基于IFCC參考測量程序?qū)崿F(xiàn)常規(guī)檢測系統(tǒng)量值溯源的可行性探索

鄧擁軍1，石英1，周俊2，吳立山2，沈敏2

(1. 湖北省中醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430074；

2. 寧波美康生物科技股份有限公司參考實驗室，浙江 寧波 315104)

摘要：目的探討基于國際臨床化學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(IFCC)參考測量程序?qū)ΤＲ?guī)檢測系統(tǒng)實現(xiàn)量值溯源的可行性分析。方法以乳酸脫氫酶(LDH)為例，采用IFCC參考測量程序和常規(guī)檢測系統(tǒng)(以下簡稱A法)同時測定20份不同濃度冷凍人混合血清樣本。按《臨床檢驗質(zhì)量管理技術(shù)基礎(chǔ)》中判定依據(jù)和偏移圖分析法進行評價常規(guī)檢測系統(tǒng)測量結(jié)果的正確度，對存在系統(tǒng)偏移的常規(guī)方法通過回歸分析進行廠家校準(zhǔn)品認(rèn)定值校正，并測定20份不同濃度的新鮮單人份血清驗證校正后該方法(以下簡稱B法)測量結(jié)果的正確性。結(jié)果A法與IFCC參考測量程序測定結(jié)果的直線回歸方程為Y=1.092X-4.529，平均偏移為7.24%，B法校準(zhǔn)品校正值為174 U/L。經(jīng)驗證B法與IFCC參考測量程序測定結(jié)果的直線回歸方程為Y=0.988X-0.470，平均偏移降為-1.37%。結(jié)論A法測量結(jié)果明顯偏高于參考測量程序測量結(jié)果，經(jīng)校正建立的B法與參考測量程序測定結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞：乳酸脫氫酶；常規(guī)方法；參考測量程序

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)10-1039-05Q554

文獻標(biāo)志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.10.018

Abstract:ObjectiveTo investigate the feasibility for metrological traceability of conventional determination system based on the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine(IFCC)reference measurement procedure. MethodsThe 20 frozen serum samples with different concentrations were determined for lactate dehydrogenase(LDH)according to IFCC reference measurement procedure and routine method (as A method). The accuracy was evaluated according to the guideline of the Basic Quality Management Practice in Clinical Laboratory and the offset graph graphical-analysis. If the routine method existed bias， the calibration value was corrected by regression analysis. The fresh single serum samples of LDH were determined simultaneously by IFCC reference measurement procedure and routine method (as B method) in order to verify the accuracy measured by A method. ResultsThe regression equation with A method and IFCC reference measurement procedure was Y=1.092X-4.529， and the average bias value was 7.24%. B method calibrators′ correction value was 174 U/L. The regression equation with B method and IFCC reference measurement procedure was Y=0.988X-0.470， and the average bias value was -1.37%. ConclusionsThe results of A method are significantly higher than those of IFCC reference measurement procedure， and the results of B method established through amendments are consistent with those of IFCC reference measurement procedure.

作者簡介：鄧擁軍，1970年生，碩士，副主任技師，主要從事臨床化學(xué)檢驗工作。

收稿日期：(2014-11-08)

Investigation on the feasibility for metrological traceability of conventional determination system based on IFCC reference measurement procedureDENGYongjun1,SHIYing1,ZHOUJun2,WULishan2,SHENMin2.(1.DepartmentofClinicalLaboratory,HubeiHospitalofTraditionalChineseMedicine,HubeiWuhan430074,China; 2.ReferenceLaboratory,NingboMedicalSystemBiotechnologyCo.,Ltd.,ZhejiangNingbo315104,China)

Key words: Lactate dehydrogenase；Routine method；Reference measurement procedure

血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)是臨床實驗室檢測頻率極高的項目之一，是心肌梗死、肝病和某些惡性腫瘤等疾病診斷、治療監(jiān)測的重要指標(biāo)。既往研究表明血清LDH常規(guī)方法測定結(jié)果各實驗室之間缺乏可比性[1-2]，已影響臨床診斷和治療。根據(jù)ISO15189要求[3]，各實驗室測定結(jié)果應(yīng)準(zhǔn)確并可溯源。按ISO18153文件要求[4]，血清LDH測定結(jié)果應(yīng)溯源至國際臨床化學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC)參考測量程序[5]。在我國，臨床實驗室多采用自動生化分析儀的常規(guī)方法測定血清LDH活性，這類方法測定結(jié)果的正確度與校準(zhǔn)品直接相關(guān)[6-8]。

我們采用廠家校準(zhǔn)品認(rèn)定值校準(zhǔn)的常規(guī)方法與IFCC參考測量程序2種模式同時測定20份不同濃度冷凍人混合血清樣本，判定常規(guī)方法測定結(jié)果的正確性。對存在系統(tǒng)偏倚的常規(guī)方法通過回歸分析進行廠家校準(zhǔn)品認(rèn)定值校正，并采用20份不同濃度的新鮮單人份血清驗證校正后該方法測定結(jié)果的正確度。

材料和方法

一、材料

1. 儀器(1)參考測量程序儀器：UV-2450 紫外可見分光光度計(日本SHIMADZU公司)、1523型點溫度計(美國FLUKE公司)、XS205DU型分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)、SevenMulti型pH計(瑞士METTLER TOLEDO公司)、移液器(德國Eppendorf AG公司)，所用儀器均通過相關(guān)部門鑒定或參考實驗室內(nèi)部文件校準(zhǔn)；(2)常規(guī)檢測方法儀器：雅培C-8000全自動生化分析儀(美國雅培公司)。

2 .試劑(1)參考測量程序試劑：NAD鋰鹽(95%)、N-甲基-D-葡萄糖胺(99%)、β-NAD游離酸(98%)、L-乳酸、鋰鹽(99.7%)、氯化鈉(99.5%)，均購自美國Sigma公司；(2)常規(guī)方法試劑：試劑為寧波美康生物科技股份有限公司(簡稱美康生物)生產(chǎn)的LDH試劑盒。

3. 參考物質(zhì)、質(zhì)控品、校準(zhǔn)品(1)參考物質(zhì)：參考測量程序準(zhǔn)確性評價用參考物質(zhì)為有證參考物質(zhì)ERM-AD453[批號為000931，認(rèn)定值±不確定度為(502±7)U/L]；(2)質(zhì)控品：參考測量程序精密度評價用質(zhì)控品為C.f.a.s(Roche公司)；(3)校準(zhǔn)品：常規(guī)方法的校準(zhǔn)品由美康生物提供，A法的校準(zhǔn)品由美康生物初步定值(191.52 U/L)；B法的校準(zhǔn)品由美康生物參考實驗室最終定值(174.0 U/L)，可以溯源到ERM-AD453。按說明書規(guī)定復(fù)溶和使用ERM-AD453、質(zhì)控品、常規(guī)方法校準(zhǔn)品。

4. 血清樣品的制備收集湖北省中醫(yī)院非傳染性疾病患者血清20份，血清LDH濃度范圍為109～500 U/L，制備成20份不同濃度人血清樣本，冷凍于-70 ℃保存。使用前從-70 ℃取出，室溫融解后使用；常規(guī)方法偏倚校正效果驗證使用的血清樣本為檢測當(dāng)天收集的20份不同濃度的新鮮單人份血清。

二、方法

1. 參考測量程序測定美康生物參考實驗室按照IFCC參考測量程序[5]第3部分準(zhǔn)備實驗條件，用參考物質(zhì)ERM-AD453驗證參考測量程序測定結(jié)果正確度，要求：3次測定結(jié)果在“認(rèn)定值±不確定度”范圍內(nèi)。該室自建立IFCC參考測量程序后每年都通過參加國際室間比對實驗來維持測定結(jié)果的正確度(IFCC-RELA能力驗證，具體見http：//www.dgkl-rfb.de：81/；美康生物參考實驗室為87號實驗室)。用C.f.a.s質(zhì)控品驗證參考測量程序的精密度，要求：樣本每天測定5次，連續(xù)測定2 d，10次測定的變異系數(shù)(CV)<1%。在參考測量程序測量的正確度和精密度達到要求后進行20份不同濃度冷凍人混合血清樣本測定。測定順序為質(zhì)控品→樣本→質(zhì)控品，每個樣本重復(fù)測定2次，其均值作為評價數(shù)據(jù)，每10份血清加測一個質(zhì)控品。

2. 常規(guī)方法(A法)測量的正確性評價實驗方法常規(guī)方法測量系統(tǒng)由美康生物校準(zhǔn)品、試劑、試劑配套參數(shù)及雅培C-8000全自動生化分析儀組成，嚴(yán)格按照廠家說明書規(guī)定進行20份不同濃度冷凍人混合血清樣本的LDH測量，測定順序為質(zhì)控品→樣本→質(zhì)控品，每個樣本重復(fù)測定2次，其均值作為評價數(shù)據(jù)[9]。

3. 常規(guī)方法測量的系統(tǒng)偏倚校正效果驗證實驗在雅培C-8000全自動生化分析儀的2個測量通道上分別以美康生物校準(zhǔn)品的認(rèn)定值、校正值作為校準(zhǔn)值校準(zhǔn)常規(guī)方法，同時測量20份不同濃度的新鮮單人份血清。測定順序為質(zhì)控品→樣本→質(zhì)控品，每個樣本重復(fù)測定2次，以均值作為評價數(shù)據(jù)。按EP9-A2文件方法判斷數(shù)據(jù)的有效性[10]。驗證校正后的方法稱B法。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用Origin 8.0軟件進行統(tǒng)計分析。以IFCC參考測量程序作為比較方法，廠家常規(guī)方法為待評價方法，進行回歸分析和常規(guī)方法的正確度判定。常規(guī)方法的正確性依據(jù)回歸方程斜率(k)=1.00±0.02、截距接近于0、設(shè)定偏移值(國際參考實驗室室間質(zhì)量評價LDH的合格標(biāo)準(zhǔn)為4.5%)進行判斷[11]。對存在系統(tǒng)偏移的常規(guī)方法校正后測量結(jié)果的正確度，以IFCC參考測量程序作為比較方法，校正后的常規(guī)方法為待評方法(B法)，采用同樣模式進行正確性評價。

結(jié)果

一、 測定數(shù)據(jù)的有效性檢驗

本研究所有數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗無離群值。

二、IFCC參考測量程序測定性能評定

ERM-AD453的檢測結(jié)果在“認(rèn)定值±不確定度”范圍內(nèi)，用C.f.a.s樣本驗證參考測量程序的精密度，CV<1%，見表1。符合IFCC參考測量程序檢測的性能要求。

表1　IFCC參考測量程序性能

三、常規(guī)方法測量的正確性評價實驗結(jié)果

用經(jīng)性能評定合格的參考測量程序和廠家常規(guī)系統(tǒng)同時測量20份不同濃度的冷凍人混合血清樣本，以IFCC參考測量程序為比較方法，廠家測量系統(tǒng)(校準(zhǔn)品認(rèn)定值定標(biāo)，A法)作為待評方法，依據(jù)《臨床檢驗質(zhì)量管理技術(shù)基礎(chǔ)》[11]的判定依據(jù)和偏移圖圖形分析法進行回歸分析評價。結(jié)果發(fā)現(xiàn)常規(guī)測量系統(tǒng)與IFCC參考測量程序測量結(jié)果存在系統(tǒng)偏差，其測量結(jié)果明顯偏高，A法與參考測量程序的平均偏移為7.24%，見圖1、圖2。根據(jù)回歸方程，調(diào)整校準(zhǔn)品的認(rèn)定值，校正后該方法校準(zhǔn)品值為174.0 U/L。用修訂常規(guī)系統(tǒng) (B法)和參考測量程序再次同時測定20份不同濃度的冷凍人混合血清樣本，發(fā)現(xiàn)修訂常規(guī)系統(tǒng)和參考測量程序測量結(jié)果一致，B法與參考測量程序的平均偏移為-1.37%，見圖3、圖4。

圖1　A法與IFCC參考測量程序測定結(jié)果比較

圖2　B法與IFCC參考測量程序測定結(jié)果比較

圖3　A法與IFCC參考測定程序測定結(jié)果的偏移

圖4　B法與IFCC參考測定程序測定結(jié)果的偏移

四、常規(guī)方法測量的系統(tǒng)偏倚校正效果驗證結(jié)果

以廠家常規(guī)方法A校準(zhǔn)品校正值替代認(rèn)定值建立B方法，用B方法和參考測量程序同時測量20份不同濃度的新鮮單人份血清，以驗證其校正效果。校正后的相關(guān)方程為Y=0.988X-0.470，R2=0.998 5，依據(jù)回歸方程的k在1.00±0.02范圍內(nèi)[11]、設(shè)定偏移值(國際參考實驗室時間質(zhì)量評價LDH合格標(biāo)準(zhǔn)4.5%)評價標(biāo)準(zhǔn)，B法測定結(jié)果正確，見圖5。

圖5　B法與IFCC參考測量程序校驗結(jié)果比較及偏移圖

討論

常規(guī)檢測系統(tǒng)包括儀器、試劑、校準(zhǔn)品和操作程序，使用自動化分析儀日常檢驗的精密度得到了顯著的提高；在優(yōu)良試劑盒的配合下，結(jié)果可靠性的關(guān)鍵是準(zhǔn)確度。在常規(guī)檢測系統(tǒng)儀器、試劑和操作程序一定的情況下，決定新鮮患者標(biāo)本測定結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素是校準(zhǔn)品值。本研究通過常規(guī)方法與參考測量程序進行方法學(xué)比對調(diào)節(jié)校準(zhǔn)品值，實現(xiàn)臨床樣本測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，繼而達到溯源的目的，這也是校準(zhǔn)的意義所在。

目前，絕大多數(shù)臨床實驗室使用的是商品試劑盒或分析系統(tǒng)。因此，廠家產(chǎn)品校準(zhǔn)品定值的溯源性顯得尤為重要，歐盟體外診斷器具指令提出的溯源性要求和ISO17511及ISO18153都是針對診斷器具生產(chǎn)廠家。要實現(xiàn)臨床檢驗量值溯源性，解決常規(guī)方法測量結(jié)果量值溯源問題[12-14]，就是要建立并應(yīng)用參考系統(tǒng)，參考系統(tǒng)通常包括參考物質(zhì)、參考方法和參考實驗室。由于參考系統(tǒng)工作對設(shè)施設(shè)備、人員技術(shù)等方面要求較高，操作繁瑣，價格昂貴，而且要維持其成本很高。所以，參考實驗室工作應(yīng)該由少數(shù)有能力、有實力的優(yōu)秀實驗室來實施，一般常規(guī)檢測實驗室沒有能力對檢測方法進行所謂的“溯源性校正”?！八菰葱孕Ｕ敝饕审w外診斷器具生產(chǎn)廠商進行。

本研究是美康生物參考實驗室在建立LDH參考系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，采用IFCC參考測量程序評價常規(guī)方法測量結(jié)果的正確度。對存在系統(tǒng)偏倚的A方法的校準(zhǔn)品重新賦值，建立校正后廠家常規(guī)方法(B法)與IFCC參考測量程序同時測定20份不同濃度的冷凍人混合血清樣本。

用參考測量程序和廠家常規(guī)系統(tǒng)同時測定20份不同濃度的冷凍人混合血清樣本，常規(guī)檢測系統(tǒng)(A法)與參考測量程序測定結(jié)果線性回歸方程為Y=1.092X-4.529，R2=0.999，平均偏移為7.24%。以《臨床檢驗質(zhì)量管理技術(shù)基礎(chǔ)》[11]中2種方法的線性回歸方程的k=1.00±0.02、截距≈0作為一致性的標(biāo)準(zhǔn)，再結(jié)合偏移圖圖形分析法(以參考測量程序測定結(jié)果為橫坐標(biāo)，常規(guī)方法測定均值與參考測量程序測定結(jié)果的偏移程度為縱坐標(biāo)作圖)進行回歸分析評價。以常規(guī)方法與參考測量程序的平均偏移≤±4.5%為標(biāo)準(zhǔn)(IFCC允許偏移范圍)判斷常規(guī)方法的正確度。A法與IFCC參考測量程序測定結(jié)果存在系統(tǒng)偏差，其測定結(jié)果明顯偏高(偏移為7.24%)。對存在系統(tǒng)偏移的A法的校準(zhǔn)品重新賦值(174 U/L)，建立校正后廠家常規(guī)方法(B法)，并與IFCC參考測量程序同時測定20份不同濃度的冷凍人混合血清樣本，B法與參考測量程序測定結(jié)果線性回歸方程為Y=0.991 6X-0.871 0，R2為0.998 22，平均偏移降為-1.37%。結(jié)果表明A法校正后可實現(xiàn)測定結(jié)果正確。為了驗證常規(guī)方法測定的系統(tǒng)偏移校正效果，采用B法與IFCC參考測量程序同時測定20份不同濃度的新鮮單人份血清，測定結(jié)果線性回歸方程為Y=0.988X-0.470，R2=0.998 5，平均偏倚為-1.37%。結(jié)果進一步驗證說明了A法校正后可實現(xiàn)測定結(jié)果正確。

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(本文編輯：龔曉霖)