論著

MicroRNA-34c在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義

武震東任洪波孫志強(qiáng)劉斌張素蘭焦保華

項(xiàng)目來(lái)源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(編號(hào)：ZD20140280)

作者單位： 050000石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科[武震東(現(xiàn)工作單位為河北省邯鄲市中心醫(yī)院神經(jīng)外科)、焦保華]；河北省邯鄲市中心醫(yī)院神經(jīng)外科(任洪波、孫志強(qiáng)、劉斌、張素蘭)

E-mail：jiaobh2000@163.com

【摘要】目的探討miRNA-34c在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況及臨床意義。方法應(yīng)用定量PCR方法對(duì)18例WHO分級(jí)Ⅱ～Ⅳ級(jí)的甲醛固定石蠟包埋的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本和外傷或腦出血患者內(nèi)減壓手術(shù)獲得的5例腦組織標(biāo)本分別進(jìn)行miR-34c-3p和miR-34c-5p含量的檢測(cè)，比較不同級(jí)別膠質(zhì)瘤和正常腦組織中miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達(dá)差異，分析miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達(dá)和膠質(zhì)瘤惡性程度的相關(guān)性。結(jié)果與正常腦組織相比，膠質(zhì)瘤中miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達(dá)皆顯著減少(P<0.05)，而且miR-34c-3p和miR-34c-5p的表達(dá)隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別或惡性程度的增加分別減少，呈顯著的負(fù)相關(guān)(miR-34c-3p的spearman相關(guān)系數(shù)=-0.856，P<0.01；miR-34c-5p的spearman相關(guān)系數(shù)=-0.767，P<0.01)。結(jié)論MiR-34c在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低，而且表達(dá)隨著腫瘤分級(jí)或惡性程度的增高而減少，與膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高呈顯著的負(fù)相關(guān)。MiR-34c在膠質(zhì)瘤的進(jìn)展中有重要的意義，可作為腦膠質(zhì)瘤臨床分級(jí)的重要指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】膠質(zhì)瘤；microRNA；miR-34c-3p；miR-34c-5p

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.20.003

通訊作者：焦保華，050000河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科；

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 739.4

收稿日期：(2005-03-11)

The expression and clinical significance of miRNA-34c in human brain glioma tissuesWUZhendong*,RENHongbo,SUNZhiqiang,etal.*DepartmentofNeurosurgery,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of miRNA-34c in human brain glioma tissues.MethodsThe expression levels of miR-34c-3p and miR-34c -5p in 18 brain glioma specimens at WHO grade Ⅱ～Ⅳ class and 5 specimens got from patients with trauma or cerebral hemorrhage were detected by quantitative PCR. Moreover the differences of expression levels of miR-34c-3p and miR-34c -5p between different grade gliomas and normal brain tissue were compared,and the correlation between the expressions of miR-34c-3p, miR-34c-5p and malignant degree of gliomas was analyzed.ResultsAs compared with those in normal brain tissue,the expression levels of miR-34c-3p and miR-34c-5p in gliomas were significantly decreased (P<0.05),moreover, there was a significant negative correlation between expressions of miR-34c-3p,miR-34c-5p and malignant degree or grade of gliomas (r=-0.856,r=-0.767,respectively,P<0.01).ConclusionThe expression levels of miRNA-34c are significantly decreased in human brain glioma cells,moreover, there is a significant negative correlation between expressions of miR-34c-3p , miR-34c-5p and malignant degree or grade of tumor. MiRNA-34c plays an important role in the development of glioma,thus it can be regarded as an important index for clinical classification of brain glioma.

【Key words】glioma；microRNA；miR-34c-3p；miR-34c-5p

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是最難治療的腫瘤之一。常規(guī)的臨床治療方法如化療、手術(shù)切除和放療效果欠佳[1]，而膠質(zhì)瘤組織的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)卻常常使患者在出現(xiàn)癥狀后很快面臨腫瘤轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致死亡的威脅，目前從基因水平尋找惡性膠質(zhì)瘤防治的新途徑成為研究的熱點(diǎn)。MicroRNAs(miRNAs)是一種約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度非編碼單鏈小RNA，其本身不具有翻譯蛋白質(zhì)的功能, 而是通過(guò)與mRNA 的3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)的堿基序列互補(bǔ)配對(duì)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)。MiRNA與mRNA能進(jìn)行完全或近乎完全的互補(bǔ)配對(duì)，誘導(dǎo)對(duì)mRNA 的切割降解，而部分堿基配對(duì)則導(dǎo)致功能蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄抑制[2]。MiRNAs能參與一系列重要的生物學(xué)行為, 例如細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖與凋亡、應(yīng)激反應(yīng)等[3]。同時(shí)顯示出miRNAs與癌癥的形成關(guān)系密切，原因是它參與了細(xì)胞的增殖、凋亡，這兩個(gè)與人類(lèi)惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)的兩個(gè)進(jìn)程。亦有報(bào)道與正常組織比較，惡性腫瘤組織的miRNAs異常表達(dá)[4]。本實(shí)驗(yàn)主要研究microRNA-34c在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況。

1資料與方法

1.1一般資料膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本和正常腦組織標(biāo)本均來(lái)自于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科。共收集2011年1至6月期間甲醛固定石蠟包埋的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本18例，正常腦組織標(biāo)本5例。所有標(biāo)本病理結(jié)果均經(jīng)病理科證實(shí)，根據(jù)WHO的病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，分為Ⅱ～Ⅳ級(jí)，其中Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤共6例，包括星形細(xì)胞瘤2例、室管膜瘤2例、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤2例。Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤6例，其中間變性星形細(xì)胞瘤4例、間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤2例。Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤6例，均為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。腦出血、腦外傷患者行內(nèi)減壓手術(shù)而得到的正常腦組織5例作為對(duì)照組。

1.2實(shí)驗(yàn)方法利用Trizol(Invitrogen， USA)提取膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織總RNA。取1 μg總RNA做stem-loop引物的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。miR-34c-3p和 miR-34c-5p的共同逆轉(zhuǎn)錄引物為：miRNA R：5’CTCAACTGGTGTCGTGGA；PCR引物為：hsa-miR-34c-3p F：5’ACACTCCAGCTGGGAATCACTAACCACACGG；hsa-miR-34c-5p F：5’ACACTCCAGCTGGGAGGCAGTGTAGTTAGCTGAT；內(nèi)參U6的引物為：U6-F：5’CTCGCTTCGGCAGCACA；U6-R：5’AACGCTTCACGAATTTGCGT。所有引物均為上海生工合成。使用的定量PCR儀為ABI PRISMR 7500 Sequence Detection System。PCR擴(kuò)增程序如下：95℃變形5 min，隨后95℃作用15 s，65℃作用15 s，72℃作用32 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，在溫度60℃～95℃進(jìn)行融解曲線分析，每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析以U6做為內(nèi)參，以2-ΔΔCT表示各種miRNA的相對(duì)表達(dá)量，應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，定量PCR采用ANOVA單因素方差分析，miR-34c-3p、miR-34c-5p與病理分級(jí)的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MiR-34c在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在18份人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，miR-34c-3p和miR-34c-5p穩(wěn)定表達(dá)。在經(jīng)過(guò)和U6內(nèi)參相比較，以正常腦組織全RNA作為對(duì)照，正常腦組織中miR-34c-3p和miR-34c-5p的水平分別是WHO Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤標(biāo)本的1.84倍和7.3倍；分別是WHO Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤標(biāo)本的7.8倍和26.1倍；分別是WHO Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤標(biāo)本的49.6倍和208.8倍；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)人腦膠質(zhì)瘤中miRNA-34c的表達(dá)；與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.2MiR-34c在膠質(zhì)瘤中表達(dá)與病理分級(jí)相關(guān)性分析我們用Spearman等級(jí)相關(guān)分析分析了miR-34c-3p和miR-34c-5p在膠質(zhì)瘤中表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)和膠質(zhì)瘤標(biāo)本W(wǎng)HO病理分級(jí)存在負(fù)相關(guān)性(r=-0.856和-0.767，P<0.01)。見(jiàn)圖2。

圖2miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其與腫瘤惡性程度的相關(guān)性

3討論

miRNAs是一種約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度非編碼單鏈小RNA，其本身不具有翻譯蛋白質(zhì)的功能,而是通過(guò)與mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)的堿基序列互補(bǔ)配對(duì)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)。最近有文章報(bào)道m(xù)iRNAs與腫瘤的關(guān)系，特別是與腫瘤惡性度及腫瘤病人的預(yù)后有密切關(guān)系[5]。

miRNA-34家族由miR-34a,miR-34b and miR-34c組成，并且在不同的物種中具有高度的保守性[6]。最近有報(bào)道m(xù)iR-34a-c是腫瘤抑制因子p53的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，參與p53和Notch信號(hào)通路的調(diào)控，具有腫瘤抑制的特性[7]。已有報(bào)道m(xù)iR-34c在許多不同的惡性腫瘤中低表達(dá)，但是miR-34c在膠質(zhì)瘤臨床標(biāo)本中的表達(dá)情況如何，以及它潛在的可能抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用還不得而知，miR-34c有兩個(gè)成熟的單鏈，miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p[8]。曾有報(bào)道，組織中miRNAs的表達(dá)水平不受甲醛固定石蠟包埋的影響[9,10]，因此，我們?cè)噲D檢測(cè)在人腦膠質(zhì)瘤石蠟標(biāo)本中miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表達(dá)水平。

本實(shí)驗(yàn)采用定量PCR的方法分析了18例甲醛固定石蠟包埋的人腦膠質(zhì)瘤和5例正常腦組織miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表達(dá)，試圖發(fā)現(xiàn)miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p在人腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性程度之間的關(guān)系。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析我們發(fā)現(xiàn)，人腦膠質(zhì)瘤中miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表達(dá)顯著低于正常腦組織(P<0.05)，這說(shuō)明miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p能與人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在其中發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。另外人腦膠質(zhì)瘤Ⅱ～Ⅳ級(jí)中miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表達(dá)存在差異，隨膠質(zhì)瘤級(jí)別的增高組織中miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表達(dá)顯著降低，相關(guān)性統(tǒng)計(jì)表明miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表達(dá)水平與人腦膠質(zhì)瘤的病理級(jí)別顯著相關(guān)，與人腦膠質(zhì)瘤的惡性程度負(fù)相關(guān)。膠質(zhì)瘤發(fā)生時(shí)，miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p的表達(dá)受到抑制，且隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的加大，miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p受抑制程度加大。因此我們推斷miRNA-34c-3p和miRNA-34c-5p可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。

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