維吾爾族靜脈血栓栓塞癥與凝血酶原G20210A和凝血因子V Leiden 突變的相關(guān)性研究

胡雪梅， 艾力曼·馬合木提， 夏玉寧， 古麗尼格爾·吾布力， 古麗米熱·吐尼牙孜

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心心力衰竭科, 烏魯木齊830011)

摘要：目的探討凝血酶原基因G20210A(FⅡG20210A)和凝血因子V基因Leiden 突變(FVL)單核苷酸多態(tài)性(SNP)及活化蛋白C抵抗(APCR)與維吾爾族(維族)靜脈血栓栓塞癥(VTE)的關(guān)系。方法選擇2008年1月-2013年6月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院住院的維族VTE患者178例(病例組)及本院同期同民族住院體檢者217例(健康對照組)。采用聚合酶鏈式反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-PFLP)技術(shù)檢測FⅡG20210A和FVL多態(tài)性，應(yīng)用凝固法于SYSMEX CS-2000型全自動血液凝固儀檢測APCR，并分析FⅡG20210A和FVL多態(tài)性及APCR與VTE的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果(1)所有受檢對象均未檢出FⅡG20210A基因突變，其變異頻率為0。(2)健康對照組中只有GG基因型，而未見GA和AA基因型，A等位基因頻率為0。病例組中FVL多態(tài)性GG型與GA/AA型分布頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.018)，且A等位基因分布頻率差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.018)。(3)病例組APCR陽性率較健康對照組高(11.24%與4.60%)，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但VTE患者FVL多態(tài)性各基因型間APCR陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(4)非條件logistic回歸分析后，肥胖(OR=1.599，95%CI 1.383～1.849，P=0.000)、高脂血癥(OR=1.087，95%CI 1.035～1.141，P=0.001)和APCR陽性(OR=1.922，95%CI 1.880～5.561，P=0.033)是VTE患者的獨立危險因素。結(jié)論凝血酶原G20210A基因突變在新疆維族VTE患者及正常人群中罕見甚至缺如。APCR及FVL多態(tài)性是維吾爾族VTE患者的危險因素，但FVL多態(tài)性不是引起APCR的主要因素。

關(guān)鍵詞：靜脈血栓栓塞癥； 凝血因子V； 凝血酶原基因G20210A； 維吾爾族； 活化蛋白C抵抗

中圖分類號：R543.2文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.01.009

[收稿日期：2014-02-24]

Association of polymorphism gene G20210A mutation or factor V Leiden mutation and

activated protein C resistance in Uyghur patients with Venous thromboembolism

HU Xuemei， Ailiman Mahemuti， XIA Yuning， Gulimire Tuniyazi， Gulinigeer Wubuli

(HeartCenter,FirstAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the association between the G20210A mutation of Prothrombin gene (FII G20210A), factor V Leiden mutation (FVL) and activated protein C resistance (APCR) in Uyghur patients with venous thromboembolism (VTE) in Xinjiang. Methods178 Uyghur ethnic diagnosed with VTE were admitted by First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University between January 2008 and June 2013, and 217 healthy Uyghur were studied as controls. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was applied to detect the polymorphism of FVL, FII G20210A and coagulation assay were adopted to determine APCR, and the association of FVL and APCR with VTE was analyzed. ResultsThe mutation of G20210A prothrombin gene were not detectable between any of the VTE patients and controls in Uyghur population. In VTE groups, FVL polymorphism GG and GA/AA gene types distribution frequency had significant differences (P=0.018), and A allele frequency difference was also significant (P=0.018). The mutation of FVL were not detectable in controls. The APCR positive rate in VTE groups were higher than that in controls (11.24% vs. 4.60%;). And there were significant differences in APCR positive rate between VTE patients and control groups (P<0.05). However, there were no significant differences in APCR positive rate of the FVL genotypes in VTE patients (P>0.05). Multifactor logistic regression analysis showed that, obesity (OR=3.189, 95%CI 1.255-8.102，P=0.015), hyperlipidemia (OR=6.430, 95%CI 1.370-30.190, P=0.018) and APCR (OR=1.922, 95%CI 1.880-5.561, P=0.033) were independent risk factors for Uygur ethnic with VTE. ConclusionThe mutation of G20210A prothrombin gene were not detectable between any of the VTE patients and controls in Uyghur ethnic. APCR and FVL mutation were independent risk factors for VTE patients, but FVL mutation may not be an independent factor for APCR.

Key words: pulmonary embolism; Factor V; Prothrombin gene; Uygur nationality; APCR

大量的國內(nèi)外研究表明，凝血酶原基因G20210A(FⅡG20210A)多態(tài)性導(dǎo)致凝血酶原水平增高和凝血因子V Leiden,FVL突變引起的活化蛋白C 抵抗(Activated protein C resistance，APCR)是西方白種人靜脈血栓形成(Venous Thromboembolism ，VTE)的遺傳危險因素[1]。然而影響白種人群靜脈血栓形成的主要遺傳缺陷FⅡG20210A 和FVL突變與APCR在非洲、亞洲、美洲、大洋洲人群中均很少見[2-3]，目前為止尚無新疆地區(qū)維吾爾族(維族)VTE人群與FⅡG20210A 、FVL及APCR的相關(guān)研究報道。由于特殊的地理及人文環(huán)境，維族人群形成了長期進食羊肉、羊油、高鹽和高糖飲食類的獨特飲食習慣，近年來伴隨著人們生活水平的逐漸提高，相應(yīng)的運動量減少等，導(dǎo)致肥胖、糖尿病以及血栓栓塞性疾病的發(fā)生率較其他民族高。近期已有研究發(fā)現(xiàn)維族、哈薩克族等少數(shù)民族中高血壓[4]、冠心病[5]、房顫[6]等動脈血栓性疾病的發(fā)病危險因素分布存在民族異質(zhì)性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)維族VTE患者的危險因素及亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)MTHFR C677T、C-反應(yīng)蛋白(CRP)1059G/C等基因多態(tài)性分布與漢族人群不同[7-8]，提示應(yīng)對維族患者在VTE發(fā)病機制方面進行進一步深入研究。本研究利用新疆地區(qū)獨特的民族資源，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)檢測FⅡG20210A 、FVL多態(tài)性，用改良的凝固法于SYSMEX CS-2000型全自動血液凝固儀檢測APCR，旨在探討維族FⅡG20210A、FVL多態(tài)性與APCR等遺傳性危險因素與VTE的相關(guān)性，從分子流行病學(xué)思路多角度探討維族VTE患者基因缺陷，識別高危人群。

1資料與方法

1.1研究對象選擇2008年1月-2013年6月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科、呼吸科、血管外科、急診科以及重癥監(jiān)護室等住院患者為觀察對象，連續(xù)收治有完整資料的維族VTE患者178例(病例組)，男性88例，女性90例，平均年齡為(53.09±14.32)歲。病例組患者中深靜脈血栓形成(Deep Vein Thrombosis，DVT)患者58例(32.58%)，肺血栓栓塞癥(Pulmonary thromboembolism，PTE)患者84例(47.19%)，DVT合并PTE 患者36例(20.23%)。選擇本院同期同民族住院體檢者217例為健康對照組，男性109例，女性108例，平均年齡為(52.54±13.60)歲。VTE診斷標準參照歐洲心臟學(xué)會2008年指南[9]。本研究通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查，所有研究對象在納入研究前均已簽署知情同意書。

1.2研究方法收集一般臨床資料如姓名、年齡、性別、有無肥胖、吸煙、飲酒史、家族史、有無異族通婚史、近期有無口服抗凝藥物史等。清晨空腹12 h抽外周靜脈血10 mL，5 mL用于生化檢查，采用本院Olympuse公司(日本)2700型全自動生化分析儀檢測空腹血糖、甘油三酯(Triglyceride，TG)、總膽固醇(Total Cholestrol，TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、血尿酸(UA)、肌酐(Cr)等。另5 mL靜脈血EDTA-Na抗凝，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3外周血白細胞提取DNA使用中量血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取基因組DNA。

1.4聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)(1)引物設(shè)計及合成(上海生物工程有限公司)：FVL F：5′-AGTTCAACCAGGGGAAACCT-3′，R：5′-TCTGAAAGGTTACTTCAAGGACAA-3′；FⅡF：5′- AGAGTAGGGGGCCACTCATAT TCT-3′，R：5′- ATAGCACTGGGAGCATTGAGG-3′。(2)PCR反應(yīng)體系：在20 μL反應(yīng)體系中含上游與下游引物各 0.5 μL、dNTP 10 μL、基因組DNA 2 μL、10×PCR緩沖液 7 μL及DNA聚合酶(博邁德)1 U。置于PCR儀(美國Bio-Rad公司)中。循環(huán)條件為： 95 ℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，退火溫度56℃，30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

1.5限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)在20 μL反應(yīng)體系中含有PCR產(chǎn)物10 μL、ddH2O 7 μL、酶切Buffer 2 μL、內(nèi)切酶1 μL(FVL反應(yīng)體系加入MnlI，F(xiàn)Ⅱ反應(yīng)體系加入Hind Ⅲ，酶均出自Fermentas 公司)，37 ℃ 水浴16 h，3%瓊脂糖凝膠-核酸染料(北京博邁德科技發(fā)展有限公司)，110 V電泳45 min，紫外線下觀察、攝影。將PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物與DNA片段長度標準物進行比較，以鑒定基因型。

1.6APCR檢測用APCR測定試劑盒(凝固法)在SYSMEX CS-2000型全自動血液凝固儀(SYSMEX公司)檢測，試劑盒由希森美康醫(yī)用電子有限公司提供。其結(jié)果正常范圍為0.69～1.56，超出范圍的均視為APCR。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)輸入Excel表格進行處理，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理。正態(tài)分布計量資料用均數(shù)±標準差(±s)描述，兩組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料采用χ2檢驗。研究對象及Hardy-Weinberg平衡的符合程度采用χ2檢驗，基因型分布及等位基因頻率由于存在頻數(shù)≤5，采用Fisher確切概率法。綜合評價各因素與VTE的相關(guān)性采用多因素Logistic回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1病例組與對照組一般臨床資料比較病例組與對照組年齡、性別的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，病例組體質(zhì)指數(shù)、吸煙、高血壓、糖尿病及血脂紊亂等水平均高于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

2.2FⅡG20210A多態(tài)性和FVL多態(tài)性的SNP分型病例組和對照組基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，表明研究對象來自同一群體，具有較好的代表性。

2.2.1FVL多態(tài)性分析本研究的特異PCR產(chǎn)物是一個載有突變位點1691G→A(即Leiden突變)的220 bp的DNA片段。酶切后基因型有3種：GG型(116 bp、67 bp和37 bp野生型)、GA型(153 bp、116 bp、67 bp和37 bp雜合突變)、AA型(153 bp、67 bp純合突變)。由于37 bp片段分子量較小,難以在瓊脂糖凝膠中顯示清楚，因此受檢個體正常個體為116、67 bp 2條電泳條帶(圖1)。隨機選擇部分樣本進行PCR產(chǎn)物克隆測序，測序結(jié)果和酶切分析結(jié)果一致(圖2)。

表1　維族病例組和對照組一般資料比較/[例(%), ±s]

表1　維族病例組和對照組一般資料比較/[例(%), ±s]

項目病例組(n=178)對照組(n=217)P值性別(男/女)88(49.40)/90(50.60)109(50.23)/108(49.77)0.932年齡/歲53.09±14.3252.54±13.600.765體質(zhì)指數(shù)/(kg/m2)28.39±4.3123.97±2.780.000吸煙93(52.21)161(74.25)0.001飲酒52(29.21)41(18.93)0.068高血壓78(43.84)101(46.51)0.706糖尿病112(62.93)95(43.88)0.007肌酐/(μmol/L)78.41±31.2881.89±31.890.408尿酸/(μmol/L)285.63±113.76296.54±137.520.528甘油三酯/(mmol/L)2.43±1.721.81±1.860.010總膽固醇/(mmol/L)4.86±1.524.23±1.060.000高密度脂蛋白/(mmol/L)3.29±1.541.61±1.310.033低密度脂蛋白/(mmol/L)2.40±0.812.59±0.860.103肌酸激酶/(U/L)74.75±36.0881.86±38.430.452肌酸激酶同工酶/(U/L)24.53±6.3022.10±11.430.295乳酸脫氫酶/(U/L)200.03±133.71205.68±210.750.821

M：DNA Marker；1：PCR產(chǎn)物；2、3：GG型；4、5：GA型

圖1FVL突變PCR產(chǎn)物各基因型酶切片段電泳結(jié)果

2.2.2FⅡG20210A多態(tài)性分析PCR產(chǎn)物為345 bp的DNA片段。所有PCR擴增有目的DNA片段的被檢者，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)Hind Ⅲ消化后電泳均只出現(xiàn)1條345 bp的DNA帶(圖3)，提示所有被檢者均為FⅡG20210G型即無突變基因者。

2.3FⅡG20210A多態(tài)性和FVL多態(tài)性基因型分布和等位基因頻率分析全部樣本均未檢出FⅡG20210A基因突變者。對照組中FVL多態(tài)性均為野生基因型，未發(fā)現(xiàn)純合型突變和雜合基因型。病例組與對照組FVL各基因型頻率分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.018)(表2)。

2.4FVL多態(tài)性與APCR的關(guān)系病例組與對照組APCR陽性率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.120，P<0.05)(表3)。病例組FVL多態(tài)性各基因型間APCR陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表4)。

圖2　FVL突變PCR產(chǎn)物測序圖(箭頭所指為突變位置堿基)

M：DNA Marker；1～3：PCR產(chǎn)物：4～7：酶切產(chǎn)物

組別例數(shù)基因型頻率GGGA+AAG等位基因頻率GA對照組217217(100.00)0(0.00)*434(100.00)0(0.00)*病例組178173(97.19)5(2.81)351(98.60)5(1.40)

注：與病例組比較， *P<0.05。

注：與對照組比較， *P<0.05。

2.5VTE患者危險因素分析為排除混雜因素的影響，以有無VTE作為因變量，年齡、性別、是否患有高血壓、糖尿病病史，是否吸煙、飲酒、高脂血癥，肥胖、APCR及FVL多態(tài)性基因型為自變量引入模型進行二項逐步Logistic回歸分析。結(jié)果提示，肥胖、高脂血癥和APCR陽性是維族VTE患者的獨立危險因素(表5)。

3討論

VTE是由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的一種多因素復(fù)雜性疾病。凝血酶原基因G20210A突變和凝血因子V G1691A(Leiden)突變是重要的血栓性疾病遺傳危險因子，且在不同地域、不同種族間的分布存在顯著差異。歐美白種人VTE患者G20210A的變異率顯著高于亞裔人群和非裔人群。Martinelli等[10]報道了高加索人群G20210A多態(tài)性的發(fā)生率及其與VTE的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)G20210A突變使VTE發(fā)生的危險性增加。Kobayashi等[11]在日本PTE患者中沒有發(fā)現(xiàn)凝血酶原基因G20210A多態(tài)性。Lijfering等[3]報道歐洲 788例有血栓形成傾向的患者亦無凝血酶原基因突變。然而鄭紅等[12]對中國676例正常中國人和500例高加索正常人群的FⅡG20210A的分布情況進行比較，結(jié)果提示FⅡ G20210A在中國人群中分布頻率極低，在血栓形成過程中的作用可能很小。本研究結(jié)果與Kobayashi等[11]及鄭紅等[12]、王秉林等的[13]研究結(jié)果一致，凝血酶原基因20210G/A突變在新疆維族的VTE患者及正常人群中為稀有突變甚至缺如，其變異頻率為0。由此推斷凝血酶原基因20210G/A多態(tài)性分布存在種族、地域的差異，其分布頻率在中國人中非常少見，更不是新疆地區(qū)維族VTE患者的獨立危險因素。

表5　多因素非條件Logistic回歸分析結(jié)果

FVL突變無可質(zhì)疑地奠定了白種人群VTE的遺傳基礎(chǔ)[14]。Arsov等[15]報道了歐洲人群FVL突變純合子基因型頻率為21.10%。Biswas等[16]對日本25例PTE患者及110例正常對照者的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)VL突變在日本為罕見突變。鄭紅等[12]同時對中國676例正常中國人和500例高加索正常人群FVL的分布情況比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均不存在凝血因子FVL突變。馮秀麗等[17]對新疆地區(qū)60例維族、57例哈薩克族、50例蒙古族和82例漢族健康人群進行FVL突變檢測，其研究結(jié)果均未檢出FVL突變類型。徐艷萍等[18]對新疆地區(qū)82例漢族健康人群進行FVL突變分析，亦未檢出FVL突變。以上這些研究僅對新疆地區(qū)維族及漢族健康人群FVL突變進行了一定的研究，但均未涉及維族VTE患者。本研究顯示維族正常對照組沒有發(fā)現(xiàn)FVL突變以及A等位基因的分布。VTE患者FVL多態(tài)性GG型173例中，5例GA型，沒有發(fā)現(xiàn)純合型；G等位基因頻率為98.60%，攜帶A等位基因頻率為1.40%。維族VTE組與對照組比較FVL各基因型頻率分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.018)。結(jié)果表明維族VTE人群存在FVL多態(tài)性，且純合子罕見，多以雜合子存在。維族VTE患者FVL多態(tài)性GA型以及A等位基因的分布頻率較健康人群發(fā)生率高，提示FVL多態(tài)性在維族VTE人群較健康人群更容易引起靜脈血栓形成，進一步證實了FVL多態(tài)性的分布存在民族差異。

已有大量文獻報道白種人群APCR及FVL突變和靜脈血栓存在關(guān)聯(lián)，90%～95%的APCR由FVL突變所致[19-20]。然而影響白種人群VTE的主要遺傳缺陷FVL突變及APCR的檢出率在非洲、亞洲、美洲等人群中發(fā)生率很低。Adeyemo等[21]研究發(fā)現(xiàn)APCR在尼日利亞人群的發(fā)生率僅為2%，未進行FVL突變檢測。近年來我國學(xué)者(包括臺灣地區(qū))對漢族VTE患者的遺傳危險因素進行了大量的研究，結(jié)果顯示在漢族健康人群中，APCR檢出率為3%～6%，未發(fā)現(xiàn)FVL突變[22-24]。邢顏超等[25]對新疆地區(qū)98例漢族、67例維族和54例哈薩克族健康個體進行研究分析，結(jié)果哈薩克族人群中檢出2例FVL 1691G→A突變雜合子；而漢族和維族人群中均未發(fā)現(xiàn)該突變類型，但未檢測APCR。以上研究僅對新疆地區(qū)維、漢族健康人群APCR和FVL突變進行了一定的研究，結(jié)果提示新疆不同民族APCR的發(fā)生存在種族異質(zhì)性，然而到目前為止，尚無有關(guān)維族VTE患者相關(guān)報道。本研究結(jié)果顯示，維族VTE患者APCR陽性率為11.24%，正常人群APCR的陽性率為4.60%，兩組APCR陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示APCR陽性的發(fā)生可能是導(dǎo)致VTE的危險因子。此外，VTE患者中，F(xiàn)VL多態(tài)性各基因型間APCR陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這與文獻[19-20]報道的歐美國家APCR陽性患者中有90%系FVL突變所致的結(jié)果顯然不同，而與文獻[23-25]報道的結(jié)果相似，進一步表明在中國人的APCR中，F(xiàn)VL可能不是主要原因，提示可能存在其他類型的FV基因突變，具體機制有待進一步研究。

本研究采用非條件Logistic多元回歸模型，在糾正混雜因素后，結(jié)果顯示肥胖(OR=1.599)、高脂血癥(OR=1.087)和 APCR陽性(OR=1.922)是維族VTE患者的獨立危險因素,而基因多態(tài)性以及等位基因頻率均未進入模型。此結(jié)果與本課題組前期對我院2004—2010年住院的516例PTE患者獲得性危險因素構(gòu)成及臨床特點回顧性分析研究結(jié)果[26]一致，表明肥胖、高脂血癥、APCR陽性與維族VTE的發(fā)生獨立相關(guān)。具體機制可能與多年來，由于特殊的地理環(huán)境及文化背景，維族人群形成了以羊肉、羊油、高鹽和高糖飲食為主的獨特飲食習慣，加上近年來生活水平的不斷提高、運動減少等，肥胖、糖尿病以及血栓栓塞性疾病的發(fā)生率較其他民族高相關(guān)。因此在VTE的防治方面對這類人群的生活習慣早期干預(yù)特別重要。

綜上所述， 肥胖、高脂血癥和APCR陽性是維族VTE人群的獨立危險因素，可能參與VTE的發(fā)生、發(fā)展。維吾爾族VTE人群中攜帶FVL多態(tài)性GA型和A等位基因的頻率明顯高于正常人群，故可以認為FVL突變是VTE患者的獨立危險因素。維族VTE和健康人群均存在APCR，但大約90%的具有APCR表型的個體并未攜帶 FVL突變，表明在新疆維族人群的APCR中，F(xiàn)VL可能不是主要原因，可能存在其他類型的FV基因突變，具體機制有待進一步研究。FⅡG20210A突變在新疆維族VTE患者及正常人群中罕見甚至缺如，且不是維族VTE的獨立危險因素。對新疆地區(qū)不同民族VTE患者開展常規(guī)的遺傳危險因素篩查，對預(yù)測和干預(yù)高危人群具有重大的臨床意義。

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(本文編輯楊晨晨)