人胚胎三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育形態(tài)學(xué)測量

廖禮彬1, 姚雪萍2, 吐爾遜江·達(dá)地汗3, 古麗尼沙·克力木3

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1組織胚胎學(xué)教研室,2機(jī)能實驗中心,3人體解剖學(xué)教研室， 烏魯木齊830011)

摘要:目的觀察人胚胎三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞隨胎齡增長的變化發(fā)育規(guī)律。方法取19～32 w人胚胎三叉神經(jīng)節(jié),光鏡觀察,進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，圖像分析儀測量三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞面積、周長、直徑。結(jié)果隨著胎齡增長三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目無明顯變化，直徑隨胎齡增長而增大，面積和周長均隨胎齡增大而明顯增大。結(jié)論人胚胎三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)發(fā)育在7～8個月(32 w)時達(dá)成年人水平；但細(xì)胞數(shù)目隨胎齡增長無明顯變化。

關(guān)鍵詞:三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞; 測量; 人胚胎

中圖分類號：R322.8文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.01.013

[收稿日期：2014-07-14]

The Morphometry on development of trigeminal ganglion cells in human embryo

LIAO Libin1, YAO Xueping2, Tuerxunjiang Dadihan3, Gulnisa Kerem3

(3TheHistologyandEmbryologyDepartmentofPreclinicalCollege,2TheMechanismLab

CenterDepartment,3TheHumanAnatomyDepartment，

XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the development of human embryonic trigeminal ganglion cells with fetal development. MethodEmbryonic trigeminal ganglion aged from 19 to 32 weeks were observed by light microscopy; the cells were counted, and image analysis instrument was used to measure the area, perimeter and diameter of trigeminal ganglion cells. ResultsWith the development of fetus, the number of trigeminal ganglion cells showed no significant changes, but they grew in diameter while the area and perimeter of cells increased significantly. ConclusionThe morphology development of trigeminal ganglion cells in human embryo achieved adults′ level at 7-8 months (32 weeks), but the number of cells showed no significant change with the development of fetus.

Key words: trigeminal ganglion cells; measurement; human embryo

神經(jīng)系統(tǒng)是人體各系統(tǒng)中發(fā)育較早的一個系統(tǒng)，人胚胎第3周在脊索的誘導(dǎo)下神經(jīng)外胚層形成神經(jīng)板，再由神經(jīng)板分化為神經(jīng)元。關(guān)于神經(jīng)元的發(fā)生過程做過大量研究，如不同動物的脊神經(jīng)的計數(shù)及胞體大小測量等；也有研究報道三叉神經(jīng)節(jié)方面的形態(tài)研究主要是在形態(tài)結(jié)構(gòu)及定位方面[1-3]。國外學(xué)者觀察了貓三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)不同神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征，并分別對豚鼠、兔、貓、猴和人的三叉神經(jīng)節(jié)進(jìn)行了比較觀察[4-6]。但三叉神經(jīng)節(jié)發(fā)育尤其人胚胎三叉神發(fā)育方面的資料較少,Wu等[7]對小鼠三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞生后發(fā)育進(jìn)行觀察，但這些觀察都沒有進(jìn)行詳細(xì)的定量研究, 也未見有關(guān)人胚胎三叉神經(jīng)節(jié)發(fā)育方面的報道。因此,本研究除從三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)方面進(jìn)行觀察外, 著重觀察人胚胎三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞隨胎齡增長的變化發(fā)育規(guī)律。

1材料和方法

1.1實驗材料從新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)院收集非疾致死的流產(chǎn)胎兒共7例，男性3例，女性4例，胎齡19～40 w，通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核，標(biāo)本提供者已簽署知情同意書。

1.2實驗方法和步驟

1.2.1標(biāo)本固定在獲取標(biāo)本后4 h內(nèi)，手術(shù)刀片切開胸腔，充分暴露心臟，小心切開心包腔，找到升主動脈根部，連續(xù)向根部推注生理鹽水300～500 mL行心臟沖洗，再注入10%福爾馬林1 000 mL，用眼科剪在右心房處剪一小切口，讓固定液沿體循環(huán)途徑行灌流固定，當(dāng)頭部和四肢變硬飽滿后，即固定好。將標(biāo)本保存在新鮮配置的10%福爾馬林溶液中進(jìn)行后固定，干燥處避光保存。

可分兩個層次進(jìn)行，首先要建立健全水行政執(zhí)法信息統(tǒng)計系統(tǒng)，全面掌握我國水事違法案基本情況，為“兩法銜接”機(jī)制建設(shè)提供技術(shù)支撐。建議國務(wù)院水行政主管部門加快建立國家層級的水行政執(zhí)法信息統(tǒng)計系統(tǒng)，各流域管理機(jī)構(gòu)、?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）建立本區(qū)域范圍的執(zhí)法信息統(tǒng)計系統(tǒng)，實現(xiàn)水利系統(tǒng)內(nèi)部水行政執(zhí)法信息共享，同時為刑事司法機(jī)關(guān)查閱相關(guān)信息提供便利。其次，按照國家 “行政執(zhí)法與刑事司法銜接信息共享平臺”的要求，將“水行政執(zhí)法統(tǒng)計信息”納入共享平臺中，實現(xiàn)各級水行政執(zhí)法機(jī)關(guān)、公安機(jī)關(guān)和檢察機(jī)關(guān)的相互監(jiān)督制約，及時發(fā)現(xiàn)涉嫌水事違法犯罪線索，加大打擊犯罪力度。

1.2.2組織切片待完全固定后，取胎頭并PBS漂洗干凈，沿胎頭耳廓上方1 cm處環(huán)形去掉頭皮、顱蓋骨，暴露端腦，摘取雙側(cè)大腦半球及間腦。在外科顯微鏡下去掉部分中腦后，確定左側(cè)三叉神經(jīng)根、三叉神經(jīng)節(jié)及三大分支眼神經(jīng)、上頜神經(jīng)、下頜神經(jīng)的位置，分別在眶上裂處切斷眼神經(jīng)，在圓孔處切斷上頜神經(jīng)，在卵圓孔處切斷下頜神經(jīng)，在腦橋基底部切斷三叉神經(jīng)根，小心完整剝離左側(cè)三叉神經(jīng)根、節(jié)分支，修整組織后，置于新鮮配置的10%福爾馬林溶液中。梯度酒精脫水，石蠟包埋，全程連續(xù)冠狀切片，片厚4 μm，HE染色后中性樹膠將切片標(biāo)本封固，每張切片標(biāo)記排序。

1.3細(xì)胞計數(shù)與測量

1.3.1細(xì)胞計數(shù)單位以可見清晰核仁的神經(jīng)細(xì)胞為計數(shù)單位，在HE染色片上三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)對比明顯，與周圍衛(wèi)星細(xì)胞和成纖維細(xì)胞易區(qū)分，胞體輪廓界限清晰，減少了細(xì)胞漏計或重計的概率。

1.3.2三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計數(shù)計數(shù)三叉神經(jīng)細(xì)胞時，每個胎齡組隔3張取1張完整的切片。光鏡下(×400)利用Motic images Advanced 3.2 圖像處理分析軟件沿三叉神經(jīng)半月節(jié)弧形方向進(jìn)行測量，計算出每個視野中神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目，同時記錄每個神經(jīng)節(jié)所觀察視野的總數(shù)，測量每個視野的面積，求出每個視野體積=視野的面積×切片厚度；最后計算出1個視野體積中三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞平均密度=所有視野神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目總和/觀察視野的總數(shù)，按公式N=V/vD 粗略計算出神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目(N：神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)；V：神經(jīng)節(jié)體積；v：1個視野體積；D：1個視野體積中的神經(jīng)細(xì)胞平均密度)。將N代入Abercrombie[8]的校正公式，得出實際應(yīng)有的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目。

1.3.3三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞直徑、面積與周長的測量每個胎齡組隔3張取1張完整的切片，每張切片按“S”形取樣法，每張切片計數(shù)20個視野；光鏡下(×400)利用 Motic images Advanced 3.2 圖像處理分析軟件，選擇軟件菜單中“線段”選項，調(diào)試好“物鏡”、“單位”和“精度”；通過核仁測量神經(jīng)細(xì)胞胞體最長直徑為長徑，經(jīng)核仁垂直長徑者為短徑；選擇軟件菜單中“多邊形”選項，其他選項與直徑測量相同；沿細(xì)胞外側(cè)緣做多邊形曲線勾勒出細(xì)胞的整個輪廓，形成一個閉合的邊緣；閉合邊緣內(nèi)部分即細(xì)胞的面積。周長測量方法同面積。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，細(xì)胞計數(shù)采用相關(guān)分析，其余測量所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，對各胎齡段細(xì)胞直徑、周長及面積進(jìn)行單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的光鏡觀察鏡下可見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞散在分布在神經(jīng)纖維之間，團(tuán)塊狀或者成群分布；細(xì)胞界限清晰,胞體卵圓形或圓形，大小不等，胞質(zhì)在19～25 w胎齡期嗜酸性，呈粉紅色(圖1a、b)。27 w時胞質(zhì)呈淡藍(lán)紫色，尼氏顆粒漸明顯(圖1c)。32 w后，細(xì)胞核為1個，居中，近似圓形，其內(nèi)染色質(zhì)顆粒較少，呈空泡狀，核仁明顯，基本居中，呈紫紅色(圖1d)。各胎齡組細(xì)胞大小隨胎齡增長而增大。

a: 19 w三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)

b: 25 w三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)

c: 27 w三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)

d: 32 w三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)

圖1不同胎齡三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞光鏡圖(HE×400)

表1　不同胎齡組人胚胎三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目/個( ±s)

表1　不同胎齡組人胚胎三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目/個( ±s)

胎齡/w左側(cè)右側(cè)兩側(cè)平均1923841±11624071±10823956±1122024769±20424317±31424543±2592525078±16923981±20924529±1892724785±11825134±15224959±1353225420±32125943±28725681±304

表2　不同胎齡組人胚胎三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞直徑比較( ±s)

表2　不同胎齡組人胚胎三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞直徑比較( ±s)

胎齡/w例數(shù)直徑/μm長徑短徑面積/μm2周長/μm19199.73±19.7169.66±13.144702.96±500.92233.54±32.7820199.53±10.2271.34±19.184610.24±301.02232.08±17.26251113.13±25.0778.84±10.245919.33±423.09267.34±136.18272216.37±26.43*Δ▲177.76±26.54*Δ▲30707.21±9848.54*Δ▲623.88±146.11*Δ▲322261.78±31.39*Δ▲200.46±39.12*Δ▲42166.42±9186.59*Δ▲721.05±295.43*Δ▲

注：與19 w比較,*P<0.05; 與20 w比較,ΔP<0.05; 與25 w比較,▲P<0.05。

3討論

神經(jīng)元是機(jī)體所有細(xì)胞中最令人感興趣和與眾不同的特殊細(xì)胞。除了嗅神經(jīng)元、海馬的齒狀回及少數(shù)特異腦區(qū)的神經(jīng)元外，哺乳動物在胚胎發(fā)育的高峰期之后不再出現(xiàn)增殖和分裂。腦脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)元的胞體主要成群地聚于神經(jīng)節(jié)的周緣部分, 少量也散布在神經(jīng)節(jié)中央神經(jīng)纖維之間。每個神經(jīng)元胞體有衛(wèi)星細(xì)胞形成的囊包繞, 胞體發(fā)出的單個突起穿出衛(wèi)星細(xì)胞囊, 再分叉為中央支和周圍支, 構(gòu)成神經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)纖維束。

從20世紀(jì)開始就有學(xué)者對不同動物各種腦脊神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目與直徑進(jìn)行觀察和研究，從種類上看，對于同一種動物單個腦神經(jīng)節(jié)比單個脊神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目要多,大白鼠三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目明顯比頸、胸等脊神經(jīng)數(shù)目要多[9-10]。從神經(jīng)節(jié)分類看，則高級動物的同一種神經(jīng)節(jié)的細(xì)胞數(shù)目較多, 如兔的三叉神經(jīng)節(jié)數(shù)目為72 452個，而小鼠僅為13 864～15 212個[11-13]，提示動物越高級，神經(jīng)系統(tǒng)就越發(fā)達(dá)，神經(jīng)節(jié)數(shù)目越多。另外有可能與神經(jīng)分布區(qū)的大小有關(guān)。

本研究主要系統(tǒng)地通過光鏡觀察和分析軟件對利用人類胚胎三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞大小、數(shù)量進(jìn)行測量，從多角度、多途徑、全方位對三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)19～32 w胎齡胎兒兩側(cè)神經(jīng)元數(shù)目并無明顯差別，且隨胎齡增長神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目變化不明顯。與其他動物神經(jīng)節(jié)比較，人三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目應(yīng)該比兔、貓等個體較大動物多，但結(jié)果相反?？赡芤驗樗芯康膭游锒际浅赡甑模狙芯坎捎玫氖桥咛テ诘臉?biāo)本，處于發(fā)育過程中。在此過程中，最初生成的神經(jīng)元的數(shù)目遠(yuǎn)比以后存留的數(shù)目多，未能與靶細(xì)胞建立連接的神經(jīng)元在一定時間內(nèi)死亡，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目決定于神經(jīng)上皮細(xì)胞的分裂增殖及成神經(jīng)細(xì)胞的遷移和死亡；其數(shù)目一般經(jīng)歷一個由少到多、由多到少的變化過程；開始神經(jīng)元細(xì)胞的增加是由于上皮細(xì)胞的分裂增殖和成神經(jīng)細(xì)胞的遷入所致；之后的減少是由于沒有能建立正常聯(lián)系的神經(jīng)細(xì)胞死亡的結(jié)果[14]。這些變化主要發(fā)生在胚胎時期。本研究觀察的是胚胎期神經(jīng)細(xì)胞，但未發(fā)現(xiàn)此規(guī)律。本研究過程中細(xì)胞數(shù)目或許正在經(jīng)歷一個緩慢的由少到多的變化期，處在一個相對的穩(wěn)定期，還未經(jīng)歷到迅速增長期。

Puri等[15]報道同一物種同一神經(jīng)節(jié)(小鼠腰神經(jīng)節(jié))存在差別，這很可能與研究者運(yùn)用了不同的測量方法有關(guān)；但最突出一個特點是同一神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胞體的大小有一較大變化范圍,說明其胞體大小不一致。本研究也發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象，人胚胎三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞直徑大小在90～230 μm范圍內(nèi)變化。分析其原因有2個：(1)因為胚胎發(fā)育過程整個細(xì)胞胞體都在逐漸增加，本研究對象是一個動態(tài)連續(xù)的胎齡組，隨胎齡增大，直徑、面積及周長逐漸增大，在發(fā)育至25 w時出現(xiàn)一個迅速增長期。(2)對同一個神經(jīng)節(jié)來說，細(xì)胞胞體的大小本身就有大、小之分。

總之,本研究發(fā)現(xiàn)三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞直徑隨胎齡增長而增大，面積和周長隨胎齡增長而明顯增大，尤其以25～32 w增長明顯，說明此時期為三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育的一關(guān)鍵時期，但細(xì)胞數(shù)目無明顯變化。

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(本文編輯楊晨晨)