大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立

邢玉桂，馬飛，孫洪勝

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011)

摘要：目的建立一種操作容易、效果顯著的大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型。方法8周齡Wistar大鼠分為高脂飼料組和基礎(chǔ)飼料組，高脂飼料組大鼠給予按比例配制的高脂飼料，并輔以灌胃維生素D3，基礎(chǔ)飼料組給予基礎(chǔ)飼料，并灌胃生理鹽水，喂養(yǎng)8周后觀察大鼠血脂、血糖等生化指標(biāo)、病理變化，并采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)頸動(dòng)脈中MMP-9的表達(dá)。結(jié)果經(jīng)過(guò)8周高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料組大鼠體重、血糖、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白等生化指標(biāo)明顯高于基礎(chǔ)飼料組，尤其是甘油三酯和總膽固醇水平；高脂飼料組大鼠出現(xiàn)大量鈣化斑塊，高脂飼料組大鼠頸動(dòng)脈MMP-9表達(dá)增多，基礎(chǔ)飼料組無(wú)明顯變化。結(jié)論按照7%豬油、5%膽固醇、3%白砂糖、0.5%膽酸鈉、0.2%丙硫氧嘧啶、84.3%基礎(chǔ)飼料的比例配置高脂高糖飼料喂養(yǎng)大鼠，并輔以700 000 U·kg-1的維生素D3進(jìn)行灌胃，喂養(yǎng)8周可以成功建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型。

關(guān)鍵詞：大鼠；動(dòng)脈粥樣硬化；生化檢測(cè)；鈣化斑塊；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金(No.ZR2010HL066)

作者簡(jiǎn)介：邢玉桂，女，副主任護(hù)師，研究方向：中藥藥理研究，E-mail：924164876@qq.com

通訊作者：孫洪勝，男，主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥新劑型新工藝研究，Tel：0531-82929059，E-mail：shs7777@163.com

中圖分類號(hào)：R965文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Establishment of a rat model of atherosclerosis

XINGYu-gui,MAFei,SUNHong-sheng

(TheAffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250011,China)

Abstract：ObjectiveTo establish the model of atherosclerosis with easy operation,obvious effect in rats.MethodsThe 8 weeks old Wistar rats were divided into the high fat diet group and the basic diet group.The high diet rats were feed with high fat food which was prepared accooding to a certain proportion and Vitamin D3 by gavage.The basic diet rats were given ordinary rat food and physiological saline by gavage.After they were feed 8 weeks,biochemical parameters such as blood glucose and blood lipid and pathological changes were observed,the expression of MMP-9 was observede by immunohistochemical method.ResultsAfter the rats were feed with high diet food 8 weeks,the weight,the blood glucose,triglyceride,total cholesterol,low density lipoprotein and other biochemical parameters of the high diet rats,especially triglyceride and the total cholesterol, were higher than the basic diet rats′.There was a lot of calcified plaque was found in the high fat diet rats′ carotid artery,the expression of MMP-9 in the high fat diet rats increase,but there was no significant change in the basic diet rats.ConclusionThe rats were feed with high fat food which include 7% lard oil,5% cholesterol,3%white sugar,0.5% sodium cholate,0.2% propyl sulphur pyrimidine,84.3% ordinary rat food,and 700 000 U·kg-1 Vitamin D3 by gavage.After 8 weeks,ideal rat model for the study of atherosclerosis can be established successfully.

Key words:Rat;Atherosclerosis;Biochemical assays;Calcified plaque;MMP-9

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)是受累動(dòng)脈從內(nèi)膜開(kāi)始病變的一種常見(jiàn)血管病，它是引起心腦血管疾病的主要原因，嚴(yán)重危害人類身體健康。動(dòng)脈粥樣性血管疾病(ASVD)已成為全球首位死亡原因[1]。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病變過(guò)程中伴隨著脂質(zhì)浸潤(rùn)、鈣質(zhì)沉著、炎癥反應(yīng)等[2]，各種學(xué)說(shuō)都在一定程度上解釋了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，但它們未能全面地解釋動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制。在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的研究中，合適的動(dòng)物模型發(fā)揮了重要作用。因此，為了加深對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的研究，建立一種飼養(yǎng)方便、成活率高、操作容易的大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以一定比例的高脂飼料，輔以灌胃維生素D3喂養(yǎng)大鼠，成功建立一種大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，為以后動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究創(chuàng)造了條件。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性Wistar大鼠，SPF級(jí)，6～8周齡，重量(180±20) g，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供(許可證號(hào)：SCXK魯20130001),分籠飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2試劑膽固醇(安徽天啟華工科技有限公司，批號(hào)：20130612)；膽酸鈉(河北銀峰食品科技有限公司，批號(hào)：201306167)；白砂糖(福臨門(mén)白砂糖，青島中糧航引食品有限公司)；豬油(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院餐廳熬制，豬肉購(gòu)自大潤(rùn)發(fā)超市)；丙硫氧嘧啶片(50 mg，蘇州東瑞制藥有限公司，批號(hào)：130511001)；維生素D3注射液(1 mL：30萬(wàn)單位，上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：121121)；豆油[金龍魚(yú)大豆油，嘉里糧油(青島)有限公司]；基礎(chǔ)飼料(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)；0.9%氯化鈉注射液(山東華魯制藥有限公司，批號(hào)：013042602)；戊巴比妥鈉(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，批號(hào)：090205)；葡萄糖測(cè)定試劑盒(己糖激酶法，貝克曼庫(kù)爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，批號(hào)：AUZ1139)；總膽固醇測(cè)定試劑盒(酶法，貝克曼庫(kù)爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，批號(hào)：AUZ0774)；甘油三酯測(cè)定試劑盒(GPO-POD法，貝克曼庫(kù)爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，批號(hào)：AUZ0959)；高密度脂蛋白測(cè)定試劑盒(直接法，日本積水醫(yī)療株式會(huì)社，批號(hào)：808RHK)；低密度脂蛋白測(cè)定試劑盒(直接法，日本積水醫(yī)療株式會(huì)社，批號(hào)：806RFK)；MMP-9 (AB38898，ABCAM)；第二抗體試劑 SP-9001試劑盒(中杉金橋)；DAB顯色試劑(中杉金橋)；PBS磷酸鹽緩沖液(0.01 mol·L-1、pH 7.2～7.4，中杉金橋)。

1.2儀器白洋600A離心機(jī)；奧林巴斯AU2700全自動(dòng)生化儀；德國(guó)萊卡RM2015石蠟切片機(jī)；德國(guó)Eppendorf-5430離心機(jī)；DSHZ-300型恒溫水浴箱(江蘇太倉(cāng)醫(yī)用儀器廠)；DEIAS-2000丹吉爾醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(濟(jì)南丹吉爾電子有限公司)；Image-Pro Plus多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)(美國(guó)Media Cybernetics 公司)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物分組及飼養(yǎng)將64只大鼠分為基礎(chǔ)飼料組和高脂飼料組，基礎(chǔ)飼料組12只，高脂飼料組52只?；A(chǔ)飼料組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)8周，高脂飼料組給予高脂飼料(按照7%豬油、5%膽固醇、3%白砂糖、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、84.3%基礎(chǔ)飼料的比例配置)喂養(yǎng)8周，同時(shí)于首次喂養(yǎng)的第3、5、7天按照700 000 U·kg-1的劑量給予維生素D3注射液[3]，灌胃3 d。

2.2生化指標(biāo)檢測(cè)大鼠喂養(yǎng)8周后，基礎(chǔ)飼料組、高脂飼料組各取大鼠2只，只供水12 h，稱重記錄，用2%戊巴比妥鈉按0.2 mL·(100 g)-1體重腹腔注射、麻醉，下腔靜脈取血，搖勻，對(duì)稱放入離心機(jī)，3 200 rpm，離心5 min，取上層血清，放入奧林巴斯AU2700全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)。

2.3組織病理切片、頸動(dòng)脈MMP-9表達(dá)檢測(cè)將已取血大鼠仰臥位固定，剝離大鼠頸部肌肉，分離頸動(dòng)脈及伴行的迷走神經(jīng)，剪取頸動(dòng)脈放入盛有0.9%氯化鈉注射液的培養(yǎng)皿中反復(fù)沖洗，直至血管沖洗干凈。將摘取的一條頸動(dòng)脈置于10%中性甲醛溶液中固定，酒精梯度脫水，浸臘包埋，二甲苯透明，常規(guī)切片，HE染色，用光學(xué)顯微鏡觀察，取圖；另一條頸動(dòng)脈做免疫組織化學(xué)分析，400×顯微照相。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

大鼠下腔靜脈血做生化指標(biāo)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1中發(fā)現(xiàn)高脂飼料組大鼠血糖水平高于基礎(chǔ)飼料組，這與高糖高脂飲食有關(guān)，血液中甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白水平高脂飼料組大鼠明顯高于基礎(chǔ)飼料組。

表1　喂養(yǎng)10周后大鼠各項(xiàng)生化指標(biāo)

大鼠頸動(dòng)脈做病理切片見(jiàn)圖1。圖1A基礎(chǔ)飼料組動(dòng)脈內(nèi)膜平滑無(wú)損傷，細(xì)胞排列整齊，厚薄均勻，偶見(jiàn)脂肪組織，出現(xiàn)少量空泡；圖1B高脂飼料組大鼠動(dòng)脈血管增生明顯，細(xì)胞排列紊亂，脂質(zhì)成分增多，淡藍(lán)色區(qū)域較大，鈣鹽沉積較多，出現(xiàn)明顯的灶化斑塊，并且彈力纖維遭到破壞而變薄，灶化嚴(yán)重部分內(nèi)膜斷裂。

A

B 圖1　大鼠頸動(dòng)脈病理切片 A.基礎(chǔ)飼料組；B.高脂飼料組

采用免疫組化技術(shù)對(duì)大鼠頸動(dòng)脈MMP-9表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)(見(jiàn)圖2)，圖中棕色區(qū)域?yàn)榇笫箢i動(dòng)脈MMP-9表達(dá)區(qū)域。從圖2可以發(fā)現(xiàn)高脂飼料組大鼠頸動(dòng)脈中MMP-9表達(dá)明顯增多，基礎(chǔ)飼料組大鼠頸動(dòng)脈血管內(nèi)膜平整，細(xì)胞排列整齊，偶見(jiàn)脂肪組織，存在少量空泡；高脂飼料組大鼠頸動(dòng)脈血管內(nèi)膜粗糙，細(xì)胞排列緊密、紊亂，有大量空泡。

通過(guò)兩組大鼠血糖、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等生化指標(biāo)對(duì)比，以及大鼠頸動(dòng)脈血管病理切片、免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與基礎(chǔ)飼料組相比，高脂飼料組大鼠血糖、甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白水平明顯增高，頸動(dòng)脈病理切片血管內(nèi)膜粗糙，細(xì)胞排列紊亂，硬化斑塊明顯，免疫組化法檢測(cè)MMP-9表達(dá)明顯增多，成功建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型。

4討論

動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中伴隨著脂質(zhì)浸潤(rùn)、鈣質(zhì)沉著、炎癥反應(yīng)等，建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，首先應(yīng)該提供大量脂質(zhì)，高比例的豬油、膽固醇提供了脂質(zhì)來(lái)源；膽酸鈉可以提高膽固醇的吸收量，有利于快速形成高脂血癥[4]；大鼠無(wú)膽囊，單純高脂飼料易使血清膽固醇升高，采用丙硫氧嘧啶可以抑制甲狀腺功能[5]，降低了膽固醇的氧化和分解，從而升高膽固醇含量；灌胃給予維生素D3，可以促進(jìn)血管鈣化，同時(shí)造成內(nèi)膜損傷，進(jìn)一步促進(jìn)粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。

C

D 圖2　大鼠頸動(dòng)脈MMP-9表達(dá) C.基礎(chǔ)飼料組；D.高脂飼料組

血液中的血脂主要指甘油三酯和膽固醇，兩者有一項(xiàng)升高或都升高，則可定義為高脂血癥。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間喂養(yǎng)后，高脂飼料組大鼠甘油三酯、總膽固醇含量升高，出現(xiàn)高脂血癥。低密度脂蛋白可以與膽固醇結(jié)合而成低密度脂蛋白膽固醇，它是導(dǎo)致動(dòng)脈硬化的重要因素，高脂飼料組大鼠血液中低密度脂蛋白含量明顯增高說(shuō)明其出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化的可能性提高。高密度脂蛋白和膽固醇結(jié)合形成高密度脂蛋白膽固醇，它可以將膽固醇從組織轉(zhuǎn)移到肝臟中去，具有防治動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

動(dòng)脈粥樣硬化的病理特點(diǎn)是動(dòng)脈內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分沉積，內(nèi)膜增厚及中膜平滑肌細(xì)胞遷移增生、增厚[6]。血管重構(gòu)包括細(xì)胞成分及細(xì)胞外基質(zhì)的重構(gòu)[7]，病變動(dòng)脈通過(guò)內(nèi)層細(xì)胞、ECM和脂質(zhì)積聚導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變時(shí)粥樣硬化發(fā)生發(fā)

展[8]。而基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)是體內(nèi)降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白酶，它與細(xì)胞外基質(zhì)的降解、重塑，以及平滑肌細(xì)胞的遷移、增殖有關(guān)。血管細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解是維持血管結(jié)構(gòu)完整性的重要機(jī)制[6]。頸動(dòng)脈血管中MMP-9表達(dá)增多，細(xì)胞外基質(zhì)以降解為主，有利于平滑肌細(xì)胞的遷移、增殖，形成新的內(nèi)膜[9]，易于導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。

綜上所述，大鼠經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)一段時(shí)間后，甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白等生化指標(biāo)升高，頸動(dòng)脈中MMP-9表達(dá)增多，都提示大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型建立成功。

參考文獻(xiàn)：

[1]殷亞昕，劉潤(rùn)梅，翟紅霞，等.不同飼料聯(lián)合維生素D3建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的比較[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2010,16(12):1134-1136.

[2]宋磊,錢(qián)之玉,陳真,等.動(dòng)脈粥樣硬化與炎癥的關(guān)系及相關(guān)藥物治療[J].藥學(xué)進(jìn)展,2013,37(2):49-55.

[3]趙娟,李湘軍,孫波,等.維生素D3聯(lián)合高脂飼料建立大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2009,25(21):3569-3571.

[4]傅劍云,夏勇,孟佳,等.多因素致大鼠實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化模型建立[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2009,19(11):2487-2489.

[5]吳楠,陳平圣,李靜,等.丙基硫氧嘧啶不同攝入方式對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響[J].現(xiàn)代醫(yī)學(xué),2011,39(2):142-146.

[6]于瀅，楊向紅.基質(zhì)金屬蛋白酶與動(dòng)脈粥樣硬化及斑塊破裂的關(guān)系[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2003,11(6):592-595.

[7]王獻(xiàn)民，周同甫，劉斌，等.卡托普利及氯沙坦干預(yù)大鼠肺動(dòng)脈高壓與MMP-2、MMP-9、TIMP-1表達(dá)的關(guān)系[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009，40(2):255-259.

[8]魯立,江渝.基質(zhì)金屬蛋白酶-9與動(dòng)脈粥樣硬化[J].生命的化學(xué),2007,27(1):75-77.

[9]葛夕洪，楊晶，徐銳，等.MMP-2、MMP-9、TIMP-1在血管成形術(shù)后再狹窄中的表達(dá)及其意義的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)介入影響與治療學(xué),2008,5(3):165-169.