β-半乳糖苷酶的篩選、克隆表達、酶學性質及其酶法合成低聚半乳糖

王欣，吳斌，何冰芳

(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京211800)

摘要：采用人工底物鄰硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(oNPG)為篩選標記,從耐有機溶劑微生物菌庫中,篩選出具有較高水解活性的β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌，再以乳糖為底物考察菌株低聚半乳糖的合成性能，篩選得到1株產(chǎn)β-半乳糖苷酶的Erwinia billingiae WX1。根據(jù)GenBank中相同屬種的基因組序列推測β-半乳糖苷酶基因，克隆得到β-半乳糖苷酶基因gal，并在大腸桿菌中實現(xiàn)了來源于Erwinia billingiae菌β-半乳糖苷酶的克隆表達。該基因的開放閱讀框(ORF)為1 428 bp，編碼475個氨基酸，理論相對分子質量為5.2×10`4。鎳柱法分離純化得到電泳純的β-半乳糖苷酶GAL，其酶學性質研究表明最適催化溫度55 ℃，最適pH 7.0；Mg`(2+)、Mn`(2+)對該酶起較強促進作用， EDTA對該酶抑制作用較強。利用β-半乳糖苷酶GAL的轉糖基作用，以乳糖為底物合成低聚半乳糖，初步優(yōu)化的反應條件：底物乳糖質量濃度400 g/L，每克乳糖添加酶量 1.0 U，在40 ℃反應16 h后，低聚半乳糖合成率達到34%(質量分數(shù))，顯示了較好的開發(fā)前景。

關鍵詞：Erwinia billingiae；β-半乳糖苷酶；克隆表達；酶法合成；低聚半乳糖

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.06.006

收稿日期：2014-04-04

基金項目：高等學校博士學科點專項基金(20123221130001)；國家自然科學基金(21376119)

作者簡介：王欣(1988—)，女，遼寧營口人，碩士研究生，研究方向：生物化工；何冰芳(聯(lián)系人)，教授，E-mail:bingfanghe@njtech.edu.cn

中圖分類號：Q93

文獻標志碼：A

文章編號：1672-3678(2015)06-0030-06

Abstract：Strains were screened from organic solvent tolerant bacteria,though the hydrolysis of o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (oNPG).After rescreened by lactose as using lactose as substrate,strain Erwinia billingiae WX1 showed high transgalactosidation.Based on the nucleotide sequence of the β-galactosidase from Erwinia billingiae,the gene encoding the β-galactosidase GAL was cloned and expressed in Escherichia coli. The gene consists of 1 428 bp,and the translated protein encodes 475 amino acids and its molecular mass is approximately 5.2×10`4. After purification,the purity of this enzyme showed that the optimal pH and temperature were 7.0 and 55 ℃,respectively. Its activity was notably promoted by Mg`(2+),Mn`(2+),whereas EDTA had high inhibition to the enzyme. The enzyme synthesis of galacto-oligosachorides was studied by using its transgalactosylation. The optimum synthesis condition of galacto-oligosachorides was as follows:400 g/L lactose,1.0 U β-galactosidase GAL,reaction with temperature 40 ℃ for 16 h,under the conditons,the production rate of galacto-oligosachorides was 34%. Our findings demonstrate that the recombinant β-galactosidase has good development prospects.

Keywords：Erwinia billingiae; β-galactosidase; cloning expression; enzymatic synthesis; galacto-oligosachorides

Screening,cloning,expression,characterization of β-galactosidase and enzymatic synthesis of galacto-oligosaccharides

WANG Xin,WU Bin,HE Bingfang

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

低聚半乳糖(galacto-oligosaccharide,GOS)是在乳糖分子的半乳糖基一側連接上1～4個半乳糖基生成的低聚糖類，屬于葡萄糖和半乳糖組成的雜低聚糖。低聚半乳糖作為功能性低聚糖，具有促進腸道內益生菌增殖、緩解乳糖不耐癥等功效。目前，市場上銷售的乳制品中很多添加低聚半乳糖，具有廣闊的應用前景。利用酶法合成低聚半乳糖，是工業(yè)生產(chǎn)低聚半乳糖的主要方法。

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC 3.2.1.23),又稱乳糖酶(GAL)，能夠水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖。有些β-半乳糖苷酶在水解乳糖分子中β-1,4半乳糖苷鍵的同時，具有轉糖基作用，通常以水解產(chǎn)物半乳糖為供體，以底物乳糖為受體，生成低聚半乳糖。該酶廣泛存在于動物、植物及微生物中，其中微生物是β-半乳糖苷酶的主要來源。然而，國內用β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的產(chǎn)率相對較低，因此篩選具有高合成性能的β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌株具有重要意義。

筆者篩得1株產(chǎn)β-半乳糖苷酶的ErwiniabillingiaeWX1，克隆該酶的基因，并在大腸桿菌中進行異源表達，以實現(xiàn)來源于Erwiniabillingiae菌β-半乳糖苷酶的克隆表達，在此基礎上純化β-半乳糖苷酶，考察該酶的酶學性質，并利用該酶催化合成低聚半乳糖。

1材料與方法

1.1　主要試劑和材料

pMD-18T Vector、限制性內切酶Hind III和NdeI、T4 DNA ligase，TaKaRa公司；大腸桿菌(Escherichiacoil)DH5a和BL21(DE3)、質粒pET-28a(+)由筆者所在實驗室提供，鄰硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(oNPG)，Sigma公司；酶標儀Power Wave XS,美國Bio-Tech公司；ultimate 3000型戴安高效液相色譜儀(HPLC)，美國Thermo公司。

初篩培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5、蛋白胨10、NaCl 10、瓊脂20。pH 7.0。滅菌后冷卻再加入oNPG 1 g/L。

復篩培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基g/L)：可溶性淀粉1、乳糖10、酵母粉2、胰蛋白胨6、CaCl20.5、MgSO4·7H2O 1.5、KH2PO42、脲0.5、TW-80 0.5×10-4。pH 7.5。

1.2　 β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌株的篩選和鑒定

以筆者所在課題組自行篩選并保存的超過1 600株耐有機溶劑微生物為篩選菌庫，從凍存管接種于LB固體培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)24 h，將菌株點樣轉接到含人工底物oNPG的初篩培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落邊出現(xiàn)亮黃色圈的為有β-半乳糖苷酶水解活力的菌株。

將具有β-半乳糖苷酶水解活力的菌株接種到復篩培養(yǎng)基中培養(yǎng)，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，再以乳糖為底物，通過薄層層析分析，篩選出具有轉糖基活性的β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌株。運用16S rDNA序列分析，對篩選的目的菌株進行菌種鑒定。

1.3　 β-半乳糖苷酶的基因克隆、異源表達

1.3.1β-半乳糖苷酶的基因克隆

參照GenBank中典型菌株ErwiniabillingiaeEb661基因組推測的β-半乳糖苷酶基因序列和表達載體pET-28a(+)的多克隆位點設計正向引物P1：(SF)5′-C￣G￣G￣C￣A￣T￣A￣T￣G￣A￣G￣T￣A￣A￣G￣G￣T￣C￣A￣C￣C￣A￣T￣C￣A￣A￣C￣A -3′(下劃線處為NdeI酶切位點)；反向引物P2：(SR)5′-C￣A￣T￣A￣A￣G￣C￣T￣T￣T￣T￣A￣T￣T￣T￣C￣A￣T￣T￣T￣C￣A￣T￣C￣A￣T￣C￣A￣A￣G￣G￣G￣A -3′(下劃線處為Hind III 酶切位點)。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收PCR產(chǎn)物。將目的片段連接到 pMD18-T載體，熱激轉化E.coliDH5α。篩選陽性菌落，提取重組質粒，經(jīng)酶切鑒定后進行測序。將測序正確的重組質粒用Hind III和NdeI酶切后，回收目的片段，連接至用相同雙酶切后的pET-28a(+)載體中，轉化E.coliBL21，在含卡那霉素(50 μg/mL)的LB平板篩選陽性轉化子。

1.3.2β-半乳糖苷酶的異源表達

挑取陽性轉化子于4 mL LB(含50 μg/mL卡那霉素)培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，以2%的接種量轉接到40 mL相同培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)，當培養(yǎng)液OD600達到0.5～0.6時，加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L，30 ℃誘導培養(yǎng)8 h后，離心收集細胞。用磷酸緩沖溶液(50 mmol/L，pH 7.0)懸浮細胞，超聲破碎細胞，于4 ℃下，12 000 r/min離心15 min，收集上清液作為粗酶液，進行酶活測定及SDS-PAGE分析。

1.3.3β-半乳糖苷酶酶活力及蛋白含量的測定

參照文獻[7-8]進行β-半乳糖苷酶酶活力及蛋白含量的測定。人工底物的分光光度法檢測靈敏度高，不易受干擾，操作方便，本實驗采用oNPG為底物的比色法進行β-半乳糖苷酶酶活的測定。蛋白質含量的測定參照Bradford法，以牛血清白蛋白(BSA)為標準蛋白。

1.4　 β-半乳糖苷酶的分離純化及酶學性質

1.4.1β-半乳糖苷酶的分離純化

利用pET-28a(+)表達載體在N端所帶His標簽，在β-半乳糖苷酶的N端引入His標簽，表達后用親和層析(鎳柱)進行純化，純化方法見參照文獻[9-10]，純化后的酶進行酶活測定及SDS-PAGE分析。用所獲得純酶進行酶學性質研究。

1.4.2β-半乳糖苷酶的酶學性質

1)反應溫度、pH對β-半乳糖苷酶活力的影響將反應體系(純酶置于pH 6.0緩沖溶液中)分別在30～70 ℃的水浴鍋中進行反應，檢測不同溫度對β-半乳糖苷酶活力的影響。在最佳反應溫度下，將反應體系分別置于pH 5.0～9.0的緩沖液(Na2HPO4-KH2PO4緩沖液)中，檢測反應pH對β-半乳糖苷酶活力的影響

2)β-半乳糖苷酶的熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性酶熱穩(wěn)定性的測定是取同樣濃度的β-半乳糖苷酶，分別置于30～70 ℃的水浴鍋中，每隔5 h取樣測定殘余酶活力。酶pH穩(wěn)定性的測定是取同樣濃度的β-半乳糖苷酶，分別置于不同pH緩沖液中(由磷酸緩沖配制)，于40 ℃保溫放置，每隔5 h取樣測定殘余酶活力。

3)金屬離子及EDTA的影響為了考察金屬離子對β-半乳糖苷酶的影響，在酶液中分別添加Cu2+等金屬離子(金屬離子終濃度分別為10 mmol/L和1 mmol/L)，于30 ℃下放置1 h后檢測β-半乳糖苷酶活力。以未添加離子的酶液作為對照，考察金屬離子對酶活力的影響。

4)有機溶劑的耐受性將該酶放置在體積分數(shù)為20%的不同有機溶劑條件下，定時取樣測定殘余酶活力，考察酶對不同溶劑的耐受性。

1.5　 β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖

1.5.1低聚半乳糖合成初始條件及產(chǎn)率計算

催化反應的初始體系(1 mL反應體系)：300 g/L乳糖，加酶量1.0 U(以1 g乳糖計)，pH 6.5的磷酸緩沖液，溫度35 ℃、180 r/min下反應，在24 h內每隔4 h取樣檢測低聚半乳糖的合成率。以不加酶的反應體系為對照。

低聚半乳糖合成產(chǎn)率的計算見式(1)。

(1)

式中：A為反應結束后測得的葡萄糖、半乳糖和乳糖的總質量濃度(g/L)，B為初始反應時添加乳糖的質量濃度(g/L)。

1.5.2低聚半乳糖的檢測

薄層層析(TLC)檢測條件：轉糖基產(chǎn)物點樣于硅膠板，展開劑展開，霧噴顯色劑，于120 ℃顯色。展開劑為V(正丁醇)∶V(乙酸)∶V(水)=8∶4∶1；顯色劑為20% H2SO4配制的0.5%的3,5-二羥基甲苯。

HPLC檢測條件：色譜柱為Kromasil氨基柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水溶液(兩者體積比為75∶25)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃；進樣量10 μL，檢測器為示差折光檢測器。單糖(葡萄糖和半乳糖)、乳糖、三糖和四糖的保留時間分別為10.3、14.8、17.3和23.7 min。

2結果與討論

2.1　 β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌株的篩選

對保存的耐有機溶劑微生物菌庫中的1 632株菌，采用人工底物oNPG為篩選標記,產(chǎn)β-半乳糖苷酶的菌株能夠水解oNPG產(chǎn)生黃色的鄰硝基苯酚(oNP)。根據(jù)顯色反應篩選，獲得產(chǎn)β-半乳糖苷酶的菌株258株，將初篩菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，以乳糖為底物，進一步進行乳糖轉糖基反應，利用TLC進行篩選，結果見圖1。由圖1可知：通過篩選獲得具有轉糖基活性的β-半乳糖苷酶的菌株6株，其中第6號菌株為轉糖基活性較好的菌株WX1，可作為進一步研究的候選菌。通過HPLC檢測菌株WX1轉糖基活性(圖2)，并通過16S rDNA序列分析，該菌株被鑒定為Erwiniabillingiae，命名為ErwiniabillingiaeWX1。

圖1　 轉糖基反應產(chǎn)物TLC分析 Fig.1　 Analysis of transgalactosylation products by TLC

1—單糖;2—乳糖;3～4—低聚半乳糖 圖2　 轉糖基反應產(chǎn)物HPLC分析 Fig.2　 Analysis of transgalactosylation products by HPLC

2.2　 β-半乳糖苷酶的基因克隆及異源表達結果

根據(jù)在GenBank中搜索ErwiniabillingiaeEb661菌中推測的β-半乳糖苷酶基因序列設計引物，擴增到約1 400 bp的PCR產(chǎn)物，與預期大小一致。經(jīng)限制性內切酶NdeI 和Hind III雙酶切后插入經(jīng)相同酶切的質粒pET-28a(+)中得到重組質粒pET-gal。圖3為pET-gal雙酶切驗證圖。對pET-gal插入部分測序表明，ErwiniabillingiaeWX1的β-半乳糖苷酶基因的開放閱讀框(ORF)為1 428 bp，編碼475個氨基酸，理論相對分子質量為5.2×104。與ErwiniabillingiaeEb661基因組推測的β-半乳糖苷酶的同源性達到99%，氨基酸序列一致，但是ErwiniabillingiaeEb661菌β-半乳糖苷酶未曾報道。將鑒定后的重組質粒pET-gal轉化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，得到重組菌BL21/pET-gal。重組菌BL21/pET-gal經(jīng)過誘導表達條件的初步優(yōu)化，比酶活達到2.83 U/mL，約為對照菌BL21/pET酶活力的30倍。利用重組蛋白的His標簽進行鎳柱親和層析純化后，SDS-PAGE分析顯示純化后的目的蛋白呈單一條帶(圖4)，其表觀相對分子質量約為5.2×104,與推測的理論相對分子質量一致。純化后比酶活提高20倍，β-半乳糖苷酶回收率達到10.3%(表1)。首次實現(xiàn)來源于Erwiniabillingiae菌β-半乳糖苷酶的克隆表達。

M—標準DNA;1—NdeI+Hind III雙酶切pET-gal結果； 2—β-半乳糖苷酶基因；3—NdeI+Hind III雙酶切pET-28a結果 圖3　 pET-gal雙酶切驗證圖譜 Fig.3　 Digestion of recombinant plasmid pET-gal

M—標準蛋白;1—BL21/pET上清； 2—BL21/pET-gal上清液；3—純化后的β-半乳糖苷酶 圖4　 重組蛋白的SDS-PAGE電泳 Fig.4　 SDS-PAGE analysis of recombinant plasmid pET-gal

表1　 β-半乳糖苷酶GAL純化參數(shù)

2.3　 β-半乳糖苷酶的酶學性質

2.3.1溫度及pH對β-半乳糖苷酶的影響及其熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性

圖5為溫度對β-半乳糖苷酶活力的影響結果。由圖5可知，β-半乳糖苷酶最適反應溫度為55 ℃。比嗜熱脂肪芽胞桿菌XG24的β-半乳糖苷酶的最適溫度65 ℃稍低[11]，與來自米曲霉的β-半乳糖苷酶的最適溫度相似[12]。

圖5　 溫度對β-半乳糖苷酶活性的影響及其熱穩(wěn)定性 Fig.5　 Optimum temperature and thermal stability of β-galatosidase

pH對β-半乳糖苷酶活力影響結果見圖6。由圖6可知，pH對酶活力的影響顯著。由圖6還可以看出，β-半乳糖苷酶催化體系pH范圍較窄，β-半乳糖苷酶最適反應pH為7.0。與來自嗜熱乳酸菌的β-半乳糖苷酶的最適pH相似[13]，乳球菌G2005的β-半乳糖苷酶的最適pH為6.5[14]。

圖6　 pH對β-半乳糖苷酶活性的影響及其pH穩(wěn)定性 Fig.6　 Optimum pH and pH stability of β-galatosidase

由圖5還可知，在50 ℃以下放置50 h后，酶活力殘留92%以上，該酶在50 ℃以下有很好的熱穩(wěn)定性，與已報道青霉L7的β-半乳糖苷酶在50 ℃處理5 h酶活殘留80%[13]相比，該酶GAL有很好的熱穩(wěn)定性。由圖6還可知，該酶在pH 5.0～9.0體系中放置50 h后，在各pH體系酶活均殘留90%以上，表明該酶GAL有很好的pH穩(wěn)定性，而嗜熱脂肪芽胞桿菌XG24的β-半乳糖苷酶在pH4.0～7.5處理1 h，其酶活殘留90%[11]。

2.3.2金屬離子及EDTA對酶活的影響結果

表2為金屬離子及EDTA對GAL酶活的影響結果。由表2可知：在催化體系中若適當加入Mg2+、Ba2+、Mn2+及Fe3+離子，可以提高β-半乳糖苷酶GAL的酶活，而Cd3+、Cu2+對糖苷酶活有一定的抑制作用。與來源于短芽胞桿菌L2004的β-半乳糖苷酶相似[15]。通常，β-半乳糖苷酶的活性中心由2個酸性氨基酸殘基組成。由表2還可知，EDTA顯著抑制GAL的酶活，可推測金屬離子對該β-半乳糖苷酶維持活性結構具有關鍵作用。

表2　金屬離子及EDTA對 β-半乳糖苷酶活性的影響

2.3.3酶對有機溶劑的耐受性分析

有機溶劑對β-半乳糖苷酶活性的影響結果見圖7。由圖7可知：在體積分數(shù)為20%的甲醇、乙醇、丙酮的體系中保溫200 h，酶活無顯著變化，體現(xiàn)了很高的耐受性。其他有機溶劑體系中保溫200 h，活力保持72%以上，表明該酶對多種有機溶劑有很好的耐受性。

圖7　 有機溶劑對β-半乳糖苷酶活性的影響 Fig.7　 Effects of organic solvents on the stability of β-galatosidase

圖8　 β-半乳糖苷酶催化乳糖反應進程曲線圖 Fig.8　 Time course of lactose reaction by β-galatosidase

2.4　 β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖

通過對反應時間、反應溫度、底物濃度、酶量等條件進行優(yōu)化，優(yōu)化的反應條件如下：底物乳糖質量濃度400 g/L，酶量1.0 U/g(以1 g乳糖計)，反應溫度40 ℃，反應16 h,低聚半乳糖產(chǎn)率達到34%(質量分數(shù))，而后再延長反應時間，產(chǎn)物有少量水解。與巨大芽胞桿菌β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖產(chǎn)率25.68%(質量分數(shù))[15]相比有所增高。產(chǎn)率與Aspergillusoryzae的β-D-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的產(chǎn)率[16]相近。

3結論

以人工底物oNPG為篩選標記初篩,通過乳糖轉糖基反應復篩，成功篩選到1株產(chǎn)β-半乳糖苷酶的菌株ErwiniabillingiaeWX1。該菌的β-半乳糖苷酶基因未曾被報道,實現(xiàn)了該菌株的β-半乳糖苷酶的克隆表達，并對酶學性質，催化合成低聚半乳糖進行了研究。

酶學性質研究表明，β-半乳糖苷酶GAL在溫度為55 ℃、最適pH為7.0時對各種有機溶劑體現(xiàn)了很好的耐受性，同時具有較好的溫度穩(wěn)定性。

該β-半乳糖苷酶(GAL)轉糖基合成低聚半乳糖，經(jīng)過合成條件的初步優(yōu)化，GOS產(chǎn)率達到34%(質量分數(shù))。同時轉糖基這個特性不僅可以用于低聚半乳糖的合成，還可應用于生產(chǎn)低乳糖高低聚半乳糖乳制品，解除源于乳糖酶缺乏的乳糖不耐受癥，同時改善乳制品的風味和營養(yǎng)，具有進一步的應用開發(fā)前景。

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(責任編輯荀志金)