王雨晴,吳艷娜,李　欣,尹永強(qiáng),康　毅,婁建石,溫　克

(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，天津　300070)

RISK信號(hào)通路在1-磷酸鞘氨醇后適應(yīng)減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中的作用

王雨晴,吳艷娜,李欣,尹永強(qiáng),康毅,婁建石,溫克

(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，天津300070)

中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào)：R322.11；R329.25；R542.2；R845.22；R977.3

摘要：目的研究再灌注損傷挽救激酶(reperfusion injury salvage kinase，RISK)信號(hào)通路在1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)后適應(yīng)減輕H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中的作用。方法將H9c2細(xì)胞隨機(jī)分為7組，即(1)正常對(duì)照組(C)；(2)缺氧/復(fù)氧組(H/R)；(3)S1P組；(4)S1P+LY294002組(S1P+LY)；(5)LY組；(6)S1P+PD98059組(S1P+PD)；(7)PD組。采用MTT法測(cè)定各組細(xì)胞存活率；比色法測(cè)定丙二醛(MDA)含量、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活力；采用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率；Western blot法測(cè)定Akt和ERK1/2蛋白的磷酸化水平。結(jié)果與H/R組比較，S1P組可明顯增加H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后細(xì)胞存活率及凋亡率，增加T-SOD及Mn-SOD活力，降低MDA含量，降低鈣離子濃度，增加Akt和ERK1/2磷酸化水平，而PI3K/Akt信號(hào)通路阻斷劑LY294002或ERK1/2阻斷劑PD98059可阻斷S1P對(duì)H9c2的上述作用。 結(jié)論S1P能夠減輕H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷, 加入PI3K/Akt抑制劑LY294002和ERK1/2抑制劑PD98059均使S1P 的保護(hù)作用被取消，表明S1P通過(guò)RISK信號(hào)通路發(fā)揮抗H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷作用。

關(guān)鍵詞:S1P；缺氧/復(fù)氧；H9c2細(xì)胞；PI3K/Akt；ERK1/2；RISK

再灌注損傷挽救激酶(reperfusion injury salvage kinase，RISK)信號(hào)通路是抗心肌缺血/再灌注損傷的主要機(jī)制，該信號(hào)通路主要包括促生存激酶磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)，兩者均為絲氨酸/蘇氨酸激酶。很多實(shí)驗(yàn)已表明PI3K和ERK1/2磷酸化參與缺血預(yù)適應(yīng)及藥物介導(dǎo)的抗心肌缺血/再灌注損傷過(guò)程[1-2]。前者激活后能夠促進(jìn)下游靶蛋白內(nèi)皮一氧化氮合酶(endothelial NO synthase，eNOS)、p70S6K、GSK-3β的磷酸化，從而抑制mPTP的開(kāi)放而發(fā)揮保護(hù)作用[3]； ERK1/2信號(hào)通路激活能夠抑制蛋白酶caspase-3的激活，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。兩條信號(hào)通路的激活均能夠抑制促凋亡蛋白Bim、Bax、Bad的表達(dá)，從而使缺血心肌細(xì)胞免于壞死或凋亡[4]。1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)是細(xì)胞神經(jīng)鞘磷脂代謝產(chǎn)物之一[5]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，S1P后適應(yīng)抑制炎癥反應(yīng)、拮抗氧化應(yīng)激、保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)功能，減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷，亦可緩解心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷[6-7]。上述作用是否與RISK通路有關(guān)，需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)擬觀察S1P后適應(yīng)對(duì)RISK通路中關(guān)鍵成分Akt和ERK1/2磷酸化的影響，以及PI3K/Akt抑制劑LY294002、ERK1/2抑制劑PD98059對(duì)S1P后適應(yīng)保護(hù)作用的影響，以明確S1P后適應(yīng)保護(hù)作用與RISK通路的相關(guān)性。

1材料

H9c2 心肌細(xì)胞株(中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)；S1P(批號(hào)：032M4103V)、PI3K/Akt抑制劑(LY294002，LY)(批號(hào)：092M4616V)、ERK1/2抑制劑(PD98059，PD)(批號(hào)：MFCD00671789)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Fura-3/AM(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：20140113)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(北京嘉美生物公司，批號(hào)：4AD271211F)；anti-p-Akt(ser473)(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，批號(hào)：20131210)；anti-Akt(美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：20120319)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔抗體(批號(hào)：970380)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠抗體(批號(hào)：107724)均購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司； Olympus CK2 型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；Model 680 型酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD 公司)；缺氧箱(美國(guó)Billups-rothenberg 公司)；FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD 公司)；FV1000型激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)。

2方法

2.1細(xì)胞分組將培養(yǎng)的大鼠H9c2細(xì)胞隨機(jī)分為7組，即(1)正常(C)組：細(xì)胞在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(2)缺氧/復(fù)氧(H/R)組：細(xì)胞缺氧16 h后換用無(wú)血清的DMEM復(fù)氧培養(yǎng)4 h；(3)S1P組：缺氧處理16 h后，復(fù)氧前加入終濃度為4 μmol·L-1的S1P；(4)S1P+LY294002(S1P+LY)組：在復(fù)氧前加入終濃度為10 μmol·L-1的LY，處理30 min后加入S1P；(5)LY294002(LY)組：復(fù)氧前加入終濃度為10 μmol·L-1的LY；(6)S1P+PD98059(S1P+PD)組：在復(fù)氧前加入終濃度為50 μmol·L-1的PD，處理30 min后加入S1P；(7)PD98059(PD)組：復(fù)氧前加入終濃度為50 μmol·L-1的PD。

2.2模型的建立將H9c2 心肌細(xì)胞用模擬缺氧液置換正常培養(yǎng)液，用95% N2+5% CO2的混合氣于37℃培養(yǎng)箱缺氧培養(yǎng)16 h；再換用含藥DMEM低糖培養(yǎng)基在95% O2+5% CO2的正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)4 h，建立H/R損傷模型。

2.3測(cè)定指標(biāo)

2.3.1細(xì)胞存活率正常組正常培養(yǎng)，其他組細(xì)胞經(jīng)缺氧16 h 以及復(fù)氧4 h處理后，利用MTT法測(cè)定490 nm波長(zhǎng)下每孔光吸收度值(OD 值)，并按下述公式計(jì)算各組細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率/%=(各實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(正常對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)×100 %。

2.3.2MDA 含量、SOD 活性的檢測(cè)造模給藥處理后收集上清液，按MDA、SOD 試劑盒說(shuō)明操作，比色法測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)液MDA 含量及SOD 活性。

2.3.3心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子測(cè)定造模給藥處理后棄培養(yǎng)液，用PBS 沖洗2遍。加入500 μL含5 μmol·L-1Fluo-3 AM的PBS，37℃避光下負(fù)載40 min。PBS洗滌細(xì)胞后，避光孵育20 min。激光共聚焦顯微鏡下測(cè)定各組的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)：488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：525 nm)，用Image Pro Plus軟件處理分析、計(jì)算各組的熒光強(qiáng)度。

2.3.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡百分率經(jīng)處理后消化法收集細(xì)胞，采用Annexin V/PI 雙染法對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，并以Expo32軟件處理分析、計(jì)算凋亡率。

2.3.5心肌細(xì)胞Western blot 檢測(cè)經(jīng)處理后裂解細(xì)胞，BCA 法蛋白定量，將蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，電轉(zhuǎn)膜法將膠中蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉液室溫封閉1 h，分別加入p-Akt、t-Akt、p-ERK 1/2、t- ERK 1/2一抗，4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光液1 min 顯色。經(jīng)顯影、定影后測(cè)定特異性條帶光密度值，并計(jì)算磷酸化蛋白與總蛋白的比值。

3結(jié)果

3.1細(xì)胞存活率H/R組細(xì)胞存活率明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01)。經(jīng)S1P后處理后，S1P組細(xì)胞存活率明顯高于H/R組(P<0.01)。與S1P組相比，加入LY294002 或PD98059以后細(xì)胞存活率明顯降低，且與H/R組相比差異無(wú)顯著性，見(jiàn)Tab 1。

Tab 1Effect of S1P, LY and PD on the viability of H9c2 cells,

GroupCellviability/%MDA/nmol·L-1T-SOD/kU·L-1Mn-SOD/kU·L-1C100±0.000.85±0.09025.74±2.059.79±1.06H/R60.44±3.19**3.86±0.069**10.67±1.44**6.60±0.97**S1P73.13±1.21**##1.57±0.050**##19.46±1.31**##9.24±0.77**##S1P+LY63.41±2.74**▲▲2.94±0.072**▲▲13.60±1.46**▲▲5.01±0.61**▲▲LY53.64±2.69**3.21±0.062**13.49±1.74**4.98±0.69**S1P+PD62.64±4.54**▲▲3.04±0.097**▲▲13.54±2.53**▲▲5.11±0.64**▲▲PD54.40±1.06**3.29±0.081**12.55±1.52**5.05±0.78**

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH/R group;▲▲P<0.01vsS1P group

3.2細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量和SOD含量與正常對(duì)照組相比，H/R組MDA含量明顯升高(P<0.01)，T-SOD、Mn-SOD活力明顯降低(P<0.01)；經(jīng)S1P后處理后，S1P組的MDA含量明顯降低(P<0.01)，T-SOD、Mn-SOD活力明顯提高(P<0.01)；與S1P組相比，加入LY294002或PD98059以后，MDA含量明顯增加(P<0.01)，T-SOD、 Mn-SOD活力明顯降低(P<0.01)，且與H/R組相比差異無(wú)顯著性，見(jiàn)Tab 1。

3.3細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的測(cè)定結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)H/R損傷后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，與正常對(duì)照組相比，差異有顯著性(P<0.01)；經(jīng)過(guò)S1P處理后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度明顯降低，且與H/R組相比，差異有顯著性(P<0.01)；加入LY294002以后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且與S1P組相比，差異有顯著性(P<0.01)。加入PD98059以后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且與S1P組相比，差異有顯著性(P<0.01)，見(jiàn)Tab 2及Fig 1。

Tab 2Effect of S1P, LY and PD on fluorescence intensity of

GroupFluorescenceintensityC0.54±0.033H/R2.77±0.110**S1P0.75±0.043**##S1P+LY1.27±0.038**▲▲LY1.55±0.036**S1P+PD1.27±0.032**▲▲PD1.88±0.023**

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH/R group;▲▲P<0.01vsS1P group

3.4細(xì)胞凋亡率測(cè)定結(jié)果表明，正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡比較少，與正常對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.01)；經(jīng)過(guò)S1P處理后的細(xì)胞凋亡率與H/R組相比明顯下降(P<0.01)；與S1P組相比，加入LY294002以后，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)，加入PD985059以后，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)，見(jiàn)Tab 3及Fig 2。

Tab 3Effect of S1P, LY and PD on the apoptotic rate

GroupApoptosisrate/%C8.53±0.38H/R28.83±1.23**S1P16.80±0.57**##S1P+LY23.46±0.91**▲▲LY28.09±0.65**S1P+PD27.60±0.83**▲▲PD38.00±0.78**

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH/R group;▲▲P<0.01vsS1P group

Fig 1　Effect of S1P, LY and PD on fluorescence intensity of intracellurar Ca2+ of H/R injury H9c2 cells by laser scanning confocal microscope

A: Control group; B: H/R group; C: S1P group; D: S1P+LY group; E: LY group; F: S1P+PD group; G: PD group

Fig 2　Effect of S1P, LY and PD on the apoptotic rate of H9c2 cells after H/R injury(n=3)

A: Control group; B: H/R group; C: S1P group; D: S1P+LY group; E: LY group; F: S1P+PD group; G: PD group

3.5p-Akt、t-Akt和p-ERK1/2、t- ERK1/2的蛋白表達(dá)變化Western blot結(jié)果顯示，各組之間t-Akt蛋白、t-ERK1/2蛋白表達(dá)差異無(wú)顯著性。與正常對(duì)照組相比，H/R處理能使p-Akt蛋白、p-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與H/R組相比，S1P組能明顯增加p-Akt蛋白、p-ERK1/2蛋白表達(dá)(P<0.01)；與S1P組相比，加入LY294002以后，p-Akt蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.01)，加入PD90589以后p-ERK1/2蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.01)，且與正常對(duì)照組相比均無(wú)明顯變化。見(jiàn)Fig 3、4。

Fig 3　Effect of S1P and LY on the expression of

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH/R group;▲▲P<0.01vsS1P group

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH/R group;▲▲P<0.01vsS1P group

4討論

有研究表明，心肌缺血/再灌注損傷涉及多方面因素，如氧自由基生成增多、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、線粒體損傷等[8]。當(dāng)氧自由基的生成超過(guò)了機(jī)體內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的清除能力時(shí)，過(guò)多的氧自由基可引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并刺激線粒體細(xì)胞色素C的釋放，后者可進(jìn)一步激活caspase-9，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。SOD是機(jī)體重要的內(nèi)源性自由基清除劑，主要包括分布于線粒體的Mn-SOD以及分布于胞質(zhì)的Cu/Zn-SOD，其活性的高低可間接反映機(jī)體消除ROS的能力[9]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，測(cè)試MDA的含量不僅可以反映心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)過(guò)氧化程度，而且可間接反映氧自由基水平及氧化應(yīng)激損傷的程度[10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H/R組氧自由基增多，抗氧化能力減弱，細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加，細(xì)胞凋亡率提高；而給予S1P能減輕細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷、提高細(xì)胞的抗氧化能力、減輕細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、抑制細(xì)胞凋亡。

RISK信號(hào)通路主要包括PI3K/Akt及ERK通路。PI3K/Akt通路廣泛存在于細(xì)胞中，是參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。ERK在正常心肌細(xì)胞中低表達(dá)，當(dāng)受到I/R或者H/R的刺激時(shí)，ERK被激活并表達(dá)上調(diào)[11]。近年來(lái)研究顯示，ERK信號(hào)通路在心肌I/R或者H/R中主要是發(fā)揮保護(hù)作用[12]。作為心肌保護(hù)重要的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，很多研究已證實(shí)RISK信號(hào)通路在缺血預(yù)適應(yīng)或后適應(yīng)抗心肌缺血/再灌注損傷中的作用[12]。也有研究報(bào)道，藥理性后適應(yīng)(如七氟醚、阿片受體激動(dòng)劑等)可通過(guò)激動(dòng)PI3K-Akt或ERK1/2發(fā)揮心肌保護(hù)作用[13-14]。然而，離體心臟灌流實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，S1P受體激動(dòng)劑FTY720k可激活A(yù)kt，促進(jìn)LVDP恢復(fù)，但并沒(méi)有緩解心肌損害，減少梗死面積[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，S1P在保護(hù)缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的同時(shí)，亦可提高p-Akt和p-ERK1/2水平，而應(yīng)用LY294002阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路或者PD98059阻斷ERK1/2信號(hào)通路，均可明顯抑制S1P對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率下降，MDA含量增加，細(xì)胞培養(yǎng)液中T-SOD和Mn-SOD的活性降低，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度增加，細(xì)胞凋亡率增加。

綜上所述，S1P對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用與激活RISK信號(hào)通路有關(guān)。關(guān)于S1P對(duì)其通路上下游蛋白的影響，本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行驗(yàn)證，仍需進(jìn)一步的研究。

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網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-1-9 13:37網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.008.html

Role of RISK signal pathway in reducing cardiomyocytes hypoxia/

reoxygenation injury induced by S1P postconditioning

WANG Yu-qing, WU Yan-na, LI Xin, YIN Yong-qiang, KANG Yi, LOU Jian-shi, WEN Ke

(DeptofPharmacology,SchoolofBasicMedicalSciences,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)

Abstract:AimTo study the protective effects of sphingosine 1-phosphate (S1P) postconditioning on rat myocardial cells injured by hypoxia/reoxygenation in reperfusion injury salvage kinase (RISK) signal pathway. MethodsThe cultured rat H9c2 cells were randomly divided into seven groups: (1) control group; (2) hypoxia/reoxygenation (H/R) group; (3) S1P group; (4) S1P+LY294002 group(S1P+LY); (5) LY group; (6) S1P+PD98059 group(S1P+PD); (7) PD group. The viability of H9c2 cells was detected using MTT method. The content of MDA in the cultured medium and the activity of T-SOD and Mn-SOD were measured with colorimetry. The concentration of intracellular free calcium ion was detected by confocal microscopy. The rate of cell apoptosis was determined by flow cytometric analysis. Western blot was used to assess phosphorylation of Akt and ERK1/2 in H9c2 cells. ResultsCompared with the H/R group, S1P significantly increased vaibility of cells, lowered the rate of apoptosis, decreased the content of MDA in the culture medium， increased the activity of T-SOD and Mn-SOD, reduced concentration of intracellular calcium and increased the phosphorylation of Akt and ERK1/2. When added LY294002 or PD98059, the effects of S1P above were inhibited. ConclusionS1P protects H9c2 cells against hypoxia/reoxygenation injury. The protection of S1P was inhibited by LY294002, the inhibitor of PI3K/Akt and PD98059, the inhibitor of ERK1/2. S1P protects H9c2 cells against hypoxia/reoxygenation injury via RISK pathway.

Key words:S1P; hypoxia/reoxygenation; H9c2 cells; PI3K/Akt; ERK1/2; RISK

通訊作者溫克(1974-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)，,E-mail：13820883653@163.com

作者簡(jiǎn)介：王雨晴(1991-)，女，碩士生，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail: zlxxwyq@163.com;

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81173058);國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(No 81102446);天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 10JCZDJC20900)

收稿日期:2014-10-08,修回日期:2014-10-31

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2015)02-0181-05

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.008