基于多波長覆蓋融合指紋圖譜的大川芎片主要成分研究

唐爽1，包永睿1,2,3，孟憲生1,2,3，富力4，王帥1,2,3

(1.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600；

3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 116600；4.大連富生天然藥物開發(fā)有限公司，遼寧 大連 116600)

摘要：目的建立10批次大川芎片多波長融合高效液相色譜指紋圖譜，在此基礎(chǔ)上對大川芎片融合指紋圖譜共有峰進行初步指認，構(gòu)建大川芎片的全析指紋圖譜為其全面的質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法采用高效液相色譜法對大川芎片進行檢測，將不同波長下數(shù)據(jù)進行多波長融合得到10批大川芎片的融合指紋圖譜，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對融合指紋圖譜中的共有峰進行初步結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果10批大川芎片融合指紋圖譜共獲得13個共有峰并與共有模式圖相似度均>0.92，其中8個共有峰得到指認。結(jié)論本文通過多波長融合技術(shù)手段及HPLC-MS分析方法建立大川芎片全析指紋圖譜，為大川芎片主要成分的質(zhì)量控制提供依據(jù)，為規(guī)范中藥制劑及其合理使用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大川芎片；多波長融合；指紋圖譜；液質(zhì)聯(lián)用

基金項目：“十二五”“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(No.2013ZX09507005)

作者簡介：唐爽，女，研究方向：藥物分析，E-mail：707547627@qq.com

通訊作者：孟憲生，男，博士研究生，博士生導師，研究方向：中藥組分配伍、代謝組學及藥品質(zhì)量分析，Tel：0411-85890185，E-mail：mxsvvv@126.com

中圖分類號：R284.2文獻標識碼：A

Study on the main components of the Dachuanxiong Tablets based

on multiple wavelength coverage fusion fingerprint

TANGShuang1,BAOYong-rui1,2,3,MENGXian-sheng1,2,3,FULi4,WANGShuai1,2,3

(1.CollegeofPharmacy，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China；

2.LiaoningProvinceMulti-ComponentChineseMedicineEngineeringTechnologyResearchCenter，

Dalian116600，China；3.LiaoningProvinceModernTraditionalChineseMedicineResearchand

EngineeringLaboratory，Dalian116600，China;4.DalianFushengNaturalDrug

DevelopmentCo.,Ltd.，Dalian116600，China)

Abstract：ObjectiveTo set up the multi-wavelength fusion HPLC fingerprint of 10 batches of the Dachuanxiong Tablets,common peaks were preliminary identified on that basis,building the total analyzed fingerprint in order to provide a base for the comprehensive quality controlling of the drug.MethodsThe fingerprint under different wavelength for ten batches of Dachuanxiong Tablets were tested by HPLC-DAD and the active components was identified by HPLC-MS.ResultsA HPLC fingerprinting pattern of 10 batches of the Dachuanxiong Tablets was set up based on multi-wavelength fusion,which demarcated 13 common peaks,8 of which were confirmed,the similarity was more than 0.92 between the correlation coefficients of the 10 samples.ConclusionIn this article,with the method of multi-wavelength fusion and HPLC-MS,we established the total analyzed fingerprint of Dachuanxiong Tablets and provided the foundation for the quality controlling of the tablets,which laying a foundation to regulate traditional Chinese medicine preparations and its reasonable application.

Key words:Dachuanxiong Tablets；Multiple wavelength fusion；Fingerprint；HPLC-MS

大川芎片由天麻、川芎兩味藥材組成，經(jīng)提取、精制等一系列工藝處理后制成，具有活血化淤、平肝熄風之功效，專門用于治療各種頭痛和眩暈，療效確切、毒副作用少，已廣泛應(yīng)用于臨床。該制劑組方藥材成分復雜，單一成分、單一波長測定不能全面、綜合的評價其質(zhì)量，因此建立綜合、全面、有效的質(zhì)量評價標準具有重大的意義。中藥指紋圖譜是中藥質(zhì)量控制的有效技術(shù)手段，大川芎片中的有效成分在單一波長下難以全面反映，故本研究采用多波長融合技術(shù)建立大川芎片多波長融合指紋圖譜，并通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對其化學成分進行分析，建立全析指紋圖譜的質(zhì)量控制體系，為大川芎片及中藥制劑質(zhì)量控制提供新的科學依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器Agilent 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司，包括高壓二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器、Agilent 1100 色譜工作站)；HPLC-TOF-MS(美國安捷倫科技公司)。

1.2試藥天麻素對照品(購于中國藥品生物制品檢定所，批號：110807-201306)；大川芎片(大連富生制藥有限公司，批號：20120601、20121101、20130301、20130401、20130501、20130901、20131101、20140201、20140301、20140601)。乙腈(色譜試劑，F(xiàn)isher公司，批號：110906)；甲酸(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20110409)；水為超純水。

2方法與結(jié)果

2.1大川芎片多波長融合指紋圖譜

2.1.1色譜條件Aglient TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：0.04%甲酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫：0~10 min，2%-2%(B)，10~90 min，2%-24%(B)；流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30 ℃，檢測波長：210、225、254、270、320 nm，進樣量：10 μL[1]。

2.1.2對照品溶液的制備取天麻素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

2.1.3供試品溶液的制備取大川芎片適量，去除包衣，研碎，過40目篩，精密稱取樣品粉末2.0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加甲醇80 mL回流提取2 h，濾過，濃縮，加甲醇定容至10 mL容量瓶中，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.1.4檢測波長的選擇及多波長指紋圖譜融合[2]光譜波長范圍的選取DAD設(shè)定為200～400 nm全波長掃描。取供試品溶液，按設(shè)定的色譜條件進樣測定。用所得的三維色譜-光譜數(shù)據(jù)，可知，大川芎片的色譜信號以紫外光區(qū)為主，大川芎片中的主要成分分別在210、225、254、270、320 nm下有較大吸收，故確定融合波長為210、225、254、270、320 nm。

分別從 Aglient 1100色譜工作站中導出210、225、254、270、320 nm的dif格式數(shù)據(jù)文件，使用Matlab軟件編程，對dif格式數(shù)據(jù)進行全時段多波長融合，得到同時反映5個波長信息的色譜圖和圖譜數(shù)據(jù)，相關(guān)色譜圖見圖1。

2.1.5精密度試驗取同一批供試品溶液(批號：20140301)，連續(xù)進樣6次，記錄指紋圖譜并進行多波長融合，以天麻素峰為參照峰，其他各共有峰相對保留時間RSD<0.5%，相對峰面積RSD<3%，表明儀器的精密度良好，符合指紋圖譜要求。

2.1.6穩(wěn)定性試驗取同一批供試品溶液(批號：20140301)，分別在0、2、4、8、12、18、24 h進行檢測，記錄指紋圖譜并進行多波長融合，以天麻素峰為參照峰，其他各共有峰相對保留時間RSD<0.5%，相對峰面積RSD<3%，表明該樣品穩(wěn)定性良好，符合指紋圖譜要求。

2.1.7重復性試驗分別取同一批號(批號：20140301)樣品6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液并進行檢測，記錄指紋圖譜并進行多波長融合，以天麻素峰為參照峰，其他各共有峰相對保留時間RSD<0.5%，相對峰面積RSD<3%，表明該制備和檢測方法重復性良好，符合指紋圖譜要求。

2.2指紋圖譜的建立、參照峰及特征峰的選擇取10批大川芎片制劑，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別取10 μL，按“2.1.1”項下方法進樣，記錄指紋圖譜并進行多波長融合，將10批大川芎片的指紋圖譜數(shù)據(jù)導入中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A)，選擇色譜峰進行多點校正、色譜峰自動匹配后，以中位數(shù)法生成HPLC指紋圖譜共有模式(圖2)。結(jié)果表明10批樣品的指紋圖譜與共有模式的相似度分別為0.958、0.959、0.961、0.952、0.968、0.960、0.948、0.933、0.968、0.962，且相似度均>0.920。對色譜峰進行分析，選擇穩(wěn)定性、重復性好、特征明顯的色譜峰為共有，共標定13個共有峰(圖3)，共有峰面積占本文所示指紋圖譜總峰面積的90%以上，符合指紋圖譜共有峰的要求。其中峰S經(jīng)對照品比對為天麻素色譜峰，該峰峰面積較大，重復性、穩(wěn)定性較好，因此選擇該峰為指紋圖譜的參照峰。

2.3采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)推斷大川芎片中主要化學成分

2.3.1樣品制備方法對照品制備方法見“2.1.2”項下。供試品制備方法見“2.1.3”項下。

2.3.2分析方法

2.3.2.1液相條件的選擇見“2.1.1”項下色譜條件。

圖1　大川芎片及天麻素對照品融合前后指紋圖譜 大川芎片：A.210 nm;B.225 nm;C.254 nm;D.270 nm;E.320 nm；F.大川芎片多波長融合指紋圖譜；G.多波長融合天麻素對照品圖譜

圖2　10批大川芎片的多波長融合指紋圖譜共有模式圖

圖3　大川芎片融合指紋圖譜

2.3.2.2質(zhì)譜條件的選擇電噴霧離子源(Dual ESI)，正、負離子模式檢測，干燥氣體流速為10 L·min-1，干燥氣體溫度為350 ℃，毛細管電壓(Vcap)為3 500 V，霧化器壓力為50 psig，碎裂電壓為110 V，Skimmer 為65 V，OCT IRF Vpp為250 V，m/z范圍為50~2 000。

2.3.3結(jié)果取大川芎片供試品溶液按“2.3.2”項下分析方法進行液質(zhì)聯(lián)用分析，應(yīng)用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)，并參考相關(guān)文獻和對照品比對，對大川芎片融合指紋圖譜中共有峰初步定性。通過質(zhì)譜指認和對照品比對，共初步鑒定了8個共有峰，結(jié)果見表1[3~8]。

表1　大川芎片主要化學成分HPLC-MS數(shù)據(jù)及化合物推測

3討論

大川芎片質(zhì)量標準中的指標性成分為天麻素，而其來源于大川芎片中天麻藥材，天麻為名貴中藥材，為避免市場魚目混珠，故建立多波長融合指紋圖譜并對其主成分初步定性分析，建立全面的質(zhì)量控制體系來控制樣品質(zhì)量，解決實際生產(chǎn)

問題，從而降低檢測限、克服單一波長下信息量不足的缺點。

本實驗考察水、70%甲醇、甲醇不同溶劑對樣品的提取，結(jié)果表明不同提取溶媒對樣品成分存在較大差異，大川芎片中天麻、川芎兩味藥材水溶性極性大的成分較多，其中水、70%甲醇提取樣品色譜峰雜，分離度不好，故采用純甲醇進行提取。大川芎片制劑中強極性成分較多并且在低波長225 nm下吸收較為明顯，故選擇乙腈-水系統(tǒng)初始梯度為98%水相分離效果較好，基線較為平穩(wěn)。

本文通過多波長融合技術(shù)手段及HPLC-MS分析方法建立了大川芎片全析指紋圖譜，與傳統(tǒng)的僅以一種化學成分為參照峰作相對定量的指紋圖譜相比，該法更能真實客觀的反映大川芎片的內(nèi)在質(zhì)量，它使得指紋圖譜中獲得的峰得到辨認，是一種潛移默化的從相對定量到絕對定量的提升，為以后大川芎片及中成藥的質(zhì)量控制和物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供新的參考依據(jù)。

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