重組人可溶性TRAIL的制備及其聯(lián)合硼替佐米誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用*

李雪燕，徐霞△

(廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院，廣東 廣州 510182)

[摘要]目的： 構(gòu)建重組人腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a (+)-TRAIL114-281，優(yōu)化蛋白表達(dá)和純化條件，制備重組人可溶性TRAIL并鑒定其活性。方法: 使用CCK-8初步驗(yàn)證TRAIL是否具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的生物活性；將制備的TRAIL單獨(dú)或聯(lián)合50 nmol/L硼替佐米應(yīng)用于H460細(xì)胞(對TRAIL敏感)和K562細(xì)胞(對TRAIL抵抗)24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，比色法檢測caspase-8、-9、-3的活化程度，Western blot分析細(xì)胞中Bax、Bcl-2和cFLIP蛋白的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測硼替佐米處理H460細(xì)胞和K562細(xì)胞24 h后DR4和DR5的表達(dá)量變化。結(jié)果: 制備了具有生物學(xué)活性且性質(zhì)穩(wěn)定的重組人可溶性TRAIL，且成功誘導(dǎo)H460和K562細(xì)胞凋亡。不同濃度TRAIL處理H460細(xì)胞后其凋亡率隨著TRAIL濃度升高而顯著升高(P<0.05)，但K562細(xì)胞凋亡率并未隨著TRAIL濃度明顯升高。聯(lián)合用藥組的H460和K562細(xì)胞凋亡率均顯著高于單獨(dú)用藥組(P<0.05)，凋亡過程中caspase-8、-9、-3均被活化，藥物處理組的Bcl-2和cFLIP表達(dá)量均比對照組下降，尤其聯(lián)合用藥組表達(dá)量下降最為顯著(P<0.05)，而Bax表達(dá)量無明顯變化。硼替佐米處理H460和K562細(xì)胞后DR4和DR5表達(dá)量均上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論: 硼替佐米能協(xié)同TRAIL啟動(dòng)內(nèi)源性凋亡途徑誘導(dǎo)H460和K562細(xì)胞凋亡，其可能機(jī)制是通過上調(diào)死亡受體DR4和DR5的表達(dá)量、下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和cFLIP的表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞]腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體； 硼替佐米； 細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)]R730.23[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.003

[文章編號(hào)]1000-4718(2015)11-1943-07

[收稿日期]2015-06-02[修回日期] 2015-09-01

[基金項(xiàng)目]*福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2013J01372)；福建醫(yī)科大學(xué)科研項(xiàng)目(No. 2013JY030)

通訊作者△Tel： 0591-22862007; E-mail: zhzheng@fjmu.edu.cn

Preparation of recombinant human soluble TRAIL and its inducing effect on apoptosis of tumor cells by TRAIL combined with bortezomibLI Xue-yan, XU Xia

(KingMedCollegeofLaboratoryMedicine,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,China.E-mail:xuxia503@126.com)

ABSTRACT[]AIM: To construct a prokaryotic expression plasmid to produce recombinant human tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) and to verify the biological activity of TRAIL. METHODS: The prokaryotic expression plasmid pET-28a (+)-TRAIL114-281 was constructed. Human soluble TRAIL was obtained through optimized inducing protein expression and purification conditions. The biological activity of TRAIL was verified by CCK-8 assay. The apoptosis-inducing effect of TRAIL alone and/or in combination with proteasome inhibitor bortezomib (Velcade, PS-341) on the tumor cell lines H460 (TRAIL-sensitive) and K562 (TRAIL-resistance) for 24 h was determined. The apoptotic rates of the cells were analyzed by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining. The activities of caspase-8, -9 and -3 in the cells were detected by colorimetric method. The protein expression of Bax, Bcl-2 and cFLIP was measured by Western blot. The expression of DR4 and DR5 in the H460 cells and K562 cells after treated with bortezomib for 24 h was detected by flow cytometry. RESULTS: The recombinant human soluble TRAIL protein with stable bioactivity was successfully acquired, which induced apoptosis in H460 cells and K562 cells. After treatment with different concentrations of TRAIL, the apoptotic rate of H460 cells was significantly increased with the increase in the concentration of TRAIL (P<0.05), but the apoptotic rate of K562 cells was not affected by the increasing TRAIL concentration. Apoptotic rate in combination group was obviously higher than that in single group (P<0.05). In the process of apoptosis, the activities of caspase-8, -9 and -3 in H460 cells and K562 cells were both increased. The expression of Bcl-2 and cFLIP in treatment groups (especially the combination group) was decreased compared with control group. No significant change of the Bax expression level was observed. The expression of DR4 and DR5 in the H460 cells and K562 cells was significantly up-regulated after treated with bortezomib (P<0.05). CONCLUSION: Bortezomib combined with recombinant human soluble TRAIL synergistically induces apoptosis in tumor cell lines H460 and K562 through initiating intrinsic apoptotic pathways by up-regulating death receptors DR4 and DR5, and reducing the expression of antiapoptotic proteins Bcl-2 and cFLIP.

[KEY WORDS]Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand; Bortezomib; Apoptosis

腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)又稱為凋亡素2配體，是由Wiley等[1]于1995年發(fā)現(xiàn)并克隆出來的腫瘤壞死因子超家族新成員，廣泛表達(dá)于人多種正常組織中。它能選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡而不誘導(dǎo)正常細(xì)胞凋亡[2-3]，有望成為新一代的抗腫瘤藥物。研究發(fā)現(xiàn)不同的腫瘤細(xì)胞對TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性并不相同，例如人非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞H460對TRAIL敏感[4]，而人慢性髓系白血病細(xì)胞K562對TRAIL抵抗[5]。硼替佐米(bortezomib，BTZ)是一種新型蛋白酶體抑制劑，已通過美國食品藥物管理局認(rèn)證，臨床上用于治療淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤[6]。硼替佐米能可逆性地抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中26S蛋白酶體糜蛋白酶樣活性，體外實(shí)驗(yàn)證明它對多種類型的癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。Unterkircher等[7]的研究發(fā)現(xiàn)硼替佐米能協(xié)同TRAIL通過增強(qiáng)tBid的穩(wěn)定性來誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的凋亡。

為進(jìn)一步了解TRAIL及其凋亡機(jī)制，本課題組構(gòu)建重組人TRAIL原核表達(dá)質(zhì)粒，通過蛋白表達(dá)和純化條件的優(yōu)化獲得性質(zhì)穩(wěn)定的可溶性TRAIL蛋白，然后將其與硼替佐米聯(lián)合應(yīng)用，研究對H460和K562細(xì)胞凋亡的影響和Bax、Bcl-2、cFILP蛋白表達(dá)的變化、caspase的活化以及DR4、DR5表達(dá)量的差異，進(jìn)一步探討硼替佐米增強(qiáng)TRAIL抗腫瘤活性及腫瘤細(xì)胞對TRAIL抵抗的機(jī)制。

材料和方法

1主要材料

TRAIL全長cDNA序列由Invitrogen合成；E.coliDH5α、BL21、pET-28α、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460和人慢性髓系白血病細(xì)胞K562均由本實(shí)驗(yàn)室保存；T4 DNA 連接酶購自TaKaRa；限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ和HindⅢ購自NEB；Taq DNA 聚合酶購自天根公司；親和層析試劑盒購自GE Healthcare；DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco；胎牛血清購自四季青公司；硼替佐米購自Ben Venue Laboratories；CCK-8試劑盒購自Dojindo；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自BD；caspase-8、-9、-3活性檢測試劑盒購自BioVision；Bax、Bcl-2、cFLIP、DR4-PE和DR5-PE抗體購自eBioscience；GAPDH 抗體購自Santa Cruz；其余為國產(chǎn)分析純。

2方法

2.1重組人可溶性TRAIL蛋白的制備

2.1.1TRAIL胞外功能區(qū)基因的擴(kuò)增根據(jù)TRAIL基因序列胞外段第114～281位氨基酸序列設(shè)計(jì)上游引物(5’-CGGGA TCC GTG AGA GAA AGA GGT C-3’)和下游引物(5’-CCCAAGCTTCCA GGT CAG TTA GC-3’)，為方便酶切，在上、下游引物中分別引入了BamHⅠ和HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)(其中下劃線部分為保護(hù)性堿基，加粗部分為加入的酶切位點(diǎn))。以TRAIL全長cDNA為模板，用上、下游引物和Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的目的片段記為TRAIL114-281。

2.1.2重組表達(dá)載體的構(gòu)建將回收的目的片段與提取的pET-28a(+)載體質(zhì)粒分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切。再將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-TRAIL114-281轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α，經(jīng)酶切鑒定挑選出陽性轉(zhuǎn)化子送往上海英俊公司測序。

2.1.3重組表達(dá)質(zhì)粒誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)提取經(jīng)測序驗(yàn)證的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑取單克隆菌落接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，搖床上培養(yǎng)過夜。次日取2 mL菌液接種于200 mL的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，于37 ℃培養(yǎng)至A600值分別為0.2、0.6和1.0時(shí)取出54 mL菌液，分裝入6支離心管中，每管9 mL，分成2組，分別加入終濃度為0.2 mmol/L、0.6 mmol/L、1.0 mmol/L的IPTG，分別在37 ℃和25 ℃下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。然后在4 h、8 h和24 h 3個(gè)時(shí)點(diǎn)分別從以上6管中取出3 mL菌液，離心后用PBS重懸，用超聲波細(xì)胞粉碎儀破碎細(xì)菌獲得裂解產(chǎn)物，離心后獲得上清和沉淀，分別進(jìn)行SDS-PAGE。

2.1.4可溶性TRAIL的表達(dá)按上述方法選擇最佳菌體密度、誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間后，確定最佳條件，并在加IPTG誘導(dǎo)的同時(shí)加入1 mmol/L ZnSO4，優(yōu)化條件制備重組人可溶性TRAIL蛋白。

2.1.5可溶性TRAIL的純化按上述方法將收獲的菌液離心獲得菌體，重懸于適量緩沖液(含10%甘油、0.5 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L DTT和1 mmol/L PMSF)中，冰浴下超聲裂解細(xì)菌，4 ℃離心收獲上清。使用Ni+親和層析試劑盒純化帶有六聚His標(biāo)簽的重組TRAIL蛋白，按照試劑盒說明書進(jìn)行。將最后收集的蛋白液裝入預(yù)處理過的透析袋內(nèi)，置于1 L PBS緩沖液中4 ℃透析，每隔4～6 h換 1 次PBS緩沖液，收集透析袋內(nèi)液體即為純化后的TRAIL蛋白，-20 ℃保存。

2.2可溶性TRAIL聯(lián)合硼替佐米的研究

2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)H460細(xì)胞和K562細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清、1×105U/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素的DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)基中。細(xì)胞每2～3 d傳代1次。

2.2.2CCK-8法檢測細(xì)胞活性取對數(shù)生長期的H460細(xì)胞和K562細(xì)胞，將濃度調(diào)整為約2×107/L，分別接種于96孔板中，溫箱中培養(yǎng)過夜(37 ℃、5% CO2)。次日分別加入不同濃度的TRAIL,使其終濃度為0、50、100、200、400和800 μg/L，溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。向每孔中加入10 μL CCK-8溶液輕輕振蕩96孔板，溫箱中放置1 h。用酶標(biāo)儀測定450 nm波長的A值。細(xì)胞活性的計(jì)算公式為：細(xì)胞活性(%)=(A450藥物組-A450空白組)/(A450陰性對照組-A450空白組)×100% 。

參考文獻(xiàn)2.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率[8]檢測細(xì)胞凋亡率。將H460細(xì)胞和K562細(xì)胞濃度調(diào)整為約2×108/L，分別接種于6孔板中，次日加入不同濃度TRAIL；此外，選擇50 nmol/L 硼替佐米、200 μg/L TRAIL聯(lián)合50 nmol/L 硼替佐米作用于H460和K562細(xì)胞，溫箱中培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞重懸于凋亡試劑盒的1×binding buffer中。吸取100 μL細(xì)胞懸液(約1×105細(xì)胞)至5 mL的流式管中。分別向各管中加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI。輕輕渦旋，室溫避光放置15 min。每管中加入400 μL 1×binding buffer，1 h內(nèi)上機(jī)檢測各組凋亡率。

參考文獻(xiàn)2.2.4Caspase-8、-9、-3活性的檢測[9]檢測凋亡細(xì)胞的caspase活性。收集經(jīng)過處理的細(xì)胞分別檢測其caspase-8、-9、-3活性，按試劑盒的說明書操作，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長的A值。通過計(jì)算(A450實(shí)驗(yàn)組-A450空白組)/(A450陰性對照組-A450空白組)來確定凋亡誘導(dǎo)劑組caspase-8、-9、-3的活化程度。

參考文獻(xiàn)2.2.5Western blot分析[10]檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。收集藥物處理后的細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌 2次，加入裂解液冰上放置45 min，冰浴下超聲裂解，與電泳的loading buffer混勻100 ℃下加熱3 min。上樣，SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，與相應(yīng)的Ⅰ抗和HRP標(biāo)記的 II 抗孵育。使用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測抗原抗體復(fù)合物。Western blot中使用的抗體有Bax、Bcl-2、cFLIP和GAPDH。Image-Pro Plus 6.0軟件分析積分吸光度。

2.2.6DR4和DR5的檢測H460和K562細(xì)胞接種后，次日加入50 nmol/L硼替佐米于溫箱中培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，重懸于500 μL PBS中。加入5 μL的DR4-PE或DR5-PE抗體，冰上避光放置45 min。PBS洗滌去除未結(jié)合抗體，再用500 μL PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測DR4或DR5的熒光值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組樣本之間采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1TRAIL蛋白的制備

1.1TRAIL基因的擴(kuò)增和重組表達(dá)載體的構(gòu)建PCR擴(kuò)增目的基因后行2%瓊脂糖凝膠電泳，在DNA marker的500 bp附近有1條清晰的擴(kuò)增條帶，與TRAIL114-281預(yù)期目的片段524 bp大小一致。連接酶連接后的重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)酶切后，電泳分析可見切下pET-28a(+)載體片段5 344 bp和約500 bp的TRAIL114-281目的基因片段，證實(shí)PCR擴(kuò)增了目的片段TRAIL114-281并正確插入載體中，見圖1。

Figure 1.Amplification ofTRAIL114-281gene and restrictive enzyme digestion of recombinant pET-28a(+)-TRAIL114-281analyzed by agarose gel electrophoresis. 1: marker; 2: PCR product ofTRAIL114-281gene; 3: marker; 4: pET-28a(+)-TRAIL114-281/BamHⅠ+HindⅢ; 5: marker.

圖1TRAIL114-281基因擴(kuò)增和重組質(zhì)粒pET-28a(+)-TRAIL114-281酶切后的瓊脂糖凝膠電泳分析

1.2重組表達(dá)質(zhì)粒的優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-TRAIL114-281轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后于37 ℃誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，同時(shí)以沒有插入TRAIL114-281基因的BL21-pET-28a(+)作為陰性對照，SDS-PAGE分析結(jié)果如圖2所示，圖2A中在分子量約為24 kD處有 一清晰的條帶而對照組無條帶，與預(yù)期的TRAIL蛋白分子量相符合，說明37 ℃條件下誘導(dǎo)有目的蛋白的表達(dá)且產(chǎn)量非常高。圖2B可看出在37 ℃時(shí)誘導(dǎo)的目的蛋白均以包涵體的形式出現(xiàn)于沉淀中，而上清中沒有可溶性目的蛋白的表達(dá)。但在25 ℃誘導(dǎo)蛋白表達(dá)時(shí)，TRAIL蛋白以包涵體和可溶性2種形式出現(xiàn)(圖2C)。由于包涵體不具有生物學(xué)活性而蛋白復(fù)性過程較復(fù)雜且效率非常低，不利于深入研究TRAIL的凋亡誘導(dǎo)功能，故選擇25 ℃為適宜溫度來誘導(dǎo)可溶性蛋白表達(dá)從而進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能。用Quantity One軟件掃描分析上清中各泳道的蛋白相對表達(dá)量。綜合各方面因素，選擇25 ℃、A600=0.6、IPTG 0.6 mmol/L、ZnSO41 mmol/L誘導(dǎo)24 h為制備重組人可溶性TRAIL的最佳條件，見圖3。

Figure 2.The protein expression in theE.coliunder different conditions analyzed by SDS-PAGE. A: the protein expression. M: marker; 1: precipitate of BL21-pET-28a(+)(control); 2: precipitate of BL21-pET-28a(+)-TRAIL114-281. B: SDS-PAGE analysis of expressed protein induced at 37 ℃. M: marker; 1: the supernatant of BL21-pET-28a(+)-TRAIL114-281; 2: the precipitate of BL21-pET-28a(+)-TRAIL114-281; 3: supernatant of BL21-pET-28a(+); 4: the precipitate of BL21-pET-28a(+). C: SDS-PAGE analysis of expressed protein induced at 25℃. M: marker; 1: the precipitate of BL21-pET-28a(+); 2: the supernatant of BL21-pET-28a(+); 3: the precipitate of BL21-pET-28a(+)-TRAIL114-281; 4: the supernatant of BL21-pET-28a(+)-TRAIL114-281.

圖2SDS-PAGE分析不同條件下對蛋白表達(dá)的影響

Figure 3.Identification of recombinant TRAIL114-281protein. 1～3: recombinant pET-28a(+)-TRAIL114-281induced by 1.0 mmol/L IPTG for 24 h, 8 h and 4 h; 4～6: recombinant pET-28a(+)-TRAIL114-281induced by 0.6 mmol/L IPTG for 24 h, 8 h and 4 h; 7～9: recombinant pET-28a(+)-TRAIL114-281induced by 0.2 mmol/L IPTG for 24 h, 8 h and 4 h.

圖325 ℃下A600值分別為0.2、0.6和1.0時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)包涵體和上清可溶性蛋白的比較

1.3可溶性TRAIL的純化親和層析法純化后結(jié)果如圖4所示，泳道1為純化前的重組蛋白樣品，泳道2為蛋白樣品上柱后濾出的部分，從泳道1和泳道2 的比較中，可發(fā)現(xiàn)泳道2在24 kD處無條帶，這說明目的蛋白已經(jīng)成功結(jié)合層析柱上，經(jīng)過一系列漂洗，最后泳道8中只在24 kD處有單一條帶，無其它雜條帶，說明成功純化了重組人可溶性TRAIL蛋白。

Figure 4.Ni+affinity chromatography analysis of recombinant TRAIL114-281protein. M: protein marker; 1: sample before added to the column; 2: flow-through fraction after added to the collumn; 3～8: flow-through fraction after eluted by 20, 40, 60, 80, 100 and 500 mmol/L iminazole, respectively.

圖4親和層析法純化TRAIL蛋白的SDS-PAGE分析

2可溶性TRAIL聯(lián)合硼替佐米誘導(dǎo)凋亡

2.1細(xì)胞活性檢測將制備好的重組人可溶性TRAIL以終濃度為0、50、100、200、400和800 μg/L分別作用于H460和K562細(xì)胞24 h，CCK-8檢測各組細(xì)胞活性。從圖5中可看出隨著TRAIL濃度逐漸上升，H460細(xì)胞和K562細(xì)胞的活性均逐漸下降，相同TRAIL濃度下K562細(xì)胞的活力比H460細(xì)胞強(qiáng)。這說明K562細(xì)胞對TRAIL的敏感性不如H460細(xì)胞高，TRAIL對H460細(xì)胞生長的抑制作用比K562細(xì)胞強(qiáng)。

Figure 5.The viability of H460 cells and K562 cells treated with TRAIL for 24 h determined by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.

圖5CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測TRAIL處理H460和K562 細(xì)胞24 h后的細(xì)胞活性

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡率細(xì)胞接種后，分別加入不同濃度TRAIL(0、50、100、200、400和800 μg/L)、50 nmol/L 硼替佐米和200 μg/L TRAIL聯(lián)合50 nmol/L 硼替佐米作用于細(xì)胞24 h。Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測各組凋亡率結(jié)果顯示：H460細(xì)胞的凋亡率具有TRAIL濃度依賴性，隨著TRAIL濃度升高凋亡率也逐漸升高。不同濃度TRAIL處理后K562細(xì)胞的凋亡率均比H460細(xì)胞低，且凋亡率并未隨TRAIL濃度升高而明顯升高，這與K562細(xì)胞對TRAIL不敏感的報(bào)道相符。并且TRAIL聯(lián)合硼替佐米用藥后H460和K562細(xì)胞的凋亡率顯著升高，見圖6。此外，圖7顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)H460細(xì)胞和K562各藥物處理組的細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生改變，細(xì)胞皺縮體積變小，與相鄰細(xì)胞分離，甚至貼壁生長的H460細(xì)胞脫離瓶壁懸浮，尤其聯(lián)合用藥組的細(xì)胞形態(tài)改變最明顯，而對照組細(xì)胞體積大小均一，緊密生長，狀態(tài)良好。由細(xì)胞凋亡率和鏡下形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明制備的重組人可溶性TRAIL確實(shí)具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的生物活性，同時(shí)，TRAIL聯(lián)合硼替佐米誘導(dǎo)H460細(xì)胞和K562細(xì)胞凋亡具有協(xié)同作用。

2.3Caspase活化程度的比較H460和K562細(xì)胞經(jīng)不同處理后，比色法檢測各組caspase-8、-9、-3的活化倍數(shù)(陰性對照組的活性程度為1)，結(jié)果如圖8所示。TRAIL應(yīng)用于H460和K562細(xì)胞后caspase-9的活性分別為1.50±0.25和1.47±0.26，而聯(lián)合用藥后的caspase-9活性分別為2.36±0.20和2.38±0.70。此外聯(lián)合用藥組caspase-8和caspase-3的活性也比單獨(dú)用藥組高。這說明聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用，同時(shí)也進(jìn)一步證明了制備的重組人可溶性TRAIL具有生物學(xué)活性。Caspase-9的活化也說明了TRAIL誘導(dǎo)H460和K562細(xì)胞凋亡啟動(dòng)了內(nèi)源性凋亡途徑。

2.4Western blot分析凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2和cFLIP的蛋白表達(dá)使用ImageJ 2x 軟件分析各蛋白條帶的積分吸光度值并做比較。從圖9中可看出藥物處理組的Bcl-2和cFLIP表達(dá)量均比對照組減少，且聯(lián)合用藥組的表達(dá)量最少，此過程中Bax的表達(dá)量無明顯變化，說明TRAIL和硼替佐米引起H460細(xì)胞和K562細(xì)胞凋亡都可通過減少抗凋亡蛋白Bcl-2和cFLIP表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)，同時(shí)硼替佐米能協(xié)同TRAIL誘導(dǎo)H460細(xì)胞和K562細(xì)胞凋亡。

2.5DR4和DR5的檢測結(jié)果顯示硼替佐米處理24 h后，H460和K562細(xì)胞膜上的DR4、DR5表達(dá)量均上調(diào)。由此看出，50 nmol/L硼替佐米處理H460和K562細(xì)胞后均可使DR4和DR5表達(dá)量上調(diào)來增

Figure 6.Apoptotic rates of the cells with different treatments analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs200 μg/L TRAIL.

圖6流式細(xì)胞術(shù)檢測H460 細(xì)胞和K562細(xì)胞的凋亡率

強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡。數(shù)據(jù)也顯示K562細(xì)胞的DR4和DR5表達(dá)量均比H460細(xì)胞低，這表明K562細(xì)胞對TRAIL誘導(dǎo)的凋亡不敏感的原因之一可能是DR4和DR5表達(dá)量較低。與此同時(shí)，從數(shù)據(jù)中看出無論是H460細(xì)胞還是K562細(xì)胞在藥物處理前后，DR5的表達(dá)量均明顯高于DR4，這說明在凋亡發(fā)生過程中DR5發(fā)揮了更重要的作用，見圖10、表1。

Figure 7.The morphological changes of the cells treated with TRAIL in the presence or absence of bortezomib (×400).

圖7TRAIL聯(lián)合硼替佐米對細(xì)胞形態(tài)的影響

Figure 8.The activities of caspase-8, -9 and -3 in the H460 cells and K562 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs200 μg/L TRAIL.

圖8H460和K562細(xì)胞caspase-8、-9、-3的活化程度

討論

凋亡也稱作細(xì)胞程序性死亡，是一種不同于壞死的細(xì)胞自主性死亡，它與細(xì)胞分裂、胚胎發(fā)育、免疫反應(yīng)等密切相關(guān)。細(xì)胞凋亡作用可以清除體內(nèi)突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞以保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。本課題主要研究重組人可溶性TRAIL誘導(dǎo)H460和K562細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象，以及探討其聯(lián)合硼替佐米應(yīng)用后的凋亡機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)中至關(guān)重要的一點(diǎn)就是獲得具有生物活性的TRAIL蛋白，預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)蛋白表達(dá)階段即使不加入ZnSO4,只需在25 ℃下即可有可溶性TRAIL表達(dá)，但獲得的TRAIL蛋白極其不穩(wěn)定，在純化后4 ℃透析時(shí)可見大量蛋白變性形成沉淀，使得最終的蛋白獲得率極低。有文獻(xiàn)表明Zn2+在TRAIL維持其穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)和發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡的功能中具有極其重要的作用[11]。隨后在加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的同時(shí)加入1 mmol/L ZnSO4[11-12]，促使TRAIL蛋白表達(dá)時(shí)可邊折疊邊螯合Zn2+形成穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。這也論證了Zn2+是TRAIL維持其穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)和發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)所必須的。

獲得TRAIL蛋白后首先使用CCK-8法檢測細(xì)胞活性大致判斷制備的TRAIL蛋白是否具有活性、能否進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示H460細(xì)胞的活性隨著TRAIL濃度的升高而逐漸降低，說明TRAIL對H460細(xì)胞的生長具有抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)不同濃度TRAIL作用于H460細(xì)胞時(shí)，凋亡率隨著TRAIL濃度升高而升高，但K562細(xì)胞卻并不具有這種現(xiàn)象，凋亡率不隨著TRAIL濃度的升高而明顯升高。在聯(lián)合硼替佐米應(yīng)用后，H460細(xì)胞和K562細(xì)胞的凋亡率均比單獨(dú)用藥時(shí)明顯升高，這說明硼替佐米能協(xié)同TRAIL誘導(dǎo)H460和K562細(xì)胞凋亡。

Figure 9.The expression of Bax, Bcl-2 and cFLIP in H460 cells and K562 cells with different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs200 μg/L TRAIL.

圖9Western blot分析Bax、Bcl-2 和cFLIP 在H460和K562細(xì)胞中的表達(dá)

Figure 10.The changes of death receptor expression in H460 cells and K562 cells.

圖10H460細(xì)胞和K562細(xì)胞死亡受體的表達(dá)量

表1　硼替佐米處理H460細(xì)胞和K562細(xì)胞后死亡受體的表達(dá)量比較

*P<0.05vscontrol.

Caspase是一類蛋白酶家族，與真核細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。正常細(xì)胞內(nèi)的caspase都以無活性的酶原形式存在，當(dāng)上游的起始caspase被外來信號(hào)激活后進(jìn)一步切割激活下游的caspase，從而導(dǎo)致目的蛋白水解,最終引起細(xì)胞凋亡。本研究中藥物處理H460和K562細(xì)胞后各組caspase-8、-9、-3均被活化?；罨腸aspase-9是內(nèi)源性凋亡途徑的產(chǎn)物，caspase-9的活化說明了TRAIL誘導(dǎo)H460、K562凋亡啟動(dòng)了內(nèi)源性凋亡途徑進(jìn)行調(diào)控。Caspase-3是凋亡執(zhí)行蛋白，它的活化意味著凋亡效應(yīng)的發(fā)生，這進(jìn)一步證實(shí)了制備的重組人可溶性TRAIL具有誘導(dǎo)凋亡的生物學(xué)活性。

經(jīng)過上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TRAIL蛋白具有活性，進(jìn)一步對其凋亡機(jī)制深入研究。Bcl-2家族是研究凋亡分子機(jī)制的重要靶分子，其成員包括促凋亡因子Bax、Bak等和抗凋亡因子Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL等，細(xì)胞的凋亡或存活效應(yīng)是受促凋亡因子和抗凋亡因子相互嚴(yán)密調(diào)控的。本實(shí)驗(yàn)中可見TRAIL誘導(dǎo)凋亡后Bcl-2和cFLIP蛋白表達(dá)量比對照組下降，尤以聯(lián)合用藥組最為明顯，說明硼替佐米能協(xié)同TRAIL減少抗凋亡因子Bcl-2和cFLIP的蛋白表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)凋亡效應(yīng)。

硼替佐米處理H460和K562細(xì)胞后DR4和DR5的含量均上調(diào)，且TRAIL聯(lián)合硼替佐米后細(xì)胞凋亡率均升高，說明硼替佐米能上調(diào)DR4和DR5含量來協(xié)同TRAIL誘導(dǎo)H460和K562細(xì)胞凋亡。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出K562細(xì)胞的凋亡率沒有H460細(xì)胞的凋亡率高，K562細(xì)胞的DR4和DR5含量也沒有H460高。同時(shí)H460和K562細(xì)胞的DR5含量均明顯高于DR4，這說明TRAIL誘導(dǎo)凋亡中DR5發(fā)揮著更重要的作用。近來的研究報(bào)道TRAIL受體缺乏的小鼠具有自發(fā)形成腫瘤和自身免疫性疾病的趨勢[13]。這些給我們一個(gè)提示，K562細(xì)胞對TRAIL不敏感的原因之一就是其細(xì)胞膜上的DR4和DR5含量較低，想要逆轉(zhuǎn)K562對TRAIL的抵抗性我們可以著重于提高DR4和DR5尤其是DR5的表達(dá)量。

綜上所述，通過條件優(yōu)化成功制備了具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡活性，且性質(zhì)穩(wěn)定的重組人可溶性TRAIL蛋白。TRAIL誘導(dǎo)H460細(xì)胞凋亡具有濃度依賴性，凋亡率隨著TRAIL濃度升高而升高，但K562細(xì)胞凋亡率卻并不隨著TRAIL濃度的升高而明顯升高。Caspase-9的活化(尤其是聯(lián)合用藥組)說明了TRAIL聯(lián)合硼替佐米誘導(dǎo)H460細(xì)胞和K562細(xì)胞凋亡啟動(dòng)了內(nèi)源性凋亡途徑。硼替佐米能協(xié)同TRAIL誘導(dǎo)H460和K562細(xì)胞凋亡，其可能機(jī)制是通過上調(diào)死亡受體DR4和DR5的表達(dá)量、下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和cFLIP的表達(dá)量來實(shí)現(xiàn)的。TRAIL聯(lián)合硼替佐米應(yīng)用于各種腫瘤細(xì)胞是近幾年來研究凋亡現(xiàn)象的熱點(diǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道[14]，硼替佐米能增強(qiáng)caspase-8、-9、-3的活性和上調(diào)DR5來協(xié)同TRAIL誘導(dǎo)HNSCC090(對TRAIL抵抗的頭頸部鱗癌細(xì)胞)細(xì)胞凋亡，此結(jié)果與本研究一致。另有報(bào)道[15 ]稱硼替佐米在增強(qiáng)腦膜瘤細(xì)胞對TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性研究中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)DR4和DR5表達(dá)量能促進(jìn)凋亡，而cFLIP表達(dá)下降并不能促進(jìn)腦膜瘤細(xì)胞凋亡?？梢奵FLIP在不同腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮不一樣的作用，原因可能是腫瘤細(xì)胞類型不同其凋亡機(jī)制不同造成的。凋亡是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，受眾多因子嚴(yán)密調(diào)控，因此其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究討論。

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(責(zé)任編輯： 盧萍， 羅森)