苦豆子總生物堿對小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞體外增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用的研究

李建光1， 牛清芝2， 楊曉藝1， 曾誠3， 黃偉4

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊830011;2中國石油烏魯木齊石化公司職工醫(yī)院藥械科， 烏魯木齊830019;

3新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊830011;4中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所藥物制劑研究室， 北京100050)

摘要：目的研究苦豆子總生物堿對小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞體外增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用。方法苦豆子總生物堿提取并純化，處理成澄清的藥物溶液后用于細(xì)胞給藥。CCK-8法測定不同濃度的苦豆子總生物堿作用24 h后4T1細(xì)胞存活率。流式細(xì)胞術(shù)檢測給藥24 h后4T1細(xì)胞凋亡率。結(jié)果與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組藥物濃度為5.00 mg/mL時，4T1細(xì)胞存活率為63.05%；藥物濃度為10.00 mg/mL時，4T1細(xì)胞存活率為20.30%,隨著給藥濃度的增加，細(xì)胞存活率呈明顯下降趨勢。實(shí)驗(yàn)組藥物濃度為6.25 mg/mL時，細(xì)胞凋亡率為11.4%；藥物濃度為10.00 mg/mL時，細(xì)胞凋亡率為41.7%,隨著給藥濃度的增加，細(xì)胞凋亡率明顯增加。結(jié)論苦豆子總生物堿能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用。

關(guān)鍵詞：苦豆子總生物堿； 4T1細(xì)胞； 細(xì)胞增殖； 抑制； 細(xì)胞凋亡

中圖分類號：R961文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.01.010

[收稿日期：2014-09-21]

基金項(xiàng)目：新疆醫(yī)科大學(xué)科研創(chuàng)新基金(XJC2012134)

作者簡介：潘燕(1975-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：腦血管疾病及周圍神經(jīng)病的診治，E-mail：panyan786016@sina.cn。

基金項(xiàng)目：新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研獎勵基金(2011YFY11)； 吳階平醫(yī)學(xué)基金(320.6799.1143)； 烏魯木齊市科技技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目烏市感染與腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(H111313001)

作者簡介：孫毅(1982-)，男，碩士，住院醫(yī)師，研究方向:腫瘤的基礎(chǔ)及臨床研究工作。

Proliferation inhibition and apoptosis induction effects of total alkaloid of

Sophora Alopecuroides on mouse mammary tumor 4T1 cells in vitro

LI Jianguang1, NIU Qingzhi2, YANG Xiaoyi1, ZENG Cheng3, HUANG Wei4

(1CollegeofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China；2Departmentof

Pharmacy,WorkersHospital,ChinesePetroleumUrumqiPetrochemicalCorporation,

Urumqi830019,China;3CollegeofTraditionalChineseMedicine,XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830011,China;4DepartmentofPharmaceutics，InstituteofMateriaMedica,

ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the proliferation inhibition and apoptosis effect of the total alkaloid of sophora alopecuroides (TASA) on mouse mammary tumor 4T1 in vitro. MethodsTASA was extracted and purified, and then TASA was administrated to mouse mammary tumor 4T1 cells. The inhibitory effect of TASA at different concentrations on 4T1 cells was determinated by CCK-8 assay at the time point of 24 h. The effect of TASA on 4T1 cells apoptosis was detected by flow cytometry. ResultsWith the drug concentration of 5.00 mg/mL, 4T1 cells survival rate was 63.05%, while the drug concentration reached to 10.00 mg/mL, 4T1 cells survival rate was 20.30%, which suggested that 4T1 cells survival rate significantly declined with the increase of drug concentration. With the drug concentration of 6.25 mg/mL, the apoptosis rate was 11.4%, while the drug concentration was 10.00 mg/mL, the apoptosis rate was 41.7%, which showed that apoptosis rate was increased significantly with the drug level increasing. ConclusionTASA could induce cell apoptosis of 4T1 cells, and it had a remarkable inhibitory effect on the proliferation of 4T1 cells.

Key words: total alkaloid of sophora alopecuroides; 4T1 cells; cell proliferation; inhibition; apoptosis

苦豆子(Sophora alopecuroidesL.)為豆科槐屬植物，多年生草本植物[1]。別名苦豆根、苦豆草，維吾爾語稱“布亞”，現(xiàn)收載于《中國藥典》、《新疆中草藥》和《維吾爾藥志》等[2]。生物堿是苦豆子中主要的代表性活性成分群，目前發(fā)現(xiàn)的生物堿主要屬于喹諾里西啶類，包括槐定堿、苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐胺堿等，共計(jì)20余種[3-6]。隨著研究的不斷深入，苦豆子總生物堿在抗腫瘤方面的作用越來越受到學(xué)者們的關(guān)注。近年來研究結(jié)果表明，苦豆子中的不同生物堿成分對人胃癌 MGC-803細(xì)胞、結(jié)腸癌 SW620細(xì)胞、人紅白血病細(xì)胞株K562、肝癌細(xì)胞 HepG2、Lewis肺癌、膀胱癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞增殖均有抑制作用[7-9]。本課題組前期研究大部分是針對生物堿單體作用于腫瘤細(xì)胞、生物堿單體與其他藥物聯(lián)合用藥作用于腫瘤細(xì)胞的研究。

乳腺癌是嚴(yán)重威脅全球女性健康的常見惡性腫瘤之一，在一些國家和地區(qū)其發(fā)病率高居女性腫瘤發(fā)病之首位，乳腺癌發(fā)病機(jī)制異常復(fù)雜，至今尚未完全闡明，因而缺乏有效的防治措施[10]。新疆是全國苦豆子主產(chǎn)區(qū)，可利用的自然資源豐富?？喽棺涌偵飰A作為具有開發(fā)前景的天然藥物組份，對其抗腫瘤作用的研究有利于充分發(fā)揮傳統(tǒng)民族藥在抗腫瘤方面的獨(dú)特效用。目前，苦豆子總生物堿有效部位治療乳腺癌的研究未見報道。小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1形成腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移特性與人類乳腺癌十分相似[11]。本研究以小鼠乳腺癌為研究對象，探討苦豆子總生物堿對4T1細(xì)胞的體外增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用，旨在為更進(jìn)一步的研究與應(yīng)用提供必要的基礎(chǔ)和依據(jù)。

1材料與方法

1.1藥材、儀器與試劑苦豆子(由新疆藥物研究所提供，經(jīng)新疆藥物研究所何江副研究員鑒定為真品)。調(diào)溫電熱套(KDM型，山東省鄄城永興儀器廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-2000A，上海亞榮生化儀器廠)，電熱恒溫水浴鍋(DZKW-S-4型，北京市永光明醫(yī)療儀器廠)，離心機(jī)(BY-400C-1型，北京白洋醫(yī)療器械有限公司)，臺式高速冷凍離心機(jī)(TGL-16K型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)，酶標(biāo)儀(MODEL550型，日本BIO-ROD公司)，流式細(xì)胞儀(Epics Altra型，beckman coulter公司)，超凈工作臺(BCM-1300A，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(HERAcell 150i，Thermo Fisher公司)。大孔吸附樹脂(HPD500型，滄州寶恩吸附材料科技有限公司)，0.25%胰酶(批號：140609，北京協(xié)和細(xì)胞資源中心)，胎牛血清(批號：20130511，蘭州百靈生物技術(shù)有限公司)，1640培養(yǎng)液(批號：201305，Thermo Fisher公司)，CCK-8(批號：JA611，DOJINDO laboratories)，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(批號：NB8826，欣博盛生物公司)。

1.2細(xì)胞小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所黃偉副研究員贈予。

1.3方法

1.3.1苦豆子總生物堿的提取與純化苦豆子藥材粉碎成粗粉，按料液比1∶8 ( m/V )加入70%乙醇，回流提取3次，每次1 h，合并濾液抽濾，濾液65℃條件下減壓回收乙醇，濃縮至每1 mL濃縮液含生藥0.4 g，采用HPD500型大孔吸附樹脂進(jìn)行分離純化，吸附速度1～2 BV/h，吸附時間>6 h，用蒸餾水洗脫4 BV后用40%乙醇洗脫5 BV，洗脫速度1～3 BV/h，收集40%乙醇洗脫液，濃縮干燥，得苦豆子總生物堿純化物粉末，置于干燥器中備用。

1.3.2苦豆子總生物堿藥物溶液的配制取苦豆子總生物堿純化物粉末加入PBS中溶解，配制成濃度為25 mg/mL的藥物溶液，完全溶解后于離心機(jī)中離心，12 000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm無菌濾膜過濾，即得用于細(xì)胞給藥的澄清藥物溶液。

1.3.3細(xì)胞存活率測定采用CCK-8法測定不同濃度苦豆子生物堿藥物溶液作用24 h后4T1細(xì)胞存活率。將細(xì)胞融合度達(dá)到95%的對數(shù)生長期4T1細(xì)胞接種于96孔板中(100 μL/孔)，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁生長后，分別加入不同濃度的藥物溶液。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組、對照組和實(shí)驗(yàn)組。空白組按100 μL/孔加入含10% FBS的1640培養(yǎng)液，設(shè)6個復(fù)孔；實(shí)驗(yàn)組分別加入5.00、10.00 mg/mL濃度的藥物溶液100 μL，每個濃度均設(shè)6個復(fù)孔；對照組設(shè)6個復(fù)孔，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL(含8×103個細(xì)胞)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10%CCK-8和細(xì)胞培養(yǎng)混合溶液100 μL，繼續(xù)孵育3 h，采用酶標(biāo)儀于450 nm處測定吸收值，并以650 nm為參考波長，計(jì)算細(xì)胞存活率，公式如下：

細(xì)胞存活率=[1-(OD實(shí)驗(yàn)-OD空白)/(OD對照-OD空白)]×100%

1.3.4細(xì)胞凋亡檢測采用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度苦豆子總生物堿藥物溶液作用24 h后4T1細(xì)胞凋亡率。取對數(shù)生長期的4T1細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化得單細(xì)胞懸液，1 100 r/min離心4 min，收集細(xì)胞，用含有10% FBS的1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度，以1×105個/孔加入12孔板，1 mL/孔，37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。對照組設(shè)4個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)組分別加入6.25、10.00 mg/mL濃度的藥物溶液100 μL，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，用5 mL EP管收集各組細(xì)胞。吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，收集洗滌液，加入0.5 mL胰酶消化細(xì)胞，加入1 mL培養(yǎng)液來回吹打20次，收集培養(yǎng)液，1 100 r/min離心4 min，吸去上清液，加入1 mL PBS洗滌，此過程重復(fù)2次，加結(jié)合液500 μL混合均勻，吹打均勻。室溫避光操作，加Annexin V-FITC 5 μL混合均勻，再加PI 5 μL混合均勻，室溫避光染色15 min，過300目篩網(wǎng)，上流式細(xì)胞儀檢測。

2結(jié)果

2.1苦豆子總生物堿對4T1細(xì)胞增殖的抑制作用與對照組未經(jīng)處理的4T1細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)組藥物濃度為5.00 mg/mL時，4T1細(xì)胞存活率為63.05%；藥物濃度為10.00 mg/mL時，4T1細(xì)胞存活率為20.30%。相同作用時間增加給藥濃度，細(xì)胞存活率明顯下降(圖1)。

圖1　不同濃度苦豆子總生物堿作用24 h后4T1細(xì)胞存活率

2.2苦豆子總生物堿對4T1細(xì)胞凋亡的影響實(shí)驗(yàn)組藥物溶液濃度為6.25 mg/mL時， 4T1細(xì)胞凋亡率為11.4%；藥物溶液濃度為10.00 mg/mL時， 4T1細(xì)胞凋亡率為41.7%。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，且隨著給藥濃度的增加，細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均明顯增加(圖2)。

A: 對照組

B: 6.25 mg/mL藥物溶液

C: 10.00 mg/mL藥物溶液

圖24T1細(xì)胞給藥后凋亡檢測結(jié)果

3討論

本研究采用CCK-8法測定細(xì)胞存活率，結(jié)果表明，苦豆子總生物堿對小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用。細(xì)胞凋亡是主要抗癌作用機(jī)制之一[12]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中包含著2條主要途徑，即外源性通路(主要由死亡受體介導(dǎo))與內(nèi)源性通路(主要通過線粒體相關(guān)蛋白活化)[13]。本實(shí)驗(yàn)對4T1細(xì)胞的活性進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，4T1細(xì)胞的存活率隨苦豆子總生物堿給藥濃度的增加而減??；根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)分析可知，苦豆子總生物堿作用后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，且隨著給藥濃度的增加，細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均明顯增加?？喽棺涌偵飰A能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞的增殖。

苦豆子生物堿抗腫瘤作用機(jī)制廣泛，涉及多個途徑，而且可能是多途徑同時起作用而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的。隨著研究的深入，將有更多新的苦豆子生物堿抗腫瘤作用機(jī)制不斷被發(fā)現(xiàn)。苦豆子生物堿對多種癌細(xì)胞有較好的抑制活性，對部分癌細(xì)胞顯示出較為特殊的抗癌機(jī)制，可見苦豆子總生物堿可能是一種廣譜抗癌組合物，也是一種值得深入研究和作為抗癌藥物模型的組合物。針對目前苦豆子中生物堿抗腫瘤作用機(jī)制研究較為分散，且對不同的腫瘤細(xì)胞顯示出多種作用機(jī)制，在未來的研究工作中應(yīng)選取適當(dāng)?shù)哪[瘤細(xì)胞進(jìn)行針對性研究，以及針對某一腫瘤細(xì)胞進(jìn)行多機(jī)制的探索研究。

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(本文編輯施洋)

通信作者：包永星，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:腫瘤綜合治療的研究工作,E-mail：baoyx@vip.sina.com。