釀酒酵母產(chǎn)D-乳酸重組菌的構(gòu)建與發(fā)酵

汪兆峰,石貴陽(yáng),張梁

(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122)

摘要：采用基因工程方法對(duì)釀酒酵母進(jìn)行代謝改造，使酵母產(chǎn)生乳酸代謝途徑。將來(lái)源于L. mesenteroides和E.coli的D-乳酸脫氫酶基因，分別插入帶有G418抗性的酵母穿梭質(zhì)粒pYX212-kanMX上，電轉(zhuǎn)化酵母，得到2株生產(chǎn)D-乳酸的釀酒酵母重組菌S. cerevisiae WE1510和S. cerevisiae WB1186。進(jìn)一步搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)表明：重組菌S. cerevisiae WB1186在YEPD培養(yǎng)基、20 g/L糖、pH 5的條件下生長(zhǎng)條件最好，并具有更好的產(chǎn)乳酸能力。經(jīng)3 L發(fā)酵罐條件下驗(yàn)證，S. cerevisiae WB1186分批發(fā)酵96 h，最終乳酸積累量達(dá)到18.0 g/L；發(fā)酵條件為培養(yǎng)基YEPD，接種量10%，溶解氧(DO)30%，轉(zhuǎn)速150 r/min，初始葡萄糖質(zhì)量濃度10 g/L，控制pH 5.0，通氣量3 L/min，OD600最大值轉(zhuǎn)為厭氧發(fā)酵。

關(guān)鍵詞：D-乳酸;D-乳酸脫氫酶;Leuconostoc mesenteroides;釀酒酵母;代謝改造

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.06.002

收稿日期：2013-03-27

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2011AA02A205、2012AA021201);教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(NCET-11-0665)

作者簡(jiǎn)介：汪兆峰(1987—)，男，山東濟(jì)南人，碩士研究生，研究方向：生物工程；石貴陽(yáng)(聯(lián)系人)，教授，E-mail: gyshi@jiangnan.edu.cn

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ812

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-3678(2015)06-0006-07

Abstract：A Saccharomyces cerevise strain was constructed by genetic engineering method,with lactic acid metabolic pathways. The gene dldh,encoding a lactate dehydrogenase from L. mesenteroides and E. coli,was cloned into a yeast shuttle vector PYX212-kanMX. The resultant plasmid pYX212-kanMX-DLDH was introduced into W303-1A by electroporation method and obtained two recombinant S. cerevisiae WE1510 and S. cerevisiae WB1186.Subsequently,a recombinant D-lactic acid producing yeast WB1186 was obtained,which had a better ability to produce D-lactic acid.It was up to 18.0 g/L of the lactic acid accumulation by batch fermentation in a 3-L fermenter for 96 h and the preliminary fermentation conditions were as follows,culture medium YEPD,inoculating rate 10%,DO 30%,stirring rate 150 r/min,concentration of glucose 10 g/L,pH 5.0, aeration rate 3 L/min,when OD600 up to maximum, the fermentation was turned to anaerobic.

Keywords：D-lactic acid;DLDH;Leuconostoc mesenteroides;Saccharomyces cerevisiae;metabolically engineered

Construction of metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae forD-lactic acid production

WANG Zhaofeng,SHI Guiyang,ZHANG Liang

(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology,Key Laboratory of Industrial Biotechnology

of the Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

乳酸是自然界最小的手性分子，全世界近80%的廠家采用直接發(fā)酵法生產(chǎn)光學(xué)純度L-乳酸。D-乳酸是合成多種手性物質(zhì)的前體，在醫(yī)藥、農(nóng)藥、化工等方面的應(yīng)用十分廣泛[2-5]。目前，世界乳酸的總生產(chǎn)能力為25萬(wàn)t/年，總產(chǎn)量為13萬(wàn)t/年，并以每年6%～8%遞增，總消費(fèi)量為10萬(wàn)t/年，D-乳酸的市場(chǎng)前景廣闊[6-7]。

D-乳酸的生產(chǎn)通常采用乳酸菌屬的細(xì)菌，例如乳酸桿菌，已有報(bào)道利用纖維素和大米淀粉為原料生產(chǎn)D-乳酸；另一方面，由于乳酸細(xì)菌難以在高密度下培養(yǎng)，并且大多表現(xiàn)為生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷，基因工程改造的大腸桿菌產(chǎn)D-乳酸漸漸發(fā)展起來(lái)[10-11]。D-乳酸發(fā)酵合成過(guò)程中，為了平衡不斷降低的pH，常需要補(bǔ)加中和劑，如CaCO3、NaOH、Ca(OH)2等來(lái)中和所產(chǎn)生的乳酸[12]。而在產(chǎn)物提取過(guò)程中，又需要用濃H2SO4將乳酸鹽進(jìn)行酸化，置換出乳酸，同時(shí)形成大量CaSO4的廢雜，對(duì)環(huán)境造成極大的污染[13]。酵母菌能夠耐受較低的pH環(huán)境，為開(kāi)發(fā)在不補(bǔ)加中和堿的工藝下進(jìn)行有機(jī)酸發(fā)酵的工業(yè)菌種提供了可能[14-15]。Ishida等[16]在釀酒酵母菌株的染色體上整合2個(gè)拷貝的來(lái)自Leuconostocmesenteroides的dldh編碼基因，同時(shí)替換掉丙酮酸脫羧酶編碼基因pdc1，所獲得的重組菌株SaccharomycescerevisiaeYILM-2B在補(bǔ)加堿中和發(fā)酵液pH的條件下，D-乳酸產(chǎn)量為61.5 g/L，發(fā)酵結(jié)束時(shí)pH為2.8，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.612；在不補(bǔ)加堿的發(fā)酵條件下，可發(fā)酵530 g/L的葡萄糖合成54.2 g/L游離D-乳酸，其產(chǎn)物光學(xué)純度在99.9%以上。此外，在馬克斯克魯維重組酵母KluyveromycesmarxianusCD590中異源表達(dá)DLDH，也可發(fā)酵合成較高濃度的D-乳酸，且產(chǎn)酸速率較快[15，17]。

筆者以釀酒酵母為宿主菌，采用基因工程技術(shù)構(gòu)建可有效生產(chǎn)D-乳酸的重組酵母，以期為利用酵母發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸進(jìn)行有益探索。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒

菌株LeuconostocmesenteroidesB1186、E￣s￣c￣h￣e￣r￣i￣c￣h￣i￣acoli1510、S￣a￣c￣c￣h￣a￣r￣o￣m￣y￣c￣e￣scerevisiaeW303-1A來(lái)源于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC NO.1.10327、NO.1.8732和NO.2.3853)；質(zhì)粒載體pYX 212-kanMX保存于工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10。用于固體培養(yǎng)基時(shí)添加15～20 g/L 瓊脂粉；挑選轉(zhuǎn)化子時(shí)添加200 μg/mL 的G418 抗生素。

LB培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10，蛋白胨10，酵母膏5。用于固體培養(yǎng)基時(shí)添加20 g/L 瓊脂粉；挑選轉(zhuǎn)化子時(shí)添加終質(zhì)量濃度為30 μg/mL 的卡那霉素。

發(fā)酵培養(yǎng)基1(g/L)：葡萄糖20，酵母膏10，蛋白胨20，(NH4)2SO45，MgSO46.5，K2HPO41.5，CaCl20.55 g/L，NaNO31，KCl 1，F(xiàn)eSO41[18]。

發(fā)酵培養(yǎng)基2(g/L)：葡萄糖 20，酵母膏10，(NH4)2SO45，MgSO46.5，CaCl22.0，KH2PO41.5[18]。

發(fā)酵培養(yǎng)基3(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨15，酵母粉25，KH2PO42.4，K2HPO4·3H2O 16.34[19]。

1.1.3酶和試劑

Taq酶、T4連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶，購(gòu)自大連TaKaRa公司；引物由上海生工技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2　方法 [20]

1.2.1細(xì)菌染色體的提取

取菌懸液1.5 mL，12 000 r/min離心2 min，收集菌體，無(wú)菌水洗滌2次，無(wú)菌水600 μL，加10～20 μL溶菌酶，輕輕混勻，37 ℃培養(yǎng)箱放置30 min。向其中加入60 μL 200 g/L十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液混勻，立刻加入蛋白酶K 10 μL，(注：前后時(shí)間不得超過(guò)2 min)，65 ℃水浴2～6 h。溫浴完畢，加入等體積的苯酚、氯仿(各300 μL)振蕩，12 000 r/min離心10 min。取上清，再加入等體積的酚，氯仿抽提，進(jìn)行2～4遍。取上清，加100%乙醇沉淀染色體，待烘干后加30～50 μL水溶解作為PCR模板待用。

1.2.2目的基因的PCR 擴(kuò)增及克隆

根據(jù)LeuconostocmesenteroidesD-乳酸脫氫酶基因(dldh)序列(GenBank:L29327.1)設(shè)計(jì)引物。dldhb1186-U：5′-C￣G￣C￣G￣G￣A￣T￣C￣C￣A￣T￣G￣A￣A￣G￣A￣T￣T￣T￣T￣T￣G￣C￣T￣T￣A￣C￣G￣G￣C-3′，dldhb1186-D：5′-A￣C￣G￣C￣G￣T￣C￣G￣A￣C￣T￣T￣A￣A￣T￣A￣T￣T￣C￣A￣A￣C￣A￣G￣C￣A￣A￣T￣A￣G￣C-3′(下劃線所示分別為BamHⅠ、SalⅠ酶切位點(diǎn))。PCR 反應(yīng)體系體積為50 μL，擴(kuò)增條件：96 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，共25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

根據(jù)EscherichiacoliD-乳酸脫氫酶基因(dldh)序列(GenBank:U36928)設(shè)計(jì)引物如下。dldhe1510-U：5′-C￣C￣G￣G￣A￣A￣T￣T￣C￣A￣T￣G￣A￣A￣A￣C￣T￣C￣G￣C￣C￣G￣T￣T￣T￣A￣T￣A￣G￣C-3′，dldhe1510-D：5′-C￣G￣C￣G￣G￣A￣T￣C￣C￣T￣T￣A￣A￣A￣C￣C￣A￣G￣T￣T￣C￣G￣T￣T￣C￣G￣G￣G-3′(下劃線所示分別為EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位點(diǎn))。PCR 反應(yīng)體系體積為50 μL，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.3質(zhì)粒的構(gòu)建

將PCR獲得的D-乳酸脫氫酶基因分別用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，經(jīng)純化后與經(jīng)同樣酶切的質(zhì)粒pYX212-kanMX連接，按照質(zhì)量比1∶10的比例加入10 μL連接體系，于16 ℃培養(yǎng)箱連接過(guò)夜。次日42 ℃熱擊90 s轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞。37 ℃溫育1 h，涂布終質(zhì)量濃度100 μg/mL卡那霉素-LB抗性平板，37 ℃培養(yǎng)10 h。挑取轉(zhuǎn)化子，用引物進(jìn)行菌落PCR，挑取菌落PCR正確的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，然后酶切驗(yàn)證目的基因的大小。構(gòu)建重組質(zhì)粒pYX 212-kanMX-dldhb1186與pYX 212-kanMX-dldhe1510。將驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子送華大基因進(jìn)行測(cè)序。電轉(zhuǎn)化S.cerevisiaeW303-1A挑選轉(zhuǎn)化子。

1.2.4酵母轉(zhuǎn)化

將酵母接種于20 mL 液體YEPD 培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)過(guò)夜；轉(zhuǎn)接10% 菌液于50 mL YEPD 培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)8～10 h；將菌液冰浴30 min，4 ℃冷凍離心機(jī)中5 000 r/min離心5 min，收集菌體；棄上清，加入一定量提前預(yù)冷的無(wú)菌水洗滌菌體，離心收集菌體；棄上清，加入一定量提前預(yù)冷的山梨醇溶液(1 mol/L)洗滌菌體，離心收集菌體；重復(fù)3次，離心收集菌體，吸凈上清，加入0.2 mL 預(yù)冷的山梨醇混勻菌體；取0.2 mL 菌懸液分裝1.5 mL離心管，加入50 μL 質(zhì)粒DNA，混勻，冰浴10 min，將菌懸液全部轉(zhuǎn)入已預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，1 500 V、5 ms電擊1 次；電轉(zhuǎn)之后立刻取出，用等體積的1 mol/L山梨醇溶液將轉(zhuǎn)化菌從電轉(zhuǎn)杯中洗出，取100 μL 涂布抗性平板。

1.2.5轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證

在G418抗性平板上挑取較大的轉(zhuǎn)化子，點(diǎn)種高抗性平板傳代培養(yǎng)，置30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d；挑取高抗性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)至0.5 mL離心管中，加水30 μL混勻，沸水煮10 min作為模板，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證是否轉(zhuǎn)入D-乳酸脫氫酶基因。

1.2.6發(fā)酵HPLC驗(yàn)證

1)種子液制備將PCR驗(yàn)證得到的轉(zhuǎn)化子接種入YEPD培養(yǎng)基中(50 mL三角瓶，20 mL裝液量)，加G418至終質(zhì)量濃度200 μg/mL，培養(yǎng)24 h。

2)發(fā)酵液制備接種種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基(250 mL三角瓶，50 mL裝液量)，接種量10%，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)入?yún)捬醢l(fā)酵，瓶口保鮮膜密封，30 ℃培養(yǎng)箱靜置2～3 d。定時(shí)取樣，高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定是否有乳酸。

3)分析方法生長(zhǎng)量測(cè)定方法：對(duì)不同時(shí)間發(fā)酵液取樣，稀釋一定倍數(shù)后用721 型分光光度計(jì)于600 nm 處測(cè)其吸光值OD600。殘?zhí)菧y(cè)定方法：生物傳感儀測(cè)定發(fā)酵液內(nèi)殘?zhí)呛?。HPLC法測(cè)定有機(jī)酸：發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min 離心5 min，取700 μL 上清液加入700 μL 10%的三氯乙酸，沉淀蛋白質(zhì)2 h 以上后，12 000 r/min 離心15 min，0.45 μm混纖微孔濾膜過(guò)濾后，通過(guò)HPLC進(jìn)行測(cè)定。分析條件為色譜柱Shodex KC-811，流動(dòng)相0.01 mol/L H2SO4，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量15 μL，柱溫60 ℃，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

1.2.7重組菌搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

1)種子液制備將重組菌從YEPD 抗性平板上刮取一單菌落至YEPD 液體培養(yǎng)基(50 mL三角瓶，裝液量為10 mL)中，添加G418至終質(zhì)量濃度200 μg/mL，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h，即為種子液，轉(zhuǎn)接發(fā)酵液時(shí)接種量為10%。

2)培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)的影響接種轉(zhuǎn)化子S.cerevisiaeW303-1A/ pYX212-kanMX-d￣l￣d￣h￣b￣1￣1￣8￣6(WB1186)和S.cerevisiaeW303-1A/pYX212-kanMX-dldhe1510(WE1510)分別于發(fā)酵培養(yǎng)基1、2、3和YEPD中，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)48 h，每隔6 h取樣，于分光光度計(jì)600 nm處測(cè)定其生長(zhǎng)情況，W303-1A作為空白對(duì)照。

3)糖濃度對(duì)轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)的影響采用YEPD培養(yǎng)基，以葡萄糖作為碳源，接種轉(zhuǎn)化子WB1186與WE1510于初始糖質(zhì)量濃度為20、60、100、140、180和200 g/L的培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)48 h，每隔6 h取樣，于分光光度計(jì)600 nm處測(cè)定其生長(zhǎng)情況。

4)pH對(duì)轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)的影響采用初始糖質(zhì)量濃度20 g/L的YEPD培養(yǎng)基，用乳酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH分別為3、4、5、6和7，接種轉(zhuǎn)化子WB1186與WE1510，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)48 h，每隔6 h取樣，于分光光度計(jì)600 nm處測(cè)定其生長(zhǎng)情況。

5)轉(zhuǎn)化子乳酸耐受性YEPD培養(yǎng)基，20 g/L初始糖，初始pH為5，接種轉(zhuǎn)化子WB1186于分別添加乳酸5、10、15、20和25 g/L的培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)48 h，每隔6 h取樣，于分光光度計(jì)600 nm處測(cè)定其生長(zhǎng)情況。

1.2.8重組菌3 L罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

1)種子液制備將重組菌WB1186從YEPD 抗性平板上刮取一單菌落至YEPD液體培養(yǎng)基(250 mL 三角瓶，裝液量為50 mL) 中，添加G418至終質(zhì)量濃度200 μg/mL，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)24 h，即為種子液，轉(zhuǎn)接發(fā)酵液時(shí)接種量為10%。

2)3 L發(fā)酵罐初步發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)酵采用YEPD培養(yǎng)基，裝液量2 L，控制發(fā)酵溫度30 ℃，pH控制在5(100%氨水調(diào)節(jié))，溶氧(DO)維持在30%左右，轉(zhuǎn)速150 r/min；當(dāng)菌體達(dá)到一定OD不再生長(zhǎng)后，其他條件不變，停止通氣，轉(zhuǎn)為厭氧發(fā)酵，厭氧發(fā)酵時(shí)間72 h；整個(gè)過(guò)程中葡萄糖為碳源，發(fā)酵液糖濃度控制在2%以下。每隔一定時(shí)間取樣，OD600測(cè)定生長(zhǎng)情況，測(cè)定殘?zhí)?，?jì)算耗糖速率；發(fā)酵液經(jīng)處理后，4 ℃放置2 h以上，HPLC法測(cè)定乳酸含量。

3)3 L發(fā)酵罐延長(zhǎng)厭氧發(fā)酵試驗(yàn)同以上條件，延長(zhǎng)厭氧發(fā)酵時(shí)間至140 h，并用HPLC法測(cè)定酒精含量。

2結(jié)果與討論

2.1　產(chǎn)乳酸釀酒酵母菌株構(gòu)建

2.1.1D-乳酸脫氫酶基因的獲得

通過(guò)游離表達(dá)將乳酸脫氫酶DLDH基因引入釀酒酵母S.cerevisiaeW303-1A，使其可以再生NADH，酵母體內(nèi)代謝碳流一部分轉(zhuǎn)向乳酸生成途徑，使胞內(nèi)丙酮酸直接還原為乳酸，導(dǎo)致乙醇和乳酸同時(shí)積累。分別以E.coli和L.mesenteroides的乳酸脫氫酶基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增獲得乳酸脫氫酶基因dldhe1510和dldhb1186。

擴(kuò)增的瓊脂糖電泳圖譜如圖1所示。由圖1可知：2種來(lái)源的基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后，在約1 000bp處均有單一的擴(kuò)增片段，與目的基因片段大小(996bp)基本一致，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，2條基因片段為乳酸脫氫酶基因dldhe1510和dldhb1186。

M—DL2000 marker；1—dldhb1186；2—dldhe1510 圖1　 DLDH基因電泳圖 Fig.1　 The product of PCR amplification

2.1.2乳酸脫氫酶基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

選擇陽(yáng)性克隆子提取質(zhì)粒，對(duì)pYX212-kanMX-dldhb1186 進(jìn)行BamHⅠ、SalⅠ雙酶切，對(duì)pYX212-kanMX-dldhe1510進(jìn)行EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切，結(jié)果如圖2所示。圖2結(jié)果顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1—BamHⅠ和 SalⅠ雙酶切質(zhì)粒 pYX 212-kanMX-dldhb1186結(jié)果； 2—DL2000 marker；3—標(biāo)準(zhǔn)DNA；4—EcoRⅠ和 BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒 pYX 212-kanMX-dldhe1510 的結(jié)果 圖2　 重組質(zhì)粒雙酶切電泳 Fig.2　 Restriction analysis of the recombinant plasmid

2.1.3電轉(zhuǎn)化及驗(yàn)證

通過(guò)電轉(zhuǎn)化構(gòu)建的質(zhì)粒pYX212-kanMX-dldhb1186與pYX212-kanMX-dldhe1510到S. cerevisiaeW303-1A，轉(zhuǎn)化后的酵母涂布在含200μg/mLG418 抗生素的YEPD平板上，挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，電泳驗(yàn)證，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，2株重組菌均得到大小1 000bp左右片段，而原始菌S. cerevisiaeW303-1A沒(méi)有，證明已成功轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒。

M—DL2000 marker；1—W303-1A;2—WB1186;3—WE1510 圖3　 菌落PCR驗(yàn)證 Fig.3　 The product of colony PCR amplification

2.2　產(chǎn)乳酸酵母發(fā)酵性能的研究

為對(duì)比不同D-乳酸脫氫酶來(lái)源的產(chǎn)乳酸酵母WE1510和WB1186的產(chǎn)乳酸能力，利用搖瓶發(fā)酵進(jìn)行初步探究。因?yàn)镈-乳酸是在厭氧的情況下積累，此時(shí)菌體已經(jīng)基本停止生長(zhǎng)，故在轉(zhuǎn)厭氧前積累較高的OD，有利于乳酸的積累，以下為在搖瓶發(fā)酵條件下確定轉(zhuǎn)化子的最優(yōu)生長(zhǎng)條件。

2.2.1轉(zhuǎn)化子在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

比較重組菌在多種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，2株重組菌在YEPD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況最好，培養(yǎng)約50h時(shí)，OD值分別達(dá)到13.3和13.7，所以選擇YEPD作為下一步研究所用培養(yǎng)基。

圖4　 轉(zhuǎn)化子在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況 Fig.4　 Growth of transformants in different culture medium

2.2.2轉(zhuǎn)化子在不同糖濃度下的生長(zhǎng)情況

在YEPD培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，比較重組菌在不同糖濃度下的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，重組菌在20g/L糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況優(yōu)于其他糖濃度的，WB1186的最高OD600高于WE1510的。

圖5　 轉(zhuǎn)化子在不同糖濃度下生長(zhǎng)情況 Fig.5　 Growth of transformants in different sugar concentration

2.2.3轉(zhuǎn)化子在不同pH下的生長(zhǎng)情況

在含糖質(zhì)量濃度20g/L的YEPD培養(yǎng)基中，比較重組菌在不同pH條件下的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，在pH為5的培養(yǎng)基中，OD值能達(dá)到最高值，WB1186的最高OD600高于WE1510的。

圖6　 不同pH下轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)情況 Fig.6　 Growth of transformants in different pH

2.2.4轉(zhuǎn)化子搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證

對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初步發(fā)酵性能測(cè)試，YEPD培養(yǎng)基，20g/L糖，pH5，30 ℃、150r/min培養(yǎng)24h，接種量為10%，之后保鮮膜封口轉(zhuǎn)至培養(yǎng)箱厭氧發(fā)酵。測(cè)定WB1186與WE1510產(chǎn)乳酸情況，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，WB1186具有更好的產(chǎn)乳酸能力，所以選擇WB1186作為下一步上罐發(fā)酵的研究菌株。

圖7　 轉(zhuǎn)化子搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證 Fig.7　 Fermentation test of transformants in the flask

2.2.5重組菌3L罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

上罐培養(yǎng)基YEPD，溶氧(DO)30%，接種量10%， 150r/min，初始糖質(zhì)量濃度10g/L，控制pH5，通氣量3L/min，OD最大值時(shí)轉(zhuǎn)為厭氧發(fā)酵，2個(gè)階段總發(fā)酵時(shí)間96h。定時(shí)取樣測(cè)定菌體OD值、乳酸濃度、耗糖速率，結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可知，最終乳酸積累量達(dá)到18.0g/L。

圖8　 重組菌3 L罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn) Fig.8　 Recombinant strains fermentation in a 3-L fermentation tank

2.2.6重組菌3L罐延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

上罐培養(yǎng)基YEPD，溶氧(DO)30%，接種量10%，150r/min，初始糖質(zhì)量濃度10g/L，控制pH5，通氣量3L/min，OD最大值時(shí)轉(zhuǎn)為厭氧發(fā)酵。延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間至140h，定時(shí)取樣測(cè)定菌體OD600值、乳酸濃度、耗糖速率，D-乳酸積累量，結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，乳酸最終積累量14.0g/L。由此可知，單純延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間并不會(huì)使乳酸有效積累。

圖9　 重組菌3 L罐延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵實(shí)驗(yàn) Fig.9　 Recombinant strains fermentation in a 3-L fermenter with longer time

3結(jié)論

成功地將L. mesenteroides和E. coli來(lái)源的D-乳酸脫氫酶基因在釀酒酵母中進(jìn)行表達(dá)，構(gòu)建了2株重組菌S. cerevisiaeWE1510和S. cerevisiaeWB1186。在搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)條件下，重組菌S. cerevisiaeWB1186在YEPD培養(yǎng)基、20g/L糖和pH5的條件下生長(zhǎng)條件最好，并具有更好的產(chǎn)乳酸能力。選取S. cerevisiaeWB1186進(jìn)行下一步3L發(fā)酵罐發(fā)酵驗(yàn)證。YEPD培養(yǎng)基、接種量10%、溶氧30%、150r/min、初始葡萄糖質(zhì)量濃度10g/L，控制pH5，通氣量3L/min，OD600最大值時(shí)轉(zhuǎn)為厭氧發(fā)酵，在此分批發(fā)酵條件下，乳酸最終積累量達(dá)到18.0g/L。

參考文獻(xiàn)：

[1]王宏偉,郭紹華,馮靚.L-乳酸發(fā)酵的研究進(jìn)展.遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué),2004(4):28-30.

[2]崔小明.乳酸的生產(chǎn)應(yīng)用及市場(chǎng)前景.四川化工與腐蝕控制,2002,5(2):37-44.

[3]胡永紅，管珺，楊文革，等.發(fā)酵法生產(chǎn)D-乳酸的研究進(jìn)展.食品與發(fā)酵工業(yè),2007,33(12):99-106.

[4]王正巖,郝章來(lái).聚乳酸的生產(chǎn)和應(yīng)用及市場(chǎng)前景.化工新型材料,2003,37(1):40-44.

[5]季平,徐銀寶,江志榮.聚乳酸的性能及開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀.合成技術(shù)及應(yīng)用,2003,18(1):31-37.

[6]HirayamaS,UedaR.ProductionofopticallypureD-lacticacidbyNannochlorumsp.26A4.ApplBiochemBiotechnol,2004,119(1):71-77.

[7]VijayakumarJ,AravindanR,ViruthagiriT.Recenttrendsintheproduction,purificationandapplicationoflacticacid.ChemBiochemEngQuart,2008,22(2):245-264.

[8]YanezR.,MoldesAB,AlonsoJL,etal.ProductionofD-lacticacidfromcellulosebysimultaneoussaccharificationandfermentationusingLactobacillus coryniformissubsp.torquens.BiotechnolLett,2003,25(14):1161-1164.

[9]FukushimaK,SogoK,MiuraS,etal.ProductionofD-lacticacidbybacterialfermentationofricestarch.MacromolBiosci,2004,4(11):1021-1027.

[10]CgangDE,JungHC,RheeJS,etal.Homofermentativeproductionofd-orl-lactateinmetabolicallyengineeredEscherichia coliRR1.ApplEnvironMicrobiol,1999,65(4):1384-1389.

[11]ZhouS,CauseyT,HasonaA,etal.ProductionofopticallypureD-lacticacidinmineralsaltsmediumbymetabolicallyengineeredEscherichia coliW3110.ApplEnvironMicrobiol,2003,69(1):399-407.

[12]IshidaN,SaitohS,TokuhiroK,etal.EfficientproductionofL-lacticacidbymetabolicallyengineeredSaccharomyces cerevisiaewithagenome-integratedL-lactatedehydrogenasegene.ApplEnvironMicrobiol,2005,71(4):1964-1970.

[13]HofvendahlK,Hahn-H?gerdalB.Factorsaffectingthefermentativelacticacidproductionfromrenewableresources.EnzymeMicrobTechnol,2000,26(2/3/4):87-107.

[14]AdachiE,TorigoeM,SugiyamaM,etal.ModificationofmetabolicpathwaysofSaccharomyces cerevisiaebytheexpressionoflactatedehydrogenaseanddeletionofpyruvatedecarboxylasegenesforthelacticacidfermentationatlowpHvalue.JFermentBioeng,1998,86(3):284-289.

[15]周麗.高產(chǎn)高純D-乳酸的E. coli代謝工程菌的構(gòu)建.無(wú)錫:江南大學(xué),2012:13-15.

[16]IshidaN,SuzukiT,TokuhiroK,etal.d-LacticacidproductionbymetabolicallyengineeredSaccharomyces cerevisiae.JBiosciBioeng,2006,101(2):172-177.

[17]HauseB,RajgarhiaV,SuominenP.MethodsandmaterialsfortheproductionofL-lacticacidinyeast:US,7534597.2009-05-19.

[18]邢建宇,楊莉.培養(yǎng)基中各營(yíng)養(yǎng)組分對(duì)釀酒酵母發(fā)酵的影響.食品研究與開(kāi)發(fā),2011,32(2):139-142.

[19]王穎,何寧,李清彪,等.釀酒酵母 S.cerevisiae 高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化研究.工業(yè)微生物,2007,37(1):34-38.

[20]薩姆布魯克J,拉塞爾DW.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.黃培堂,譯.3版.北京:科學(xué)出版社,2002.

(責(zé)任編輯荀志金)