 bp。

2結(jié)果與分析

2.1線蟲ITS區(qū)擴增結(jié)果

腎形腎狀線蟲、南方根結(jié)線蟲、大豆孢囊線蟲、小麥禾谷孢囊線蟲和松材線蟲等5種線蟲ITS區(qū)擴增結(jié)果見圖1.腎形腎狀線蟲明顯存在2種長度的ITS序列(1 100 bp和950 bp),說明腎形腎狀線蟲ITS區(qū)變異較大。

M:DNA標志物;1:南方根結(jié)線蟲;2:大豆孢囊線蟲;3:小麥禾谷孢囊線蟲;4:松材線蟲;(5～7):腎形腎狀線蟲. 　　M: DNA marker; 1: Meloidogyne incongnita; 2: Heterodera glycines; 3: Heterodera avenae; 4: Bursaphelenchus xylophilus; (5-7): Rotylenchulus reniformis. 圖1　5種植物線蟲ITS區(qū)PCR擴增電泳圖 Fig.1　Electrophoresis result of the ITS region of five kinds of tested plant nematode

2.2腎形腎狀線蟲rDNA中ITS區(qū)變異分析

測序結(jié)果共得到60個序列,排除18個可能的嵌合體序列,其余42個18S-ITS序列有2種不同類型,其中23個短片段(≈1 250 bp)屬于變異類型Ⅰ(RN_VAR1),19個長片段(≈1 400 bp)屬于變異類型Ⅱ(RN_VAR2),GenBank登錄號為KP018549～KP018590。從表2中可以看出2種變異類型序列的ITS區(qū)差異很大,其中變異類型Ⅰ的ITS長度為705～712 bp,鳥嘌呤和胞嘧啶(guanine and cytosine content,GC)含量45.1%～46.7%;變異類型Ⅱ的ITS長度為854～860 bp,GC含量為48.4%～50.0%;5.8S基因序列差異較小。同時，2種類型ITS相似度(中間包含5.8S)僅為62.1%～65.6%,而各變異類型內(nèi)部各個克隆序列也存在差異,類型Ⅰ相似度為89.9%～100%;類型Ⅱ相似度為91.4%～99.8%(未顯示)。從GenDoc軟件比對結(jié)果(圖2)可以看出,在2種變異類型序列中18S和5.8S這些編碼序列只有部分位點出現(xiàn)核苷酸變異,而ITS1和ITS2部分則有較大差異,同時同一變異類型不同克隆之間也存在差異。進化分析結(jié)果(圖3)表明,2種ITS變異類型明顯分成2支,且與其亞科線蟲序列區(qū)分開來,根結(jié)亞科單獨聚為一類,這些與Nyaku等[16]基于18S RNA基因建立的系統(tǒng)進化樹類似,但是通過ITS序列分析無法將3個地方群體區(qū)分開來。說明腎形腎狀線蟲18S和ITS序列只能作為腎形腎狀線蟲種間分類研究依據(jù)。

表2　腎形腎狀線蟲2種rDNA ITS區(qū)的長度和GC含量分析

括號內(nèi)的數(shù)值為平均值.

The average values are showed in parentheses.

2.3實時熒光定量PCR結(jié)果

從ITS變異類型Ⅰ、變異類型Ⅱ和保守的18S基因熔解峰圖(圖4)可見,除目的基因以外,未見其他非特異性擴增熔解峰出現(xiàn),說明檢測引物特異性好,結(jié)果可靠。

SYBR GreenⅠ熒光定量PCR標準曲線循環(huán)閾值與模板濃度呈良好的線性關(guān)系,3條曲線中R2值均在0.99以上,說明標準曲線建立成功。

qPCR反應(yīng)結(jié)果(圖5)顯示ITS變異類型Ⅰ(RN_VRA1)在基因組中的含量約占總rDNA單位含量的56%,而變異類型Ⅱ(RN_VAR2)為40%,變異類型Ⅰ是變異類型Ⅱ的1.4倍左右。

圖2　用GenDoc軟件對腎形腎狀線蟲2種類型rDNA-ITS序列進行多重序列比較 Fig.2　Multiple sequence comparison of the primary structure of the two types of rDNA-ITS of R. reniformis in RN using GenDoc

圖3　42個腎形腎狀線蟲rDNA-ITS序列與紐帶亞科、異皮亞科、腎形亞科和根結(jié)亞科線蟲的系統(tǒng)發(fā)育樹分析 Fig.3　 Phylogenetic tree analyses for 42 RN rDNA-ITS clones and nematodes in the super-families, Hoplolaimidae, Heteroderidae, Rotylenchulidae, and Meloidogynidae using neighbor-joining (NJ) method

左峰:RN_VAR1;中峰:18S基因;右峰:RN_VAR2. Left peak: RN_VAR1 gene; Middle peak: 18S gene; Right peak: RN_VAR2 gene. 圖4　腎形腎狀線蟲RN_VAR1、RN_VAR2和18S基因質(zhì)粒標準品擴增產(chǎn)物的熔解峰 Fig.4　Dissociation curves of RN_VAR1, RN_VAR2 and 18S genes of R. reniformis after plasmid standard amplification

圖5　腎形腎狀線蟲2種變異類型ITS序列在基因組中的含量與18S保守基因含量比較 Fig.5　Content comparison of RN_VAR1, RN_VAR2 and 18S genes of R. reniformis

3討論

Nyaku等[16]研究了腎形腎狀線蟲18S RNA基因變異,發(fā)現(xiàn)腎形腎狀線蟲存在2種18S RNA基因變異類型.本研究結(jié)果表明腎形腎狀線蟲存在2種ITS變異類型,這2種變異類型分別與Nyaku報道的2種18S RNA基因變異類型相對應(yīng)。同時，在這2種變異類型序列中,18S和5.8S這些編碼區(qū)序列基本一致,而非編碼區(qū)(ITS1和ITS2)序列存在明顯差異。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,這2種rDNA-ITS變異類型都能作為腎形腎狀線蟲與各科線蟲分類的依據(jù),而對于同一亞科各屬之間的分類,由于資料有限,無法進行判斷。

目前有許多生物體發(fā)現(xiàn)存在rDNA序列變異。Vogler等[6]等發(fā)現(xiàn)虎甲蟲存在2種ITS1序列且這2種序列有可能存在于不同的染色體上;O’Donnell等[8]發(fā)現(xiàn)廉孢菌屬內(nèi)所有菌群均存在2種ITS2變異類型;Freire等[12]首次在雙殼綱中發(fā)現(xiàn)了鳥蛤(Cerastodermaglaucum) rDNA中存在2種ITS變異類型,其中類型Ⅰ包含真的5.8S基因,而類型Ⅱ在5.8S基因處有部分插入缺失,影響其二級結(jié)構(gòu)和功能。Keller等[20]證實山地蝗蟲存在多個rDNA基因座和多種rDNA變異類型。這些研究從另一方面展現(xiàn)了遺傳基因的多態(tài)性,為了解釋這種多態(tài)性,許多研究者也提出了相應(yīng)的猜測:其一認為,變異序列的產(chǎn)生是由于rDNA序列發(fā)生了種間雜交或基因轉(zhuǎn)化重組期間出現(xiàn)了大的插入或缺失;其二認為,同一染色體上基因的協(xié)同進化效率遠比不同染色體上的效率高[21-24],因此不同的ITS變異類型可能坐落于不同的染色體上,減少被協(xié)同進化的威脅;其三認為,有些rDNA變異序列可能不具有生物功能,因此選擇壓力較小,序列得到保存;其四認為,生物體內(nèi)存在某些機制造成協(xié)同進化作用受到限制或者重復片段間相隔較遠,協(xié)同進化作用減弱,使得同一rDNA上的不同重復片段間序列差異較大。

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*通信作者(Corresponding author):沈圣泉,Tel:+86-571-86971527;E-mail:shenshq@zju.edu.cn

第一作者聯(lián)系方式:童杰鵬,E-mail:tongjiepeng@163.com

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