豬源性成分檢測(cè)中3種DNA提取方法比較

王萍,喬勇升,韓芷玲

(江蘇省泰州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇泰州225300)

摘要：為了達(dá)到對(duì)動(dòng)物源性成分快速、準(zhǔn)確的檢定，對(duì)提取動(dòng)物源性基因組DNA的方法進(jìn)行了比較分析?？疾旆?三氯甲烷法、聚乙烯吡咯烷酮法(PVP法)和試劑盒法這3種方法對(duì)DNA提取的濃度、純度及實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增效果的影響。結(jié)果表明：酚-三氯甲烷法提取DNA濃度最高，試劑盒法純度最高且實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增效果最好，但PVP法操作簡(jiǎn)單、安全、經(jīng)濟(jì)，提取的DNA用于實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增檢出限可達(dá)1.98 pg/μL。使用PVP法對(duì)市場(chǎng)上10份不同類型的動(dòng)物性產(chǎn)品進(jìn)行了檢測(cè)，檢出兩份產(chǎn)品中含有豬源性成分。PVP法應(yīng)是3種方法中的首選方法，本文為實(shí)驗(yàn)室選擇合適的DNA提取方法提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬源性；DNA提??；酚-三氯甲烷法；PVP法；試劑盒法；實(shí)時(shí)熒光PCR

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.06.011

收稿日期：2015-03-24

作者簡(jiǎn)介：王萍(1983—)，女，江蘇泰州人，工程師，碩士，研究方向：食品檢測(cè)，E-mail:wingping02091111@126.com

中圖分類號(hào)：TS207.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-3678(2015)06-0061-04

Abstract：In order to detect animal-derived material rapidly and accurately,we compared and analyzed the DNA extraction methods from the animal-derived material. We investigated the effect of three methods (phenol-chloroform method,polyvinylpyrrolidone method(PVP method) and reagent kit method) on the concentration of the extracted DNA,the purity of the extracted DNA and the result of the real-time fluorescent PCR amplification. The DNA concentration of the phenol-chloroform DNA extraction method was the highest,the purity of reagent kit was the highest and the effect of the real-time fluorescent PCR amplification was the best,but the PVP method was convenient,safe and economical,the detection limit of the real-time fluorescent PCR amplification was 1.98 pg/μL. Ten different types of animal products in the market were tested with PVP method,two products were detected to contain the porcine-derived material. The PVP method should be the preferred of the three methods. The assay provided a basis for the laboratory to choose a suitable DNA extraction method.

Keywords：porcine-derived; DNA extraction; phenol-chloroform method; PVP method; reagent kit method; real-time fluorescent PCR

Comparison of three DNA extraction methods in detection of porcine-derived material

WANG Ping,QIAO Yongsheng,HAN Zhiling

(Jiangsu Taizhou Institute for Food and Drug Control,Taizhou 225300,China)

食品安全關(guān)系著人類身體健康，是全社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái)肉制品摻假屢禁不止，肉制品以次充好，引起人們對(duì)食品安全的恐慌，這就要求食品監(jiān)管部門能夠?qū)?dòng)物源性成分進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢驗(yàn)和鑒定。

用于動(dòng)物源性成分的鑒定主要有物理、化學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等方法。其中，以檢測(cè)DNA為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、定量準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。DNA模板質(zhì)量對(duì)熒光定量PCR很關(guān)鍵，在提取過(guò)程中若是處理不當(dāng)，殘留的一些有機(jī)物以及其他一些雜物就會(huì)抑制PCR的進(jìn)行，從而造成假陰性，影響后續(xù)操作的進(jìn)行；此外不同實(shí)驗(yàn)材料的組分差異，不同方法所提取的DNA質(zhì)量也不盡相同，對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也存在差異[3-4]。提取基因組DNA的方法有很多：酚-三氯甲烷法是實(shí)驗(yàn)室常用的經(jīng)典DNA提取方法，商業(yè)化的基因組DNA提取試劑盒目前也被實(shí)驗(yàn)室廣泛使用，而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)在提取植物基因組DNA方面報(bào)道的較多[5-8]，在提取動(dòng)物基因組DNA方面報(bào)道的較少。

本文以豬肉為實(shí)驗(yàn)材料，考察這3種提取動(dòng)物源性基因組DNA方法，以期從中篩選出一種簡(jiǎn)單、快速、更適合于實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增檢測(cè)動(dòng)物源性基因組DNA的提取方法，從而為實(shí)驗(yàn)室提供方法依據(jù)。

1材料與方法

1.1　材料

豬肉以及10份不同類型的其他動(dòng)物性材料(蜜汁牛肉、牛肉丸 、牛肉切片、牛肉卷、牛柳、羊肉卷、羊肚、羊肉切片、羊排、羊腿)購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)或超市。所有材料買回后剪碎，裝入樣品袋，置于-20 ℃冰箱中備用。

1.2　主要試劑與儀器

TaKaRa DNA 提取試劑盒及實(shí)時(shí)熒光PCR豬源性DNA檢測(cè)試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司；抽提緩沖液(pH8.0)，Tris 0.05 mol/L，Na2EDTA 0.05 mol/L，SDS 30 g/L，使用HCl或KOH調(diào)節(jié)pH；提取緩沖液(pH 8.0)，Tris 0.2 mol/L，NaCl 0.25 mol/L，Na2EDTA 0.025 mol/L，SDS 50 g/L，使用HCl或KOH調(diào)節(jié)pH。

7500型熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司；Lambda 35型紫外-可見光分光光度計(jì)，美國(guó)PE公司；SORVall D-37520型高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo fisher公司。

1.3　3種DNA提取方法

采用酚-三氯甲烷法、PVP法、試劑盒法[10]3種方法對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行DNA提取。不同方法所用樣品量均為0.25 g，放入經(jīng)-20℃冰箱預(yù)冷24 h的研缽中，快速用力研磨粉碎后分裝于編號(hào)的2 mL離心管中，每種方法重復(fù)3次。

1.3.1酚-三氯甲烷法

分別稱取0.25 g粉碎的豬肉置于編號(hào)為F1、F2、F3的離心管中，具體操作參照文獻(xiàn)，其中RNA酶消化這一步省略。

1.3.2PVP法

分別稱取0.25 g粉碎的豬肉置于編號(hào)為P1、P2、P3的離心管中,加入1 mL提取緩沖液，65 ℃攪拌1 h，室溫下冷卻后將60 mg PVP粉末和0.5×體積的乙酸氨(7.5 mol/L)溶液與上清液混合，冰浴30 min；10 000g離心10 min，取上清液至另一離心管中，加入等體積的三氯甲烷和異戊醇(24∶1)混勻，12 000g離心5 min，抽提1次；將上清與等體積的異丙醇混合，-20 ℃放置30 min。4 ℃條件下10 000g離心10 min，棄上清液，70%乙醇溶液洗滌沉淀2次，干燥后溶于100 μL滅菌雙蒸水中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3試劑盒法

分別稱取0.25 g粉碎的豬肉置于編號(hào)為SH1、SH2、SH3的離心管中，具體操作見試劑盒說(shuō)明書。

1.4　DNA質(zhì)量檢測(cè)

取20 μL DNA樣品，加1 980 μL雙蒸水稀釋，充分混勻后，以雙蒸水做空白對(duì)照[11]，用紫外-分光光度計(jì)分別測(cè)定核酸在260、280和230 nm處OD值，OD260/OD280代表DNA的純度，OD260/OD280比值在1.8左右，表明DNA純度高，低表明有雜蛋白質(zhì)及苯酚[12]，高則表明有RNA；OD260/OD230比值通常大于2，低則可能有核苷酸、氨基酸、鹽等小分子物質(zhì)殘留。DNA濃度計(jì)算按照式ρ=OD260×稀釋倍數(shù)×50計(jì)算。

1.5　實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增檢測(cè)

3種方法所提DNA稀釋至10 μg/mL作為擴(kuò)增模板，使用ABI 7500熒光定量PCR儀擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25 μL，各成分組成：ddH2O 9.5 μL，2×Premix for Porcine 12.5 μL，Primer Mix for Porcine 1 μL，Probe Mix for Porcine 1 μL，DNA模板1 μL；PCR反應(yīng)程序：95 ℃，10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)，60 ℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。檢測(cè)試劑盒是采用雙標(biāo)記熒光(FAM、HEX)在同一反應(yīng)管內(nèi)對(duì)豬COX I基因及內(nèi)參照反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，若FAM熒光檢出，且Ct值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))≤35則視為檢出豬源性成分，若Ct值>35，則視為未檢出豬源性成分。

1.6　靈敏度檢測(cè)

提取的DNA模板用無(wú)菌雙蒸水10倍梯度稀釋，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，檢測(cè)所提DNA的擴(kuò)增檢測(cè)限。

2結(jié)果與討論

2.1　3種方法提取的DNA質(zhì)量比較

PCR擴(kuò)增對(duì)模板DNA的質(zhì)量要求較高，3種DNA提取方法在原方法上稍加改進(jìn)：首先用-20 ℃預(yù)冷的研缽研磨代替了-196 ℃的液氮研磨，操作上更加安全；酚-三氯甲烷法省去了RNA酶進(jìn)行RNA消化的過(guò)程，PVP法通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)需要增加1次三氯甲烷：異戊醇抽提才能去除蛋白質(zhì)，可能跟所選材料動(dòng)物性制品中脂肪和蛋白質(zhì)較多有關(guān)系。從表1中可以看出酚-三氯甲烷法提取的DNA濃度最高，PVP法提取的次之，試劑盒法提取的最低；但試劑盒法提取的DNA純度最高，酚-三氯甲烷法提取的DNA中含有一些RNA，PVP法提取的DNA中則有一些殘留的蛋白質(zhì)，3種方法提取的DNA中都有一些鹽等小分子物質(zhì)殘留。

2.2　3種方法提取的DNA實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增效果

3種方法提取的豬源性基因組DNA在相同質(zhì)量濃度(10 μg/mL)和條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，Ct值見表2。HEX和FAM熒光信號(hào)均被檢出，且FAM的Ct值在19.018～20.648之間，說(shuō)明3種方法提取的DNA在同濃度及同條件下擴(kuò)增效果相差不大，并且都可直接用于實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增檢測(cè)，都能滿足后續(xù)分子生物學(xué)的需要。其中試劑盒法的FAM熒光信號(hào)的Ct值最小，擴(kuò)增效果最好；酚-三氯甲烷法次之；PVP法的Ct值最高。由此，也進(jìn)一步說(shuō)明了DNA模板的質(zhì)量影響著熒光定量PCR反應(yīng)的進(jìn)行。

表1　3種方法提取豬源性基因組DNA質(zhì)量比較

表2　3種方法提取豬源性基因組DNA用于實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的 C t值

2.3　以PVP法提取的DNA為模板的檢出限試驗(yàn)

將PVP法提取的質(zhì)量濃度為198 μg/mL的DNA作為模板，10倍梯度稀釋后實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增檢測(cè)，各梯度反應(yīng)體系中的模板量分別為19.8、1.98、0.198、0.019 8和0.001 98 ng/μL，擴(kuò)增曲線見圖1。由圖1可知，實(shí)時(shí)熒光PCR可檢出1.98 pg/μL的DNA樣品。這說(shuō)明PVP法提取的DNA用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)靈敏度可達(dá)到皮克級(jí)。

圖1　 PVP法提取的DNA為模板的檢出限試驗(yàn) Fig.1　 Detection limit test using DNA extracted with PVP method as template

2.4　市售動(dòng)物性產(chǎn)品的豬源性成分檢測(cè)

隨機(jī)選取市場(chǎng)上10份不同類型的動(dòng)物性制品作為樣品，用PVP法提取DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增檢測(cè)豬源性成分，其中蜜汁牛肉和牛肉卷2份樣品檢出為陽(yáng)性，Ct值分別為17.222和20.401(均<35)，擴(kuò)增曲線見圖2。由圖2可見，這2份樣品都摻入了豬肉欺騙消費(fèi)者，2份陽(yáng)性樣品的檢出也說(shuō)明了PVP方法也適合于其他動(dòng)物性樣品的基因組DNA提取。

圖2　 PVP法檢測(cè)市售動(dòng)物性產(chǎn)品的豬源性成分 Fig.2　 Detection of porcine-derived material in animal products from the market with PVP method

3結(jié)論

3種方法所提DNA都可直接用于實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，其中酚-三氯甲烷法所提DNA濃度較高，但是該方法在操作上比較繁瑣，提取時(shí)間長(zhǎng)，有機(jī)溶劑抽提次數(shù)多，對(duì)人體有一定的傷害；試劑盒法所提DNA純度較高，提取時(shí)間最短，但是所得DNA量較少，且

試劑盒本身價(jià)格也較昂貴；PVP法操作過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，有機(jī)溶劑用得少，雖然實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增檢測(cè)Ct值是最高的，但是其DNA模板經(jīng)過(guò)稀釋，靈敏度可達(dá)到皮克級(jí)，完全滿足分子生物學(xué)的需求。

綜上所述，PVP方法操作簡(jiǎn)單、安全、經(jīng)濟(jì)、實(shí)時(shí)，熒光PCR擴(kuò)增效果好，可以檢出市售動(dòng)物性肉制品中的豬源性成分，是3種方法中的首選方法。

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(責(zé)任編輯荀志金)