多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)與重復(fù)序列PCR在近平滑念珠菌基因分型中的比較

李貞，董丹鳳，章黎華，江岑，彭奕冰

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025)

摘要：目的比較多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記(PMM)技術(shù)與重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)在近平滑念珠菌基因分型中的應(yīng)用。方法收集2012年3月至2013年11月間上海5家醫(yī)院臨床分離的近平滑念珠菌55株，經(jīng)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析(ITS)進(jìn)一步鑒定菌種，共有狹義近平滑念珠菌43株，之后采用重復(fù)序列PCR和PMM技術(shù)進(jìn)行基因分型，比較2種分型方法的結(jié)果和效率。結(jié)果43株狹義近平滑念珠菌經(jīng)重復(fù)序列PCR分型只有1種基因型；經(jīng)PMM技術(shù)分型有22種基因型，以Ⅰ型(10株)、Ⅱ型(6株)為主，Ⅲ～Ⅶ型見(jiàn)于2或3株菌，其余15種基因型均只有1株菌。結(jié)論P(yáng)MM技術(shù)用于狹義近平滑念珠菌的基因分型，分辨率高、重復(fù)性好，適用于狹義近平滑念珠菌基因組微進(jìn)化的監(jiān)測(cè)，而重復(fù)序列PCR不適用于狹義近平滑念珠菌的基因分型。

關(guān)鍵詞：近平滑念珠菌；基因分型；多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)；重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)

中圖分類(lèi)號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)10-1017-04R379.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.10.013

Abstract:ObjectiveTo evaluate the application of polymorphic microsatellite marker(PMM)technology and repetitive sequence-based polymerase chain reaction (PCR) for genotyping of Candida parapsilosis. MethodsFrom March 2012 to November 2013, 55 Candida parapsilosis isolates were collected from 5 hospitals in Shanghai, which were further identified as Candida parapsilosis sensu stricto (43 isolates) by amplifying and sequencing with internal transcribed sequence(ITS). All the isolates were genotyped by repetitive sequence-based PCR and PMM technology. Finally, the results and efficacy of these 2 genotyping methods were compared. ResultsThe 43 Candida parapsilosis sensu stricto isolates had only 1 genotype by repetitive sequence-based PCR. PMM technology generated 22 genotypes. The major genotypes were Type Ⅰ (10 isolates) and Type Ⅱ (6 isolates), whereas Type Ⅲ-Ⅶ were observed in 2 or 3 isolates. Another 15 genotypes were observed in only 1 isolate. ConclusionsPMM technology is an effective genotyping method for Candida parapsilosis sensu stricto with high resolution and repeatability, which could be used to determine the micro-evolutionary variations. However, repetitive sequence-based PCR is not suitable for the genotyping of Candida parapsilosis sensu stricto.

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目(81371873)；國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目(81301462)

作者簡(jiǎn)介：李貞，女，1988年生，碩士，主要從事真菌流行致病及耐藥機(jī)制研究。

通訊作者：彭奕冰，聯(lián)系電話：021-64370045 。

收稿日期：(2015-01-12)

Comparison on genotyping ofCandidaparapsilosisby polymorphic microsatellite marker technology and repetitive sequence-based PCRLIZhen,DONGDanfeng,ZHANGLihua,JIANGCen,PENGYibing.(DepartmentofClinicalLaboratory,RuijinHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China)

Key words:Candidaparapsilosis; Genotype; Polymorphic microsatellite marker technology; Repetitive sequence-based polymerase chain reaction

念珠菌是引起醫(yī)院血流感染的重要病原體之一，嚴(yán)重威脅著患者的生命健康。近年來(lái)歐洲、拉丁美洲和亞洲一些國(guó)家的報(bào)道顯示，近平滑念珠菌已經(jīng)成為引發(fā)念珠菌血癥的第2種常見(jiàn)病原體，發(fā)生率僅次于白念珠菌[1-2]，因而其越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

材料和方法

一、菌株來(lái)源

收集2012年3月至2013年11月間上海5家醫(yī)院臨床分離的近平滑念珠菌55株，經(jīng)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析(internal transcribed sequence，ITS)進(jìn)一步鑒定為狹義近平滑念珠菌43株 、Candidaorthopsilosis7株 、Candidametapsilosis5株。其中上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院的狹義近平滑念珠菌 、Candidaorthopsilosis和Candidametapsilosis菌株分別為34株、7株和3株；復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院的狹義近平滑念珠菌、Candidametapsilosis各1株，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院的狹義近平滑念珠菌、Candidametapsilosis分別為3株和1株，復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院的狹義近平滑念珠菌 4株，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)學(xué)中心的狹義近平滑念珠菌 1株。

二、儀器與試劑

API微生物鑒定系統(tǒng)(法國(guó)生物梅里埃公司)，PCR擴(kuò)增儀(PTC-100 Thermal Cycle，美國(guó)MJ Research公司)，ITS、重復(fù)序列PCR及PMM技術(shù)所用引物均由Invitrogen上海技術(shù)服務(wù)部合成，PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自日本Takara公司，Lyticase(溶壁酶)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，電泳成像系統(tǒng)為T(mén)anon 4100成像系統(tǒng)。

三、菌株鑒定

首先根據(jù)菌株的菌落形態(tài)及生化特性進(jìn)行初步鑒定，即樣本接種于科瑪嘉顯色平板，35 ℃培養(yǎng)48 h，白色或淡粉色菌落通過(guò)API 20C AUX酵母菌鑒定板條進(jìn)行鑒定，如鑒定結(jié)果為近平滑念珠菌則轉(zhuǎn)于20%甘油培養(yǎng)液中，-80 ℃凍存。提取菌株DNA，PCR擴(kuò)增ITS片段,測(cè)序鑒定狹義近平滑念珠菌、Candidaorthopsilosis、Candidametapsilosis。

四、DNA提取

參照文獻(xiàn)[5]記載的方法提取DNA，保存于-20 ℃。

五、ITS鑒定

采用TAVANTI 等[4]推薦的方法，引物ITS1為5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3′,ITS4 5′-TCC-TCCGCTTATTGATATGC-3′,PCR反應(yīng)體系為50 μL,包括10× PCR緩沖液(無(wú)Mg2+)5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL ,2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L引物各1 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，DNA(100 ng/μL)1 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物委托Invitrogen公司測(cè)序。

六、PMM技術(shù)

參考文獻(xiàn)選擇[3]報(bào)道的分辨率較高的微衛(wèi)星位點(diǎn)CP6，其重復(fù)片段為(AAC)48，片段大小約300 bp,引物序列FWD為5′-CAGGAACAG-GACAATGGTGA-3′，REV為5′-TCTGGAGCCTCT-AGGACGTTT-3′，該引物采用FAM熒光素標(biāo)記。反應(yīng)體系為50 μL，包括10×LaTaq緩沖液(含Mg`(2+))5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L 引物各1 μL，TaKaRa LaTaq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，DNA(100 ng/μL)1 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。之后PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，摸索擴(kuò)增條件使PCR產(chǎn)物為單一條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物送Invitrogen公司采用高分辨率毛細(xì)管電泳判讀結(jié)果。

七、重復(fù)序列PCR

采用REDKAR等[5]推薦的方法，所用引物為Ca21(5′-CATCTGTGGTGGAAAGTAAAC-3′)、Ca22(5′-ATAATGCTCAAAGGTGGTAAG-3′)、Com21(5′-GCCGTTTTGGCCATAGTTAAG-3′)。PCR反應(yīng)體系為25 μL,包括10×ExTaq緩沖液(含Mg2+)2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10 μmol/L引物各1 μL，TaKaRa ExTaq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，DNA(100 ng/μL)1 μL。分別將3個(gè)引物兩兩組合或自身組合進(jìn)行PCR，選取最合適的引物對(duì)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min，92 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，70 ℃ 90 s，共35個(gè)循環(huán)；70 ℃ 3 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分型，Tanon 4100成像系統(tǒng)成像。

結(jié)果

一、狹義近平滑念珠菌分型

5家醫(yī)院的43株狹義近平滑念珠菌PMM技術(shù)共分為22種基因型，其中15種基因型均只出現(xiàn)過(guò)1次，即只有1株菌為該基因型。另外7種基因型多次出現(xiàn)，依次記為Ⅰ～Ⅶ型，見(jiàn)表1。其中Ⅰ型最為常見(jiàn)，共10株，其菌株來(lái)自于3家醫(yī)院(瑞金醫(yī)院8株、華山醫(yī)院1株、上海兒童醫(yī)學(xué)中心1株)的8例不同患者，其中有2例患者均于不同時(shí)期的痰液樣本中分離到2株菌株，這8例患者分布在6個(gè)不同的病區(qū)；有6株狹義近平滑念珠菌屬于基因型Ⅱ，均來(lái)自于同一家醫(yī)院；基因型Ⅲ～Ⅴ出現(xiàn)于2或3株不同患者的菌株；基因型Ⅵ、Ⅶ見(jiàn)于各有2株菌來(lái)自同一例患者不同時(shí)期的痰液樣本。

重復(fù)序列PCR分型結(jié)果顯示，將引物Ca21、Ca22、Com21兩兩組合或自身組合進(jìn)行PCR，其中用引物對(duì)Ca21-Ca22、Ca21-Com21、Ca21-Ca21、Ca22-Ca22 及Com21-Com21擴(kuò)增出的條帶數(shù)目較少或模糊不易分辨，而用Ca22-Com21引物對(duì)擴(kuò)增出的條帶數(shù)目多且清晰，所以選用此對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增分型。根據(jù)PCR產(chǎn)物電泳圖譜，43株狹義近平滑念珠菌均為同一種基因型，記為基因型A。見(jiàn)圖1、表1 。

在CPIKN中，將協(xié)同成員節(jié)點(diǎn)pi的點(diǎn)權(quán)權(quán)重作為其重要程度的衡量指標(biāo)。然后，定義協(xié)同成員節(jié)點(diǎn)pi重要程度排序序號(hào)為xi，協(xié)同成員節(jié)點(diǎn)pi的重要程度信息獲取狀態(tài)為εi，若協(xié)同成員節(jié)點(diǎn)pi的重要程度信息已知，則εi=1，反之εi=0。

表1　狹義近平滑念珠菌的分型結(jié)果

注:M1～M5 為Candidametapsilosis菌株，M1、M4為C型，M2、M5為D型，M3為E型；O1～O3為Candidaorthopsilosis菌株，均為B型；P1～P4為狹義近平滑念珠菌菌株，均為A型
圖1狹義近平滑念珠菌、Candidaorthopsilosis、Candidametapsilosis的重復(fù)序列PCR產(chǎn)物電泳圖

二、相關(guān)菌種 Candida orthopsilosis、 Candida metapsilosis分型

經(jīng)ITS鑒定，臨床分離診斷的55株近平滑念珠菌中Candidaorthopsilosis7株、Candidametapsilosis5株。分別用PMM技術(shù)和重復(fù)序列PCR對(duì)Candidaorthopsilosis、Candidametapsilosis進(jìn)行分型，以觀測(cè)這2種分型方法對(duì)狹義近平滑念珠菌以外的相關(guān)菌種的區(qū)分能力。7株Candidaorthopsilosis經(jīng)PMM技術(shù)分型為同一種基因型，記為Ⅷ型，見(jiàn)表2；經(jīng)重復(fù)序列PCR分型也只有1種基因型，見(jiàn)圖1。5株Candidametapsilosis經(jīng)PMM技術(shù)分型，有3株未擴(kuò)增出有效產(chǎn)物，1株分型結(jié)果為240/240，另外1株分型為232/272，見(jiàn)表2；5株Candidametapsilosis有3種重復(fù)序列PCR基因型別，分別記為基因型C(2株)、D(2株)、E(1株)。見(jiàn)圖1。

表2　 Candida orthopsilosis、 Candida metapsilosis的分型結(jié)果

討論

目前一些分型方法已經(jīng)被用于近平滑念珠菌家系的分型研究，如多位點(diǎn)序列分析(multilocus sequence typing，MLST)[6]、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)[3，6]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (random amplified polymorphic DNA，RAPD)[3，7]。VAN ASBECK等[6]和 SABINO等[3]的研究表明，狹義近平滑念珠菌由于其核甘酸序列變異度低，不能用RAPD、RFLP和MLST做進(jìn)一步亞型分析，但Candidaorthopsilosis可以用RFLP、MLST區(qū)分亞型，Candidametapsilosis因?yàn)槭占降木陻?shù)目較少，還有待進(jìn)一步研究。

PMM技術(shù)是一種基于微衛(wèi)星位點(diǎn)的分型方法，對(duì)基因序列變異度低的菌株有一定的區(qū)分能力[8]，因?yàn)槲⑿l(wèi)星位點(diǎn)是廣泛存在于真菌基因組中2～10 bp的短串聯(lián)重復(fù)DNA序列,具有高度的多態(tài)性。PMM技術(shù)是用熒光素標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后用高分辨率的毛細(xì)管電泳精確地檢測(cè)擴(kuò)增片段大小的分型方法[3, 8-9]。LASKER等[8]研究的42株狹義近平滑念珠菌有30種PMM基因型，分辨率達(dá)0.971。本研究中的43株狹義近平滑念珠菌有22種PMM基因型，而只有1種重復(fù)序列PCR基因型。PMM技術(shù)可以用于狹義近平滑念珠菌的亞型分析，而且分辨率較高，另外PMM技術(shù)結(jié)合熒光引物應(yīng)用高分辨率的毛細(xì)管電泳儀測(cè)定擴(kuò)增片段大小來(lái)判定結(jié)果，避免了凝膠電泳條帶分型的主觀誤差，重復(fù)性好。LASKER等[8]研究的42株狹義近平滑念珠菌有30種PMM基因型，但本研究中的43株狹義近平滑念珠菌只有22種PMM基因型，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是本研究收集的菌株中，PMM Ⅵ型、Ⅶ型各有2株菌來(lái)自同一患者不同時(shí)期的痰液樣本，而同一患者來(lái)源的樣本為同一種PMM基因型；另外不同地域來(lái)源的菌株其流行分布可能有一定的地域差異。

重復(fù)序列PCR則基于真菌基因組中的重復(fù)序列，通過(guò)比對(duì)PCR產(chǎn)物的電泳條帶，揭示基因組間的差異。該技術(shù)自1996年由VERSALOVIC提出后，相繼被應(yīng)用于白念珠菌、熱帶念珠菌及光滑念珠菌的基因分型。就熱帶念珠菌和光滑念珠菌而言，重復(fù)序列PCR與MLST有相同的分辨率，方便快捷，可作為實(shí)驗(yàn)室熱帶念珠菌和光滑念珠菌基因分型的首選方法[10-12]。但本研究中43株狹義近平滑念珠菌經(jīng)重復(fù)序列PCR分型，只有1種基因型，重復(fù)序列PCR不適用于狹義近平滑念珠菌的基因分型。

近平滑念珠菌家系中的相關(guān)菌株Candidametapsilosis(5株)，經(jīng)PMM技術(shù)分型有3株無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物；經(jīng)重復(fù)序列PCR分型有3種基因型，重復(fù)序列PCR對(duì)Candidametapsilosis有一定的區(qū)分能力。7株Candidaorthopsilosis經(jīng)PMM技術(shù)、重復(fù)序列PCR分型均只有1種基因型，但由于菌株數(shù)量少，且7株菌中的6株來(lái)自同一患者，所以PMM技術(shù)、重復(fù)序列PCR對(duì)Candidaorthopsilosis的分型能力還有待進(jìn)一步研究。

上海5家醫(yī)院的43株狹義近平滑念珠菌經(jīng)PMM技術(shù)分為22種基因型，其中Ⅰ型最為常見(jiàn)，共10株，其菌株來(lái)自于上海3家醫(yī)院的8例不同患者，瑞金醫(yī)院8株(8/34)，華山醫(yī)院1株(1/4)，上海兒童醫(yī)學(xué)中心1株(1/1)，這一結(jié)果表明在瑞金醫(yī)院 Ⅰ 型狹義近平滑念珠菌是相對(duì)較為流行的菌株型別，而上海其它醫(yī)院來(lái)源的狹義近平滑念珠菌菌株數(shù)目較少，要確定基因型Ⅰ是否是上海地區(qū)的流行菌株，還需要更多數(shù)量的菌株進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，PMM技術(shù)用于狹義近平滑念珠菌的基因分型，分辨率高、重復(fù)性好，適用于狹義近平滑念珠菌基因組微進(jìn)化的監(jiān)測(cè)；而重復(fù)序列PCR不適用于狹義近平滑念珠菌的基因分型。

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(本文編輯：姜敏)