新疆維、漢族鼻咽癌患者LMP2A特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)差異性研究

譚遙1， 陳婷1， 李亞偉1， 王若崢1,2

(新疆醫(yī)科大學(xué)1附屬腫瘤醫(yī)院放療中心,2新疆腫瘤學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊830011)

摘要：目的探討新疆維吾爾族、漢族鼻咽癌患者外周血潛伏膜蛋白2A(LMP2A)特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)的差異性。方法選擇114例鼻咽癌初治患者(維吾爾族48例,漢族66例)及120例健康志愿者(維吾爾族50例,漢族70例)，治療前抽取肘靜脈血，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)檢測(cè)外周血中LMP2A特異性T細(xì)胞(CTL)水平。比較鼻咽癌患者與健康志愿者、維吾爾族患者與維吾爾族健康志愿者、漢族患者與漢族健康志愿者、維吾爾族患者與漢族患者外周血LMP2A特異性CTL頻數(shù)的差異。結(jié)果鼻咽癌患者的外周血LMP2A特異性CTL水平明顯低于健康志愿者(P=0.031 6)；維吾爾族鼻咽癌患者和漢族鼻咽癌患者分別與同民族健康志愿者比較，外周血LMP2A特異性CTL頻數(shù)均低于同民族健康志愿者(P=0.032 9，P=0.047 9)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；漢族鼻咽癌的外周血中LMP2A特異性CTL水平亦高于維吾爾族鼻咽癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022 7)。結(jié)論鼻咽癌患者對(duì)于LMP2A特異性的T細(xì)胞免疫反應(yīng)明顯低于健康人群，這可能是EBV潛伏感染，最終導(dǎo)致鼻咽癌發(fā)生的重要原因之一。

關(guān)鍵詞：鼻咽癌； 潛伏膜蛋白2A； 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法； 特異性T細(xì)胞

中圖分類號(hào)：R739.63文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.01.001

[收稿日期：2014-10-21]

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81160327)，新疆維吾爾自治區(qū)國際合作項(xiàng)目(201141138，20126024)，科技部國際合作項(xiàng)目(2012DFA31560)

作者簡(jiǎn)介：劉凱(1989-)，男，在讀碩士，研究方向：頭頸部腫瘤放射治療基礎(chǔ)與臨床。

On the differential immune reaction of the LMP2A spicific T cell in Han and Uyghur

nasopharyngeal carcinoma patients in the Xinjiang Autonomous Region of China

TAN Yao1， CHEN Ting1， LI Yawei1, WANG Ruozheng1,2

(1DepartmentofRadiationOncology,AffiliatedTumorHospital,2KeyLaboratoryofOncology,

XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011，China)

Abstract：ObjectiveTo study the differential immune reaction of the LMP2A spicific T cell in Han and Uyghur nasopharyngeal carcinoma patients in Xinjiang. Methods114 Nasopharyngeal Carcinoma patients (Uyghur 48, Han 66) and 120 healthy donors (Uyghur 50, Han 70) were included in the study. 10 ml blood were taken before any treatment, PBMCs were separated and LMP2A specific T cell responses were measured by using ELISPOT assay. Compare the differences between nasopharyngeal carcinoma patients and healthy donors, Uyghur nasopharyngeal carcinoma patients and Uyghur healthy donors, Han nasopharyngeal carcinoma patients and Han healthy donors, Uyghur nasopharyngeal carcinoma patients and Han nasopharyngeal carcinoma patients. ResultsWe found significant difference of LMP2A specific T cell responses between NPC patients and healthy donors (P=0.031 6). We also found the significant difference of LMP2A specific T cell responses in another 3 groups：Uyghur NPC patients and Uyghur healthy donors (P=0.032 9)， Han NPC patients and Han healthy donors (P=0.047 9)， Uyghur and Han NPC patients (P=0.022 7). ConclusionThe lower immune reaction of the LMP2A spicific T cell in nasopharyngeal carcinoma patients may be one of the most important reasons about latent EBV infection, and eventually lead to the occurrence of nasopharyngeal carcinoma.

Key words: nasopharyngeal carcinoma; latent membrane protein 2; enzyme link immunal spot; specific T cells

鼻咽癌是來源于鼻咽部上皮的一種惡性腫瘤，其在我國東南沿海地區(qū)高發(fā)，在眾多的發(fā)病因素中，EB病毒(Epstein-Barr viru,EBV)的感染仍然是鼻咽癌發(fā)病的主要因素之一[1-4]。研究表明EBV主要表達(dá)潛伏膜蛋白1、2(LMP1、2)、EBV病毒核抗原1(EBNA1)等抗原[5]。其中LMP2又可以分為LMP2A、LMP2B，LMP2A被認(rèn)為可以提高上皮細(xì)胞生長和分化能力，并且與鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性,屬于功能結(jié)構(gòu)；LMP2B則通過調(diào)節(jié)LMP2A、LMP1的功能發(fā)揮作用。在人體內(nèi)針對(duì)病毒的免疫反應(yīng)中，細(xì)胞免疫起主要作用，而T細(xì)胞是細(xì)胞免疫中能夠直接殺傷外來入侵抗原的主要細(xì)胞之一。EBV作為一種外來病毒可以在鼻咽癌患者體內(nèi)長期潛伏并最終在局部產(chǎn)生腫瘤組織，是否可以推測(cè)鼻咽癌患者對(duì)EBV的特異性T細(xì)胞反應(yīng)減弱，最終導(dǎo)致EBV逃脫了機(jī)體的免疫監(jiān)視[6]?；谶@一假設(shè)，本研究采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)對(duì)初治114例維吾爾族(維族)、漢族鼻咽癌患者LMP2A特異性多肽介導(dǎo)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，并與健康人群進(jìn)行比較，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象選擇新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院頭頸放療科2008年1月-2013年12月收治的114例鼻咽癌初治患者，其中漢族66例，維吾爾族患者48例，所有患者均經(jīng)過病理確診，簽署知情同意書。選擇新疆醫(yī)科大學(xué)及新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的健康志愿者為健康組，其中漢族70例，維吾爾族50例，所有健康志愿者與患者均無親緣關(guān)系，維、漢族鼻咽癌患者一般情況見表1。

表1　維、漢族鼻咽癌患者一般情況

1.2外周血單個(gè)核細(xì)胞采集患者入院在未行任何治療前抽取肘靜脈血10 mL(EDTA抗凝)，采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，胎酚蘭染色計(jì)數(shù)，將細(xì)胞重懸，終濃度為4×106個(gè)/mL備用進(jìn)行檢測(cè)。健康志愿者抽取肘靜脈血10 mL(EDTA抗凝)，采用同樣的方法制備細(xì)胞懸液，用于ELISPOT檢測(cè)。

1.3LMP2A特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)用ELISPOT試劑盒(MABTECH Australia)的一抗包被帶硝酸纖維素膜的96孔板，2 h后用含10%胎牛血清(Sigma American)的細(xì)胞培養(yǎng)液(1640 Sigma American)阻斷反應(yīng)，向96孔板中加入制備好的細(xì)胞懸液50 μL，同時(shí)加入LMP2A全基因組特異性多肽(參考EBV-LMP2A多肽庫的序列圖，由牛津大學(xué)MRC人類免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室合成)，設(shè)立陰性對(duì)照孔(加入50 μL 細(xì)胞培養(yǎng)液)，陽性對(duì)照孔加入2 μL植物血凝素(PHA)，將反應(yīng)體系放入5% CO2、37℃孵育箱中過夜培養(yǎng)。第2天采用無菌PBS洗板6次，加入稀釋好的二抗50 μL，加蓋后室溫放置2 h；再次用無菌PBS洗板6次，每孔中加入稀釋好的三抗，加蓋后室溫下放置45 min；按說明書配制ALP顯色液，每孔加入50 μL，加蓋后室溫下放置15～20 min，去離子水沖洗96孔板。

1.4ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)控根據(jù)2006年美國病毒學(xué)雜志的報(bào)道和國內(nèi)應(yīng)用相同技術(shù)的研究資料提出的標(biāo)準(zhǔn)[7]，參考文獻(xiàn)[8]的判定標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照為每孔斑點(diǎn)數(shù)≥50個(gè)/106個(gè)細(xì)胞，陰性對(duì)照為斑點(diǎn)數(shù)≤5個(gè)/106個(gè)細(xì)胞。采用AID讀板機(jī)讀取反應(yīng)斑點(diǎn)數(shù)，并記錄備統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)試劑采用同一廠家、同一批次；實(shí)驗(yàn)設(shè)立質(zhì)控標(biāo)本，每周進(jìn)行1次質(zhì)控檢測(cè)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SAS9.2統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)鼻咽癌患者與健康志愿者的LMP2A特異性T細(xì)胞(CTL)免疫反應(yīng)產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行t檢驗(yàn)，分別對(duì)維吾爾族患者和漢族患者之間、維吾爾族患者和維吾爾族健康志愿者、漢族患者和漢族健康志愿者之間LMP2A特異性CTL數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)P=0.05。

2結(jié)果

2.1鼻咽癌患者與健康志愿者LMP2A特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)比較鼻咽癌患者LMP2A特異性CTL水平明顯低于健康志愿者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031 6)，見表2。

表2鼻咽癌患者與健康志愿者LMP2A特異性CTL數(shù)比較/(個(gè)/106,±s)

LMP2A特異性CTL數(shù)-x±s標(biāo)準(zhǔn)誤t值P值鼻咽癌患者169.85±188.3022.832.1740.0316健康志愿者295.59±432.1756.26

2.2維吾爾族、漢族鼻咽癌患者與維吾爾族、漢族健康志愿者LMP2A特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)比較維吾爾族和漢族鼻咽癌患者外周血LMP2A特異性CTL水平均低于健康志愿者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032 9，P=0.047 9)，見表3。

2.3維吾爾族、漢族鼻咽癌患者LMP2A特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)比較維吾爾族鼻咽癌患者LMP2A特異性CTL水平明顯低于漢族患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022 7)，見表4。

表3維、漢族鼻咽癌患者與維吾爾族、漢族健康志愿者

LMP2A特異性CTL數(shù)比較/(個(gè)/106,±s)

LMP2A特異性CTL數(shù)-x±s標(biāo)準(zhǔn)誤t值P值維吾爾族鼻咽癌患者100.00±88.1517.992.1870.0329維吾爾族健康所愿者337.79±526.0490.22漢族鼻咽癌患者207.95±216.5232.640.7110.0479漢族健康志愿者241.25±244.3832.65

表4維族、漢族鼻咽癌患者LMP2A特異性CTL數(shù)

比較/(個(gè)/106,±s)

LMP2A特異性CTL數(shù)-x±s標(biāo)準(zhǔn)誤t值P值維吾爾族鼻咽癌患者100.00±88.1517.992.3330.0227漢族鼻咽癌患者207.95±216.5232.64

3討論

多年來，EBV和鼻咽癌的關(guān)系一直是研究的重點(diǎn)，眾多的研究也表明EBV是鼻咽癌的主要致病原因之一，LMP是EBV表達(dá)的抗原蛋白，其表型包括LMP1、LMP2A和 LMP2B，其中主要具有免疫原性的單元為LMP2A[5-6,9]。在EBV 陽性表達(dá)的部分惡性腫瘤，如鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤中也可檢測(cè)到LMP2A表達(dá)，提示LMP2A可能參與EBV的長期潛伏，幫助其逃過免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，并且可能在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起一定作用[10-12]。Li等[13]用LMP2A轉(zhuǎn)染人類角質(zhì)化細(xì)胞株HaCaT，使細(xì)胞的增殖和分化能力明顯增強(qiáng)，并成功地在裸鼠體內(nèi)增殖形成移植瘤。在EBV潛伏感染的B細(xì)胞中，幾乎都可以檢測(cè)出LMP2A的基因產(chǎn)物，提示其具有潛在的T細(xì)胞激活表位，能介導(dǎo)殺傷性T細(xì)胞發(fā)揮作用。CTL細(xì)胞能否識(shí)別并殺傷LMP2A感染的靶細(xì)胞是能否清除EBV感染并抑制其進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵,近期已經(jīng)開始有研究將LMP2作為疫苗免疫EBV陽性的鼻咽癌患者，Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果提示安全且能有效提高特異性免疫反應(yīng)[14]。

細(xì)胞免疫是機(jī)體應(yīng)對(duì)病毒感染的主要免疫方式。被病毒感染的細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞表面可以表達(dá)特異性的抗原決定簇(由8～10個(gè)氨基酸的序列構(gòu)成)，抗原決定簇與主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子(major histocompatibility complex,MHCⅠ)形成的復(fù)合物，從而被CTL細(xì)胞識(shí)別，并誘導(dǎo)其產(chǎn)生特異性殺傷功能，T細(xì)胞同時(shí)可以分泌腫瘤壞死因子(TNF)、白介素(IL)、干擾素(IFN)等細(xì)胞因子而發(fā)揮效應(yīng)。CTL可以直接殺傷靶細(xì)胞。ELISPOT技術(shù)是目前國際上先進(jìn)的檢測(cè)特異性CTL功能和數(shù)量的方法，通過檢測(cè)分離出的外周血中CTL細(xì)胞對(duì)于特異性抗原刺激后分泌IFN-γ的淋巴細(xì)胞的水平,判斷CTL細(xì)胞的功能，是目前最為靈敏的免疫功能檢測(cè)方法，普遍用于各種免疫研究中[15-18]。

本研究顯示，鼻咽癌患者外周血LMP2A特異性的CTL細(xì)胞數(shù)目明顯少于健康志愿者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。維吾爾族患者與維吾爾族健康志愿者、漢族患者與漢族健康志愿者的比較均得到了相似的結(jié)果，提示鼻咽癌患者對(duì)LMP2A抗原刺激的免疫反應(yīng)能力明顯低于健康人群。本課題組前期的研究結(jié)果也提示鼻咽癌患者外周血中LMP特異性CTL水平在治療前后存在差異，治療后6個(gè)月明顯高于治療前水平[8]，與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。由于LMP2對(duì)EBV的潛伏感染起到重要的作用，可能是EBV相關(guān)的惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)之一[19]。鼻咽癌患者對(duì)LMP2A的免疫識(shí)別和清除能力下降，可能最終導(dǎo)致EBV在局部長期潛伏感染，并刺激上皮增生，導(dǎo)致腫瘤的最終發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)維吾爾族和漢族鼻咽癌患者外周血中的LMP2A特異性CTL數(shù)目存在差異。由于LMP2A已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)是通過HLA-A2限制性CTL來被免疫系統(tǒng)識(shí)別、產(chǎn)生免疫反應(yīng)的，Chen等[20]對(duì)HLA的研究結(jié)果也提示，維吾爾族和漢族人群在HLA-A2的表型上存在明顯的差異，維吾爾族人群更接近于高加索人種。維吾爾族和漢族患者LMP2A特異性CTL數(shù)目的差異主要可能還是由于2個(gè)民族在HLA-A2的分布差異導(dǎo)致的，通過對(duì)HLA-A2和外周血LMP2A特異性CTL水平進(jìn)行聯(lián)合研究可能可以得到較為明確的答案。

綜上所述，鼻咽癌患者對(duì)于LMP2A特異性的T細(xì)胞免疫反應(yīng)明顯低于健康人群，這可能是EBV潛伏感染、最終導(dǎo)致鼻咽癌發(fā)生的重要原因之一，通過提高機(jī)體對(duì)LMP2A的識(shí)別及免疫反應(yīng)，可能是對(duì)鼻咽癌患者進(jìn)行免疫治療的途徑之一。

參考文獻(xiàn)：

[1]曾毅.遺傳因素、環(huán)境因素及EB病毒在鼻咽癌發(fā)生中的作用研究[J].中國腫瘤,1995,4(3):24-25.

[2]時(shí)景偉,劉彬,魏成國,等.EBV引起人類相關(guān)疾病及其影響因素分析[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷,2011,15(2):304-306.

[3]Hildesheim A,Wang CP.Genetic predisposition factors and nasopharyngeal carcinoma risk:a review of epidemiological association studies[J].Semin Cancer Biol,2012,22(2):107-116.

[4]Ben-Nasr H,Chahed K,Remadi S,et al.Expression and clinical significance of latent membrane protin-1,matrix metaloproteiase-1 and Ets-1 transcription factor in tunisian nasppharyngeal carcinoma paients[J].Arch Med Res,2009,40(3):196-203.

[5]Raab-Traub N. Epstein-Barr virus in the pathogenesis of NPC[J]. Semin Cancer Biol，2002,12(6):43-41.

[6]Endo K,Kondo S,Shsckleford J,et al.Phosphorylated ezrin is associated with EBV latent membrane protein 1 in nasopharyngeal carcinoma and induces cell migration[J].Oncogene,2009,28(14):1725-1735.

[7]Braun RP, Payne LG, Dong L.Characterization of the IFN-gamma T-cell responses to immediate early antigens in humans with genital herpes[J].Virol J,2006 ,5(3):54.

[8]王若崢, 譚 遙, 王多明,等.酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法檢測(cè)鼻咽癌患者放療前后T細(xì)胞對(duì)EB病毒肽段的特異性反應(yīng)[J].腫瘤防治研究,2009,36(11):928-931.

[9]Rovedo M, Longnecker R. Epstein-Barr virus latent membrane protein 2B (LMP2B) modulates LMP2A activity[J]. J Virol 2007,81(1):84-94.

[10]Xing YP, Cen XN, Tong CR,et al. T cells recognizing EBV-epitopes arose in co-culture of peripheral blood mononuclear cells from EB-infected patients and dendritic cells loaded with LMP2-mixed peptides[J]. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue,2008, 16(2):392-396.

[11]Young LS, Rickinson AB. Epstein-Barr virus:40 years[J]. Nat Rev Cancer,2004,4(10):757-768.

[12]Kong QL, Hu LJ, Cao JY, et al. Epstein-Barr virusencoded LMP2A induces an epithelial-mesenchymal transition and increases the number of side population stem-like cancer cells in nasopharyngeal carcinoma[J].PLoS Pathol, 2010,6(6):e1000940.

[13]Li J, Zhang XS, Xie D, et al.Expression of immune-related molecules in primary EBV positive chinese nasopharyngeal carcinoma:associated with latent embrane protein2 (LMP2) expression[J]. Cancer Biol Ther, 2007,6(12):1997- 2004.

[14]Graham S. Taylor, Hui Jia, et al. A recombinant modified vaccinia ankara vaccine encoding epstein-barr Virus (EBV) target antigens: a phase I trial in UK patients with EBV-positive cancer[J]. Clin Cancer Res,2014,20(19):5009-5022.

[15]Seyed N, Taheri T, Vauchy C, et al. Immunogenicity evaluation of a rationally designed polytope construct encoding HLA-A*0201 restricted epitopes derived from leishmania major related proteins in HLA-A2/DR1 transgenic mice: steps toward polytope vaccine [J].PLoS One,2014, 9(10):e108848.

[16]Ranieri E, Popescu I, Gigante M.CTL ELISPOT assay[M].Methods Mol Biol, 2014,1186:75-86.

[17]Hazama S, Takenouchi H, Tsunedomi R,et al.Predictive biomarkers for the outcome of vaccination of five therapeutic epitope peptides for colorectalcancer[J].Anticancer Res,2014,34(8):4201-4205.

[18]Chaft JE, Litvak A, Arcila ME,et al. Phase Ⅱ study of the GI-4000 KRAS vaccine after curative therapy in patients with stage Ⅰ-Ⅲ lung adenocarcinoma harboring a KRAS G12C, G12D, or G12V mutation[J].Clin Lung Cancer,2014,15(6):405-410.

[19]胡麗富.EBV編碼的膜潛伏蛋白[J].癌癥，2002,21(5):559-566.

[20]Chen R, Ye G, Geng Z, et al.Revelations of the origin of chinese nation from clustering analysis and frequency distribution of HLA polymorphism in major minority nationalities in mainland china[J]. Yi Chuan Xue Bao,1993,20(5):389-398.

(本文編輯周芳)

通信作者：王若崢，女，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤放射治療應(yīng)用基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用，E-mail：wrz8526@163.com。