新疆維吾爾族、漢族結(jié)直腸癌患者中KRAS及BRAF基因突變差異及其與預(yù)后的關(guān)系研究

孫毅1, 艾力江·吐爾遜1, 楊娜2，古麗比也·沙比爾1, 趙化榮1, 王文然1, 劉攀1,

肖蕾1, 瑪依努爾·艾力1, 包永星1

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心， 烏魯木齊830054;2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院放療一科， 烏魯木齊830001)

摘要:目的探討新疆維吾爾族(維族)、漢族結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移患者中KRAS基因及BRAF基因突變差異及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。方法選擇新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2005年1月-2010年12月收治的100例新疆維、漢族結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移患者,應(yīng)用PCR及Pyrosequencing測(cè)序法檢測(cè)分析KRAS基因及BRAF基因突變情況，分析其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果維、漢族結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移患者的KRAS與BRAF基因突變率分別為28%(28/100)與5%(5/100)。50例漢族患者中KRAS基因突變18例, BRAF 基因突變2例；50例維吾爾族患者中KRAS基因突變10例，BRAF基因突變3例。原發(fā)腫瘤組織學(xué)分級(jí)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管瘤栓、肝外侵犯或轉(zhuǎn)移、KRAS和BRAF為結(jié)直腸癌的預(yù)后影響因素(P<0.05)；多因素分析顯示，脈管瘤栓(P=0.035)、KRAS基因(P=0.001)為結(jié)直腸癌的獨(dú)立的預(yù)后因素。結(jié)論在新疆維、漢族結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移患者中，脈管瘤栓及KRAS基因具有主要的預(yù)后價(jià)值。積極檢測(cè)KRAS基因，可望延長患者生存期。

關(guān)鍵詞:KRAS； BRAF; 新疆； 維吾爾族； 漢族； 結(jié)直腸癌； 同時(shí)性肝轉(zhuǎn)移； 預(yù)后

中圖分類號(hào)：R657.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.01.011

[收稿日期:2014-01-14]

Prognostic in role of KRAS and BRAF in colorectal cancer cases with

synchronous liver metastases in the Uyghur and Han nationality in Xinjiang

SUN Yi1，Ailijiang Tuerxun1，YANG Na2，Gulibiye Shabier1，ZHAO Huarong1，WANG Wenran1，

LIU Pan1，XIAO Lei1，Mayinuer Aili1，BAO Yongxing1

(1DepartmentofOncologyCenter,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830054,China;2TheXinjiangUygurAutonomousRegionPeople′sHospitaloftheFirst

Departmentofradiotherapy,Urumqi830001,China)

Abstract：ObjectiveTo analyse the relations among clinical pathological characteristics, prognosis and gene mutation of KRAS and BRAF with whom carry Colorectal Cancer Cases and Synchronous Liver Metastases in the uyghur and han nationality in Xinjiang. MethodsThe clinical and pathological data of Colorectal Cancer Cases with Synchronous Liver Metastases in the Uyghur and han nationality in Xinjiang treated at Xinjiang MedicaI University from January 2005 to December 2010 were retrospectively reviewed and analyzed，including KRAS and BRAF. ResultsKRAS and BRAF tumor mutation rates were 28.0% and 5.0%, respectively. Of 50 cases Han nationality ,18 cases KRAS and 2 cases BRAF were gene multation, of the uyghur, 10 cases KRAF and 3 cases BRAF. Univariate analysis with Kaplan-Meier methods revealed that the differentiation of the primary tumor, N status， lymphatic and vascular invasion， extrahepatic disease, KRAS and BRAF were prognostic factors (P<0.05)． Multivariate analysis showed that lymphatic and vascular invasion (P=0.035)， KRAS (P=0.001) were independent prognostic factors of colorectal cancer patients with synchronous liver metastases． ConclusionThe lymphatic and vascular invasion and KRAS have significant prognostic value for colorectal cancer with synchronous Iiver metastases． It is necessary to detect KRAS gene for Colorectal Cancer Cases with Synchronous Liver Metastases in the uyghur and han nationality in Xinjiang.

Key words: KRAS gene and BRAF gene; Colorectal Cancer in the Uyghur and han nationality in Xinjiang; Synchronous liver;Prognosis

結(jié)直腸癌(colorectal cancer)是危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率居惡性腫瘤的第3位[1]，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，遠(yuǎn)高于國際水平的2%。有研究顯示50%～60%被診斷為結(jié)直腸癌的病人將發(fā)展為結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移，其中80%～90%為不可切除的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者[2]。結(jié)直腸癌主要的治療方法是手術(shù)和放化療，但是療效并不理想。隨著現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展、分子靶向藥物的研發(fā)和個(gè)體化治療的應(yīng)用，使結(jié)直腸癌的治療進(jìn)入了分子靶向治療的新時(shí)期。Ⅱ期和Ⅲ期臨床隨機(jī)試驗(yàn)結(jié)果顯示, 使用抗表皮生長因子受體(EGFR)單克隆抗體(西妥昔單抗、帕尼單抗)治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，其療效與KRAS基因有無突變密切相關(guān)[3-5]。KRAS基因野生型患者可從抗EGFR單抗單藥治療或聯(lián)合化療中獲益，但KRAS基因第2號(hào)外顯子的第12或13位密碼子發(fā)生突變者不能受益。因此，美國《國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》(2012)中明確提出，KRAS基因狀態(tài)是使用EGFR單抗靶向藥物的療效預(yù)測(cè)指標(biāo)，KRAS野生型患者可接受EGFR抑制劑的治療，對(duì)于KRAS基因無突變(野生型)患者，建議檢測(cè)BRAF基因，有BRAF V600E突變的患者可能對(duì)EGFR單抗靶向藥物治療無效。鑒于KRAS和BRAF基因?qū)τ谥笇?dǎo)結(jié)直腸癌患者臨床用藥的重要性，本研究采用PCR擴(kuò)增-直接測(cè)序的方法檢測(cè)分析新疆維、漢族轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者KRAS及BRAF基因的突變情況,并探討其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1資料與方法

1.1臨床資料選擇新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2005年1月-2010年12月收治的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者100例，其中漢族50例，維吾爾族50例；男性37例，女性63例；年齡<60歲47例，≥60歲53例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都在術(shù)前被相關(guān)病理及檢查所明確診斷并明確有轉(zhuǎn)移,包括實(shí)驗(yàn)室檢查、胸片、腸鏡檢查、病理活檢及胸腹盆腔CT。(2)所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者在術(shù)前未行新輔助治療。(3)所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者都經(jīng)過影像學(xué)及病理檢查評(píng)估分期。排除沒有轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者。每例均取距腫瘤10 cm以上大腸黏膜作對(duì)照。

1.2檢測(cè)方法選取經(jīng)甲醛固定和石蠟包埋的腫瘤原發(fā)灶樣本并切片，采用基因科技(上海)有限公司GTpure FFPE組織DNA提取試劑盒抽提并制備DNA模板。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出KRAS第2外顯子片段，用Pyrosequencing測(cè)序法(PyroMark ID型Pyrosequencing焦磷酸測(cè)序儀(瑞典Biotage AB公司產(chǎn))檢測(cè)該位點(diǎn)是否突變。

1.3KPS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者的預(yù)后情況進(jìn)行KPS評(píng)分。0～49分：生活不能自理,需特別照顧;50～79分：生活可自理,但不能維持正?；顒?dòng)或工作;80～100分：可正常工作,有輕微癥狀或體征。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有資料采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，卡方檢驗(yàn)計(jì)算KRAS和BRAF基因在新疆維、漢轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中相關(guān)臨床病理參數(shù)的突變差異。Kaplan-Meier方法計(jì)算生存率，單因素分析采用Log-rank進(jìn)行比較；生存率的多因素分析采用Cox風(fēng)險(xiǎn)模型逐步回歸方法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1隨訪結(jié)果與總生存情況所有病例均獲隨訪。隨訪時(shí)間1～63個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為24個(gè)月。失訪3例，失訪率為3%。 截止2012年12月30日，100例患者中有3例患者存活，1年、2年、3年、5年生存率分別為50.70%、28.80%、13.10%、1.50%，中位生存時(shí)間為12個(gè)月，生存曲線圖見圖1。

圖1　維、漢族結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移患者的生存曲線圖

2.2KRAS基因突變情況及其類型100例樣本中KRAS突變28例，突變率為28%；BRAF突變5例，突變率為5%。50例漢族患者中KRAS基因突變18例, BRAF基因2例；50例維吾爾族患者中KRAS基因突變10例，BRAF基因突變3例。KRAS基因第12位密碼子的突變類型有GGT>GAT、GGT>G3T、GGT>AGT、GGT>TGT、GGT>GCT、GGT>CGT，第13位密碼子的突變類型有GGC>GAC、GGC>TGC。BRAF基因最常見的突變類型為V600E。

2.3單因素分析結(jié)果單因素分析結(jié)果顯示：原發(fā)腫瘤組織學(xué)分級(jí)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管瘤栓、肝外侵犯或轉(zhuǎn)移、KRAS和BRAF均對(duì)預(yù)后有影響。原發(fā)腫瘤分化程度低者、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者、有脈管瘤栓者、有肝外受侵者較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者、無脈管瘤栓者及無肝外受侵者較者預(yù)后差，KRAS野生型較突變型預(yù)后相對(duì)差和BRAF野生型較突變型預(yù)后相對(duì)差；而患者性別、年齡、族別、KPS評(píng)分、原發(fā)腫瘤T分期、肝轉(zhuǎn)移灶部位、肝轉(zhuǎn)移灶最大直徑、肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目及腫瘤大體類型對(duì)預(yù)后無影響(P均>0.05),見表1。

表1　100例新疆維漢民族結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后影響因素的單因素分析結(jié)果

2.4多因素分析結(jié)果將單因素分析中有意義的6個(gè)因素作自變量，生存時(shí)間作應(yīng)變量，應(yīng)用COX模型進(jìn)行多因素分析后發(fā)現(xiàn)脈管瘤栓(圖2)、KRAS (圖3)為獨(dú)立的預(yù)后危險(xiǎn)因素(P<0.05)(表2)。

圖2　脈管瘤栓與新疆維漢民族結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移

患者的累計(jì)生存曲線圖

圖3　KRAS基因與新疆維漢民族結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移

患者的累計(jì)生存曲線圖

表2　維、漢族結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移患者多因素分析結(jié)果

3討論

本研究單因素及多因素分析結(jié)果顯示，脈管瘤栓是新疆維、漢族結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。這與國內(nèi)外有關(guān)研究報(bào)道的結(jié)果相一致[6-7]。Nissan等[7]研究發(fā)現(xiàn)脈管瘤栓顯著降低5年無病生存率(36%)和疾病特異性生存率(37%)。脈管指管徑<300 μm的小動(dòng)脈、小靜脈和小的淋巴管，由于在光鏡下不易區(qū)分，被籠統(tǒng)地稱之為脈管。在腫瘤生長過程中，有大量的腫瘤微血管形成，為瘤細(xì)胞進(jìn)入血液創(chuàng)造了良好的解剖學(xué)基礎(chǔ)。一旦脈管內(nèi)的瘤細(xì)胞自身形成同聚物或與白細(xì)胞、血小板形成異聚合物，即形成了脈管瘤栓[8]。脈管瘤栓進(jìn)入黏膜下血管可以預(yù)測(cè)早期結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而侵入到血管外可以增加肝轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，提示一般狀況好的患者可以更好地耐受治療，獲得更多的治療機(jī)會(huì)，從而延長生存期；而出現(xiàn)脈管瘤栓的患者，雖然尚未出現(xiàn)腫瘤的影像學(xué)改變，但已有遠(yuǎn)處播散的趨勢(shì)，預(yù)后較差。特別是脈管瘤栓可以獨(dú)立預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn),但是目前由于此類組織標(biāo)本的缺乏，其相關(guān)機(jī)制還不是很清楚。

Roth等[9]報(bào)道約40%的結(jié)直腸癌患者中KRAS基因發(fā)生突變，主要集中在第二外顯子的第12和13密碼子上。KRAS基因作為結(jié)直腸癌中能夠預(yù)測(cè)抗表皮生長因子受體的分子靶向治療療效的標(biāo)記物已被廣泛認(rèn)可，但對(duì)其是否能夠預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌的預(yù)后仍存在爭議[10]。肝轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)，也是患者最重要的死亡原因之一[11]。對(duì)KRAS基因突變作為結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移預(yù)后的標(biāo)志物亦存在矛盾和爭議。Petrowsky等[12]對(duì)小樣本的回顧性研究中未發(fā)現(xiàn)KRAS基因?qū)τ诨颊呱娴挠绊?，?個(gè)大的多中心協(xié)作性研究“RASCAL Ⅰ&Ⅱ”分析了2 721例和4 268例結(jié)直腸癌患者的臨床資料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KRAS突變?cè)黾恿四[瘤復(fù)發(fā)及死亡的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是對(duì)Duke C期患者是影響無進(jìn)展生存和總體生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。需要強(qiáng)調(diào)的是，RASCAL研究沒有報(bào)道單因素生存分析結(jié)果，多因素分析中未包括肝臟轉(zhuǎn)移發(fā)生的情況以及是否接受手術(shù)治療等對(duì)于預(yù)后的影響。此外，手術(shù)切除肝臟轉(zhuǎn)移灶是治愈結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的最佳治療方式[13-14]。梁立等[15]根據(jù)將轉(zhuǎn)移灶是否接受手術(shù)切除進(jìn)一步分組分析，結(jié)果提示，在無肝轉(zhuǎn)移組中KRAS基因突變者腫瘤總生存期較短，在肝轉(zhuǎn)移灶切除者中KRAS突變者無復(fù)發(fā)生存時(shí)間較短，且是影響肝轉(zhuǎn)移組中轉(zhuǎn)移灶切除術(shù)后總體生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。與Cejas等[16]研究結(jié)果相似。但是在同時(shí)性轉(zhuǎn)移亞組、異時(shí)性轉(zhuǎn)移亞組中預(yù)后的差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本例數(shù)較少及隨訪時(shí)間較短有關(guān)。本研究單因素及多因素分析結(jié)果顯示KRAS基因是新疆維、漢族結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移患者獨(dú)立的預(yù)后因素，這與Conlin等[17]的研究結(jié)果相似，提示KRAS基因突變是獨(dú)立于結(jié)直腸癌分期的不良預(yù)后因素。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)脈管癌栓、KRAS是影響新疆維漢結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移的重要因素。但新疆維、漢結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移預(yù)后影響因素及其相對(duì)危險(xiǎn)度的最終結(jié)論，尚需通過大樣本的前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

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(本文編輯楊晨晨)